JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Genereren en co-cultureren van primaire microglia en corticale neuronen van muizen

Published: July 26, 2024
doi:
10.3791/67078
, ,
1Department of Biochemistry, Microbiology & Immunology,University of Saskatchewan

Summary

Dit protocol beschrijft een microglia-neuronale co-cultuur die is opgezet uit primaire neuronale cellen geïsoleerd uit muizenembryo’s op embryonale dagen 15-16 en primaire microglia gegenereerd uit de hersenen van neonatale muizen op postnatale dagen 1-2.

Abstract

Microglia zijn in weefsel levende macrofagen van het centrale zenuwstelsel (CZS), die tal van functies uitvoeren die de neuronale gezondheid en CZS-homeostase ondersteunen. Ze vormen een belangrijke populatie van immuuncellen die geassocieerd zijn met de ziekteactiviteit van het CZS en nemen reactieve fenotypes aan die mogelijk bijdragen aan neuronaal letsel tijdens chronische neurodegeneratieve ziekten zoals multiple sclerose (MS). De verschillende mechanismen waarmee microglia de neuronale functie en overleving tijdens gezondheid en ziekte reguleren, blijven beperkt vanwege uitdagingen bij het oplossen van de complexe in vivo interacties tussen microglia, neuronen en andere CZS-omgevingsfactoren. De in vitro benadering van het gelijktijdig kweken van microglia en neuronen blijft dus een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van microglia-neuronale interacties. Hier presenteren we een protocol om primaire microglia en neuronen van muizen te genereren en samen te kweken. In het bijzonder werden microglia na 9-10 dagen in vitro geïsoleerd uit een gemengde gliacultuur die was vastgesteld op basis van hersenhomogenaten afkomstig van neonatale muizen tussen postnatale dagen 0-2. Neuronale cellen werden geïsoleerd uit hersenschors van muizenembryo’s tussen embryonale dagen 16-18. Na 4-5 dagen in vitro werden neuronale cellen gezaaid in platen met 96 putjes, gevolgd door de toevoeging van microglia om de co-cultuur te vormen. Zorgvuldige timing is van cruciaal belang voor dit protocol, aangezien beide celtypen experimentele rijpheid moeten bereiken om de co-cultuur tot stand te brengen. Over het algemeen kan deze co-cultuur nuttig zijn voor het bestuderen van interacties tussen microglia en neuronen en kan het meerdere uitlezingen bieden, waaronder immunofluorescentiemicroscopie, live beeldvorming en RNA- en eiwittests.

Introduction

Microglia zijn in het weefsel levende macrofagen die immunosurveillance en homeostase in het centrale zenuwstelsel (CZS) vergemakkelijken1,2,3. Ze zijn afkomstig van erytromyeloïde voorlopercellen van de dooierzak die de hersenen koloniseren tijdens de embryonale ontwikkeling 4,5,6 en worden gedurende de hele levensduur van het organisme in stand gehouden door zelfvernieuwing, wat proliferatie en apoptose met zich meebrengt7. In steady-state hebben rustende microglia een vertakte morfologie en houden ze zich bezig met weefselbewaking 8,9,10.

Microglia brengen talrijke receptoren op het celoppervlak tot expressie, waardoor ze snel kunnen reageren op veranderingen in het CZS11,12 en ontstekingsreacties kunnen bevorderen in geval van infecties of weefselbeschadiging 12,13,14, evenals tijdens neurodegeneratieve ziekten 9,15, zoals multiple sclerose (MS)16,17. Microglia brengen ook receptoren tot expressie voor verschillende neurotransmitters en neuropeptiden 18,19,20, wat suggereert dat ze ook kunnen reageren op neuronale activiteit en deze kunnen reguleren 21,22. Microglia en neuronen interageren inderdaad in verschillende vormen van bidirectionele communicatie 8,23, zoals directe interacties gemedieerd door membraaneiwitten of indirecte interacties via oplosbare factoren of tussenliggende cellen23,24.

Verschillende neurotransmitters die door neuronen worden uitgescheiden, kunnen bijvoorbeeld de neuroprotectieve of inflammatoire activiteit van microglia moduleren 25,26,27. Bovendien helpen directe interacties tussen neuronen en microglia om microglia in een homeostatische toestand te houden28. Omgekeerd kunnen directe interacties van microglia met neuronen neuronale circuits vormen29 en neuronale signalering beïnvloeden 30,31,32. Aangezien verstoringen van deze interacties hyperexcitabiliteit van neuronenveroorzaken 30 en microglia-reactiviteit33,34, worden ontregelde microglia-neuronale interacties geïmpliceerd als een bijdragende factor aan neurologische aandoeningen33,35. Er is inderdaad beschreven dat psychotische23,26 en neurodegeneratieve ziekten disfunctionele microglia-neuronale interacties vertonen33. Hoewel deze observaties het belang van microglia-neuronale communicatie in het CZS benadrukken, zijn specifieke mechanismen van hoe deze interacties microgliale en neuronale functies in gezondheid en ziekte reguleren relatief onbekend.

Binnen een complex milieu zoals het CZS kunnen meerdere omgevingsfactoren microglia-neuronale interacties beïnvloeden, wat het vermogen beperkt om voorbijgaande cellulaire interacties in vivo te bestuderen. Hier presenteren we een in vitro microglia-neuronaal co-cultuursysteem dat kan worden gebruikt om directe cellulaire interacties tussen microglia en neuronen te bestuderen. Dit protocol beschrijft de generatie van primaire microglia en neuronen uit de cortex van neonatale muizen tussen respectievelijk postnatale dagen 0-2 en embryonale muizen dag 16-18. Neuronen en microglia worden vervolgens samen gekweekt in platen met 96 putjes voor stroomafwaartse high-throughput-experimenten. We hebben deze benadering eerder gebruikt om aan te tonen dat microglia-fagocytose neuronen beschermt tegen geoxideerde fosfatidylcholine-gemedieerde celdood37, wat suggereert dat deze methode kan helpen om de rol van microglia in de context van neurodegeneratie en MS te begrijpen. Evenzo kunnen microglia-neuronale co-culturen ook nuttig zijn voor het onderzoeken van de impact van microglia-neuronale overspraak in andere contexten, zoals virale infecties38 of neuronaal letsel en herstel39. Over het algemeen stellen in vitro microglia-neuronale co-cultuursystemen onderzoekers in staat om microglia-neuronale interacties te bestuderen in een manipuleerbare en gecontroleerde omgeving, die een aanvulling vormt op in vivo modellen.

Protocol

Alle dieren die in dit onderzoek werden gebruikt, werden gehuisvest en behandeld met goedkeuring van de University Animal Care Committee (UACC) van de University of Saskatchewan en de Canadian Council on Animal Care (CCAC). Voor dit onderzoek werden postnatale dagen 0-2 CD1 mannelijke en vrouwelijke muizen en embryonale dagen 16-18 (E16-18) embryo’s van zwangere CD1-muizen gebruikt. De details van de reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel. <stron…

Representative Results

Een stroomdiagram met de belangrijkste stappen van de gemengde gliacultuur voor microglia is weergegeven in figuur 1A. Over het algemeen worden dunne cellen en overmatig cellulair afval verwacht op dag 1 (Figuur 1B). Tegen dag 4 moet een verhoogd aantal cellen worden waargenomen, vooral bij het genereren van aanhangende astrocyten, zoals aangegeven door hun langwerpige morfologie (Figuur 1C). Een paar microglia kunnen worden waargen…

Discussion

Dit artikel beschrijft een protocol voor het isoleren en cultiveren van primaire neuronen en primaire microglia van muizen, die vervolgens worden gebruikt om een microglia-neuronale co-cultuur tot stand te brengen die kan worden gebruikt om te bestuderen hoe microglia- en neuroninteracties hun cellulaire gezondheid en functie reguleren. Deze relatief eenvoudige en toegankelijke benadering kan kritische inzichten verschaffen in de mechanismen en functionele resultaten van interacties tussen microglia-neuronen in het CZS.<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JP erkent financiële steun van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada en het University of Saskatchewan College of Medicine. YD erkent financiële steun van het University of Saskatchewan College of Medicine Startup Fund, de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2023-03659), MS Canada Catalyst Grant (1019973), Saskatchewan Health Research Foundation Establishment Grant (6368) en Brain Canada Foundation Future Leaders in Canadian Brain Research Grant. Figuur 1A, Figuur 2A en Figuur 3A zijn gemaakt met BioRender.com.

Materials

10 cm Petri dish  Fisher  07-202-011 Sterile
1x Versene Gibco 15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System  Gibco  A3653401
Dissection microscope VWR
DNase I Roche 11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11960-044
Fetal Bovine Serum  ThermoFisher Sci 12483-020
HBSS (10x) Gibco 14065-056
Hemacytometer Hausser Scientific 1475
HEPES  ThermoFisher Sci 15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x) Fisher Scientific  21083027
Macrophage colony stimulating factor  Peprotech 315-02
Micro-Forceps RWD F11020-11 Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acids Cytiva SH3023801
PBS (10x) ThermoFisher Sci AM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x) Gibco 103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide  Sigma P3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
Spring scissors RWD S11008-42 Autoclaved/Sterile
Surgical blade Feather 08-916-5D Sterile
T-25 flasks Fisher 10-126-9
T-75 flasks  Fisher 13-680-65
Tissue forceps Codman 30-4218 Autoclaved/Sterile
Tissue scissors RWD S12052-10 Autoclaved/Sterile
Trypan Blue  Thermofisher Sci  15250-061
Trypsin (2.5%) ThermoFisher Sci 15090046
Widefield Immunofluorescence Microscope Zeiss
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. J Immunol Res. 2017, 1-12 (2017).
  2. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  3. Ginhoux, F., Prinz, M. Origin of microglia: Current concepts and past controversies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (8), a020537 (2015).
  4. Dermitzakis, I., et al. Origin and emergence of microglia in the CNS-an interesting (hi)story of an eccentric cell. Curr Issues Mol Biol. 45 (3), 2609-2628 (2023).
  5. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  6. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  7. Askew, K., et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 18 (2), 391-405 (2017).
  8. Vidal-Itriago, A., et al. Microglia morphophysiological diversity and its implications for the CNS. Front Immunol. 13, 997786 (2022).
  9. Wendimu, M. Y., Hooks, S. B. Microglia phenotypes in aging and neurodegenerative diseases. Cells. 11 (13), 2091 (2022).
  10. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  11. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  12. Zhao, J. F., et al. Research progress on the role of microglia membrane proteins or receptors in neuroinflammation and degeneration. Front Cell Neurosci. 16, 831977 (2022).
  13. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The role of microglia in central nervous system immunity and glioma immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
  14. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198 (2020).
  15. Doens, D., Fernández, P. L. Microglia receptors and their implications in the response to amyloid β for Alzheimer’s disease pathogenesis. J Neuroinflammation. 11 (1), 48 (2014).
  16. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  17. Fischer, M. T., et al. NADPH oxidase expression in active multiple sclerosis lesions in relation to oxidative tissue damage and mitochondrial injury. Brain. 135 (3), 886-899 (2012).
  18. Marinelli, S., Basilico, B., Marrone, M. C., Ragozzino, D. Microglia-neuron crosstalk: Signaling mechanism and control of synaptic transmission. Semin Cell Dev Biol. 94, 138-151 (2019).
  19. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  20. Carniglia, L., et al. Neuropeptides and microglial activation in inflammation, pain, and neurodegenerative diseases. Mediators Inflamm. 2017, 5048616 (2017).
  21. Zhao, S., Umpierre, A. D., Wu, L. J. Tuning neural circuits and behaviors by microglia in the adult brain. Trends Neurosci. 47 (3), 181-194 (2024).
  22. Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: New roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
  23. Haidar, M. A., et al. Crosstalk between microglia and neurons in neurotrauma: An overview of the underlying mechanisms. Curr Neuropharmacol. 20 (11), 2050-2065 (2022).
  24. Cserép, C., Pósfai, B., Dénes, &. #. 1. 9. 3. ;. Shaping neuronal fate: Functional heterogeneity of direct microglia-neuron interactions. Neuron. 109 (2), 222-240 (2021).
  25. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  26. Eyo, U. B., Wu, L. J. Bidirectional microglia-neuron communication in the healthy brain. Neural Plast. 2013, 456857 (2013).
  27. Strosznajder, J. B., Czapski, G. A. Glutamate and GABA in microglia-neuron cross-talk in Alzheimer’s disease. Int J Mol Sci. 22 (21), 11677 (2021).
  28. Lyons, A., et al. CD200 ligand-receptor interaction modulates microglial activation in vivo and in vitro A role for IL-4. J Neurosci. 27 (31), 8309-8313 (2007).
  29. Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: Actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends Neurosci. 36 (4), 209-217 (2013).
  30. Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nat Neurosci. 24 (1), 19-23 (2021).
  31. Chen, Z., et al. Microglial displacement of inhibitory synapses provides neuroprotection in the adult brain. Nat Commun. 5 (1), 4486 (2014).
  32. Cantaut-Belarif, Y., et al. Microglia control the glycinergic but not the GABAergic synapses via prostaglandin E2 in the spinal cord. J Cell Biol. 216 (9), 2979-2989 (2017).
  33. Szepesi, Z., Manouchehrian, O., Bachiller, S., Deierborg, T. Bidirectional microglia-neuron communication in health and disease. Front Cell Neurosci. 12, 323 (2018).
  34. Chamera, K., Trojan, E., Szuster-Głuszczak, M., Basta-Kaim, A. The potential role of dysfunctions in neuron-microglia communication in the pathogenesis of brain disorders. Curr Neuropharmacol. 18 (5), 408-430 (2020).
  35. Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: Mechanism and potential therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 359 (2023).
  36. Brisch, R., et al. The role of microglia in neuropsychiatric disorders and suicide. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 272 (6), 929-945 (2022).
  37. Dong, Y., et al. Oxidized phosphatidylcholines found in multiple sclerosis lesions mediate neurodegeneration and are neutralized by microglia. Nat Neurosci. 24 (4), 489-503 (2021).
  38. Alvarez-Carbonell, D., et al. Cross-talk between microglia and neurons regulates HIV latency. PLoS Pathog. 15 (12), e1008249 (2019).
  39. Lorenzen, K., et al. Microglia induce neurogenic protein expression in primary cortical cells by stimulating PI3K/AKT intracellular signaling in vitro. Mol Biol Rep. 48 (1), 563-584 (2021).
  40. Güler, B. E., Krzysko, J., Wolfrum, U. Isolation and culturing of primary mouse astrocytes for the analysis of focal adhesion dynamics. STAR Protoc. 2 (4), 100954 (2021).
  41. Tomassoni-Ardori, F., Hong, Z., Fulgenzi, G., Tessarollo, L. Generation of functional mouse hippocampal neurons. Bio Protoc. 10 (15), e3702 (2020).
  42. Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2.7), (2006).
  43. Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-culture of neurons and microglia. Curr Protoc Toxicol. 74, 11.24.1-11.24.17 (2017).
  44. Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 155 (2020).
  45. Carroll, J. A., Foliaki, S. T., Haigh, C. L. A 3D cell culture approach for studying neuroinflammation. J Neurosci Methods. 358, 109201 (2021).
  46. Baxter, P. S., et al. Microglial identity and inflammatory responses are controlled by the combined effects of neurons and astrocytes. Cell Rep. 34 (12), 108882 (2021).
  47. Luchena, C., et al. A neuron, microglia, and astrocyte triple co-culture model to study Alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 844534 (2022).
  48. Park, J., et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer’s disease. Nat Neurosci. 21 (7), 941-951 (2018).
  49. Vahsen, B. F., et al. Human iPSC co-culture model to investigate the interaction between microglia and motor neurons. Sci Rep. 12 (1), 12606 (2022).
  50. Giacomelli, E., et al. Human stem cell models of neurodegeneration: from basic science of amyotrophic lateral sclerosis to clinical translation. Cell Stem Cell. 29 (1), 11-35 (2022).
  51. Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
  52. Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: relationship to neurodegeneration and therapeutics. J Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
  53. Dong, Y., Lozinski, B. M., Silva, C., Yong, V. W. Studying the microglia response to oxidized phosphatidylcholine in primary mouse neuron culture and mouse spinal cord. STAR Protoc. 2 (4), 100853 (2021).
  54. Anderson, S. R., et al. Neuronal apoptosis drives remodeling states of microglia and shifts in survival pathway dependence. eLife. 11, e76564 (2022).
  55. Harry, G. J., McPherson, C. A. Microglia: Neuroprotective and neurodestructive properties. Handbook of Neurotoxicity. , 109-132 (2014).

Tags

MicrogliaCortical NeuronsCNSCo-culturingNeuronal HealthNeurodegenerative DiseasesMultiple SclerosisIn Vitro ProtocolPrimary MicrogliaMixed Glia CultureBrain HomogenatesEmbryonic DaysImmunofluorescence MicroscopyRNA AssaysProtein Assays
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Park, J., Yu, R., Dong, Y. Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (209), e67078, doi:10.3791/67078 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image