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Neuroscience

Geração e co-cultura de microglia primária murina e neurônios corticais

Published: July 26, 2024
doi:
10.3791/67078
, ,
1Department of Biochemistry, Microbiology & Immunology,University of Saskatchewan

Summary

Este protocolo descreve uma co-cultura microglia-neuronal estabelecida a partir de células neuronais primárias isoladas de embriões de camundongos nos dias embrionários 15-16 e microglia primária gerada a partir dos cérebros de camundongos neonatais nos dias pós-natais 1-2.

Abstract

A microglia são macrófagos residentes nos tecidos do sistema nervoso central (SNC), desempenhando inúmeras funções que apoiam a saúde neuronal e a homeostase do SNC. Eles são uma importante população de células imunes associadas à atividade da doença do SNC, adotando fenótipos reativos que potencialmente contribuem para a lesão neuronal durante doenças neurodegenerativas crônicas, como a esclerose múltipla (EM). Os mecanismos distintos pelos quais a microglia regula a função neuronal e a sobrevivência durante a saúde e a doença permanecem limitados devido aos desafios na resolução das complexas interações in vivo entre microglia, neurônios e outros fatores ambientais do SNC. Assim, a abordagem in vitro de co-cultura de microglia e neurônios continua sendo uma ferramenta valiosa para estudar as interações microglia-neuronais. Aqui, apresentamos um protocolo para gerar e co-cultura de micróglia primária e neurônios de camundongos. Especificamente, a microglia foi isolada após 9-10 dias in vitro de uma cultura mista de glia estabelecida a partir de homogeneizados cerebrais derivados de camundongos neonatais entre os dias pós-natais 0-2. As células neuronais foram isoladas do córtex cerebral de embriões de camundongos entre os dias embrionários 16-18. Após 4-5 dias in vitro, as células neuronais foram semeadas em placas de 96 poços, seguidas pela adição de microglia para formar a co-cultura. O tempo cuidadoso é fundamental para este protocolo, pois ambos os tipos de células precisam atingir a maturidade experimental para estabelecer a co-cultura. No geral, essa co-cultura pode ser útil para estudar as interações microglia-neurônio e pode fornecer várias leituras, incluindo microscopia de imunofluorescência, imagens ao vivo, bem como ensaios de RNA e proteínas.

Introduction

A microglia são macrófagos residentes no tecido que facilitam a imunovigilância e a homeostase no sistema nervoso central (SNC)1,2,3. Originam-se de células progenitoras eritromieloides do saco vitelino que colonizam o cérebro durante o desenvolvimento embrionário 4,5,6 e são mantidas ao longo da vida do organismo por meio da auto-renovação, que envolve proliferação e apoptose7. No estado estacionário, a microglia em repouso tem morfologia ramificada e se envolve na vigilância tecidual 8,9,10.

A micróglia expressa numerosos receptores de superfície celular, o que lhes permite responder rapidamente a alterações no SNC11,12 e promover respostas inflamatórias em caso de infecções ou lesão tecidual 12,13,14, bem como durante doenças neurodegenerativas 9,15, como a esclerose múltipla (EM)16,17. A microglia também expressa receptores para vários neurotransmissores e neuropeptídeos 18,19,20, o que sugere que eles também podem responder e regular a atividade neuronal21,22. De fato, a microglia e os neurônios interagem em várias formas de comunicação bidirecional 8,23, como interações diretas mediadas por proteínas de membrana ou interações indiretas por meio de fatores solúveis ou células intermediárias23,24.

Por exemplo, vários neurotransmissores secretados pelos neurônios podem modular a atividade neuroprotetora ou inflamatória da microglia 25,26,27. Além disso, as interações diretas entre neurônios e microglia ajudam a manter a microglia em um estado homeostático28. Por outro lado, as interações diretas da micróglia com os neurônios podem moldar os circuitos neuronais29 e influenciar a sinalização neuronal 30,31,32. Como as interrupções dessas interações induzem hiperexcitabilidade dos neurônios30 e reatividade da microglia33,34, as interações microglia-neuronais desreguladas são implicadas como um fator contribuinte para doenças neurológicas33,35. De fato, doenças psicóticas23,26 e neurodegenerativas foram descritas como exibindo interações microglia-neuronais disfuncionais33. Embora essas observações destaquem a importância da comunicação microglia-neuronal no SNC, mecanismos específicos de como essas interações regulam as funções microgliais e neuronais na saúde e na doença são relativamente desconhecidos.

Dentro de um ambiente complexo como o SNC, vários fatores ambientais podem influenciar as interações microglia-neuronal, o que limita a capacidade de estudar interações celulares transitórias in vivo. Aqui, apresentamos um sistema de co-cultura microglia-neuronal in vitro que pode ser usado para estudar interações celulares diretas entre microglia e neurônios. Este protocolo descreve a geração de micróglia primária e neurônios a partir dos córtices de camundongos neonatais entre os dias 0-2 pós-natais e os dias 16-18 de camundongos embrionários, respectivamente. Neurônios e microglia são então co-cultivados em placas de 96 poços para experimentos de alto rendimento a jusante. Anteriormente, usamos essa abordagem para demonstrar que a fagocitose da microglia protege os neurônios da morte celular mediada por fosfatidilcolina oxidada37, sugerindo que esse método pode ajudar a entender os papéis da microglia no contexto da neurodegeneração e da EM. Da mesma forma, as co-culturas microglia-neuronais também podem ser úteis para investigar o impacto da diafonia microglia-neuronal em outros contextos, como infecções virais38 ou lesão e reparo neuronal39. No geral, os sistemas de co-cultura microglia-neuronal in vitro permitem que os pesquisadores estudem as interações microglia-neuronais em um ambiente manipulável e controlado, que complementa os modelos in vivo.

Protocol

Todos os animais utilizados neste estudo foram alojados e manuseados com a aprovação do Comitê Universitário de Cuidados com Animais (UACC) da Universidade de Saskatchewan e do Conselho Canadense de Cuidados com Animais (CCAC). Dias pós-natais 0-2 camundongos CD1 machos e fêmeas e embriões embrionários dias 16-18 (E16-18) de camundongos CD1 prenhes foram usados para este estudo. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais</s…

Representative Results

Um fluxograma mostrando as principais etapas da cultura mista da glia para microglia é mostrado na Figura 1A. No geral, células esparsas e detritos celulares excessivos são esperados no dia 1 (Figura 1B). No dia 4, deve-se observar aumento do número de células, principalmente com a geração de astrócitos aderentes, conforme indicado por sua morfologia alongada (Figura 1C). Algumas micróglias…

Discussion

Este artigo descreve um protocolo para isolar e cultivar neurônios primários de camundongos e microglia primária, que são posteriormente usados para estabelecer uma co-cultura microglia-neuronal que pode ser usada para estudar como as interações entre microglia e neurônios regulam sua saúde e função celular. Essa abordagem relativamente simples e acessível pode fornecer insights críticos sobre os mecanismos e resultados funcionais das interações dos neurônios da microglia …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JP reconhece o apoio financeiro do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá e da Faculdade de Medicina da Universidade de Saskatchewan. A YD reconhece o apoio financeiro do Fundo de Inicialização da Faculdade de Medicina da Universidade de Saskatchewan, do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá Discovery Grant (RGPIN-2023-03659), MS Canada Catalyst Grant (1019973), Saskatchewan Health Research Foundation Establishment Grant (6368) e Brain Canada Foundation Future Leaders in Canadian Brain Research Grant. A Figura 1A, a Figura 2A e a Figura 3A foram criadas com BioRender.com.

Materials

10 cm Petri dish  Fisher  07-202-011 Sterile
1x Versene Gibco 15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System  Gibco  A3653401
Dissection microscope VWR
DNase I Roche 11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11960-044
Fetal Bovine Serum  ThermoFisher Sci 12483-020
HBSS (10x) Gibco 14065-056
Hemacytometer Hausser Scientific 1475
HEPES  ThermoFisher Sci 15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x) Fisher Scientific  21083027
Macrophage colony stimulating factor  Peprotech 315-02
Micro-Forceps RWD F11020-11 Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acids Cytiva SH3023801
PBS (10x) ThermoFisher Sci AM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x) Gibco 103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide  Sigma P3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
Spring scissors RWD S11008-42 Autoclaved/Sterile
Surgical blade Feather 08-916-5D Sterile
T-25 flasks Fisher 10-126-9
T-75 flasks  Fisher 13-680-65
Tissue forceps Codman 30-4218 Autoclaved/Sterile
Tissue scissors RWD S12052-10 Autoclaved/Sterile
Trypan Blue  Thermofisher Sci  15250-061
Trypsin (2.5%) ThermoFisher Sci 15090046
Widefield Immunofluorescence Microscope Zeiss
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Park, J., Yu, R., Dong, Y. Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (209), e67078, doi:10.3791/67078 (2024).
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