יצירה וטיפוח משותף של תאי מיקרוגליה ראשוניים של מורין ונוירונים קורטיקליים
Summary
פרוטוקול זה מתאר תרבית מיקרוגליה-נוירונים שנוצרה מתאים עצביים ראשוניים שבודדו מעוברי עכברים בימים עובריים 15-16 ומתאי מיקרוגליה ראשוניים שנוצרו ממוחם של עכברים ילודים בימים 1-2 שלאחר הלידה.
Abstract
מיקרוגליה הם מקרופאגים שוכנים ברקמה של מערכת העצבים המרכזית (CNS), המבצעים פונקציות רבות התומכות בבריאות העצבית והומאוסטזיס CNS. הם אוכלוסייה עיקרית של תאי חיסון הקשורים לפעילות מחלת CNS, ומאמצים פנוטיפים תגובתיים שעלולים לתרום לפגיעה עצבית במהלך מחלות נוירודגנרטיביות כרוניות כגון טרשת נפוצה (MS). המנגנונים הייחודיים שבאמצעותם תאי מיקרוגליה מווסתים את התפקוד העצבי ואת הישרדותו במהלך בריאות ומחלות נותרו מוגבלים עקב אתגרים בפתרון האינטראקציות המורכבות in vivo בין מיקרוגליה, נוירונים וגורמים סביבתיים אחרים במערכת העצבים המרכזית. לפיכך, גישת ה-in vitro של תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה ונוירונים נותרה כלי רב ערך לחקר אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירה ולתרבית משותפת של תאי מיקרוגליה ראשוניים ותאי עצב מעכברים. באופן ספציפי, תאי מיקרוגליה בודדו לאחר 9-10 ימים במבחנה מתרבית גליה מעורבת שהוקמה מהומוגנטים במוח שמקורם בעכברים ילודים בין הימים שלאחר הלידה 0-2. תאי עצב בודדו מקליפות המוח של עוברי עכברים בין הימים 16-18. לאחר 4-5 ימים במבחנה, תאי עצב נזרעו בצלחות 96 באר, ולאחר מכן תוספת של מיקרוגליה כדי ליצור את התרבות המשותפת. תזמון זהיר הוא קריטי עבור פרוטוקול זה מכיוון ששני סוגי התאים צריכים להגיע לבשלות ניסויית כדי לבסס את התרבית המשותפת. בסך הכל, תרבית משותפת זו יכולה להיות שימושית לחקר אינטראקציות מיקרוגליה-נוירון ויכולה לספק קריאות מרובות, כולל מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי, הדמיה חיה, כמו גם בדיקות RNA וחלבונים.
Introduction
מיקרוגליה הם מקרופאגים שוכני רקמות המאפשרים מעקב חיסוני והומאוסטזיס במערכת העצבים המרכזית (CNS)1,2,3. מקורם בתאי אב אריתרומיאלואידים של שק החלמון המאכלסים את המוח במהלך ההתפתחות העוברית 4,5,6 ונשמרים לאורך כל חיי האורגניזם באמצעות התחדשות עצמית, הכוללת התרבות ואפופטוזיס7. במצב יציב, תאי מיקרוגליה במנוחה הם בעלי מורפולוגיה מוגברת ועוסקים במעקב רקמות 8,9,10.
מיקרוגליה מבטאת קולטנים רבים לפני השטח של התא, מה שמאפשר להם להגיב במהירות לשינויים במערכת העצבים המרכזית11,12 ולקדם תגובות דלקתיות במקרה של זיהומים או פגיעה ברקמות 12,13,14, כמו גם במהלך מחלות נוירודגנרטיביות 9,15, כגון טרשת נפוצה (MS)16,17. מיקרוגליה גם מבטאת קולטנים למוליכים עצביים שונים ולנוירופפטידים 18,19,20, מה שמרמז שהם עשויים גם להגיב ולווסת את הפעילות העצבית 21,22. ואכן, מיקרוגליה ונוירונים מתקשרים בצורות שונות של תקשורת דו-כיוונית 8,23 כגון אינטראקציות ישירות בתיווך חלבוני ממברנה או אינטראקציות עקיפות באמצעות גורמים מסיסים או תאי ביניים23,24.
לדוגמה, מוליכים עצביים שונים המופרשים על ידי נוירונים יכולים לווסת את הפעילות הנוירופרוטקטיבית או הדלקתית של מיקרוגליה 25,26,27. בנוסף, אינטראקציות ישירות בין נוירונים למיקרוגליה עוזרות לשמור על תאי מיקרוגליה במצב הומיאוסטטי28. לעומת זאת, אינטראקציות ישירות של מיקרוגליה עם נוירונים יכולות לעצב מעגלים עצביים29 ולהשפיע על איתות עצבי 30,31,32. מכיוון שהפרעות באינטראקציות אלה גורמות להתרגשות יתר של נוירונים30 ותגובתיות מיקרוגליה 33,34, אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים לא מווסתות מעורבות כגורם תורם למחלות נוירולוגיות33,35. ואכן, מחלות פסיכוטיות23,26 ומחלות נוירודגנרטיביות תוארו כמציגות אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים לא מתפקדות33. בעוד שתצפיות אלה מדגישות את החשיבות של תקשורת מיקרוגליה-עצבית במערכת העצבים המרכזית, מנגנונים ספציפיים של האופן שבו אינטראקציות אלה מווסתות תפקודים מיקרוגליאליים ועצביים בבריאות ובמחלות אינם ידועים יחסית.
בסביבה מורכבת כמו מערכת העצבים המרכזית, גורמים סביבתיים מרובים יכולים להשפיע על אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים, מה שמגביל את היכולת לחקור אינטראקציות תאיות חולפות in vivo. במאמר זה אנו מציגים מערכת תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים במבחנה שניתן להשתמש בה כדי לחקור אינטראקציות תאיות ישירות בין תאי מיקרוגליה לתאי עצב. פרוטוקול זה מתאר את היצירה של תאי מיקרוגליה ראשוניים ותאי עצב מקליפת המוח של עכברים ילודים בין ימים 0-2 לאחר הלידה לבין ימים 16-18 של עכברים עובריים, בהתאמה. תאי עצב ותאי מיקרוגליה מתורבתים במשותף בלוחות של 96 בארות לצורך ניסויים במורד הזרם, בעלי תפוקה גבוהה. בעבר השתמשנו בגישה זו כדי להדגים כי פגוציטוזה של מיקרוגליה מגנה על תאי עצב מפני מוות תאי מתווך של פוספטידילכולין מחומצן37, מה שמרמז על כך ששיטה זו יכולה לסייע בהבנת תפקידי תאי מיקרוגליה בהקשר של ניוון עצבי וטרשת נפוצה. באופן דומה, תרביות מיקרו-נוירונים עשויות להיות שימושיות גם לחקר ההשפעה של דיבור צולב מיקרוגליה-עצבי בהקשרים אחרים כגון זיהומים ויראליים38 או פגיעה עצבית ותיקון39. בסך הכל, מערכות תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים במבחנה מאפשרות לחוקרים לחקור אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים בסביבה מניפולטיבית ומבוקרת, אשר משלימה מודלים in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר פרוטוקול לבידוד וטיפוח תאי עצב ראשוניים בעכברים ותאי מיקרוגליה ראשוניים, אשר משמשים לאחר מכן ליצירת תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור כיצד אינטראקציות מיקרוגליה ונוירונים מווסתות את בריאותם ותפקודם בתאים. גישה פשוטה ונגישה יחסית זו יכולה לספ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JP מודה במימון תמיכה ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה והמכללה לרפואה של אוניברסיטת ססקצ’ואן. YD מודה בתמיכת מימון מקרן הסטארט-אפ של מכללת ססקצ’ואן לרפואה, מענק התגליות של מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (RGPIN-2023-03659), מענק MS Canada Catalyst (1019973), מענק הקמת קרן מחקר הבריאות של ססקצ’ואן (6368) ומענק מנהיגי העתיד של קרן Brain Canada בקנדה לחקר המוח. איור 1A, איור 2A ואיור 3A נוצרו עם BioRender.com.
Materials
| 10 cm Petri dish | Fisher | 07-202-011 | Sterile |
| 1x Versene | Gibco | 15040-066 | |
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | |
| Dissection microscope | VWR | ||
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Sci | 12483-020 | |
| HBSS (10x) | Gibco | 14065-056 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| HEPES | ThermoFisher Sci | 15630080 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium (1x) | Fisher Scientific | 21083027 | |
| Macrophage colony stimulating factor | Peprotech | 315-02 | |
| Micro-Forceps | RWD | F11020-11 | Autoclaved/Sterile |
| Non-essential amino acids | Cytiva | SH3023801 | |
| PBS (10x) | ThermoFisher Sci | AM9625 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine (100x) | Gibco | 103780-16 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma | P3655-100MG | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Spring scissors | RWD | S11008-42 | Autoclaved/Sterile |
| Surgical blade | Feather | 08-916-5D | Sterile |
| T-25 flasks | Fisher | 10-126-9 | |
| T-75 flasks | Fisher | 13-680-65 | |
| Tissue forceps | Codman | 30-4218 | Autoclaved/Sterile |
| Tissue scissors | RWD | S12052-10 | Autoclaved/Sterile |
| Trypan Blue | Thermofisher Sci | 15250-061 | |
| Trypsin (2.5%) | ThermoFisher Sci | 15090046 | |
| Widefield Immunofluorescence Microscope | Zeiss |
References
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. J Immunol Res. 2017, 1-12 (2017).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
- Ginhoux, F., Prinz, M. Origin of microglia: Current concepts and past controversies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (8), a020537 (2015).
- Dermitzakis, I., et al. Origin and emergence of microglia in the CNS-an interesting (hi)story of an eccentric cell. Curr Issues Mol Biol. 45 (3), 2609-2628 (2023).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Askew, K., et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 18 (2), 391-405 (2017).
- Vidal-Itriago, A., et al. Microglia morphophysiological diversity and its implications for the CNS. Front Immunol. 13, 997786 (2022).
- Wendimu, M. Y., Hooks, S. B. Microglia phenotypes in aging and neurodegenerative diseases. Cells. 11 (13), 2091 (2022).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
- Zhao, J. F., et al. Research progress on the role of microglia membrane proteins or receptors in neuroinflammation and degeneration. Front Cell Neurosci. 16, 831977 (2022).
- Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The role of microglia in central nervous system immunity and glioma immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
- Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198 (2020).
- Doens, D., Fernández, P. L. Microglia receptors and their implications in the response to amyloid β for Alzheimer’s disease pathogenesis. J Neuroinflammation. 11 (1), 48 (2014).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
- Fischer, M. T., et al. NADPH oxidase expression in active multiple sclerosis lesions in relation to oxidative tissue damage and mitochondrial injury. Brain. 135 (3), 886-899 (2012).
- Marinelli, S., Basilico, B., Marrone, M. C., Ragozzino, D. Microglia-neuron crosstalk: Signaling mechanism and control of synaptic transmission. Semin Cell Dev Biol. 94, 138-151 (2019).
- Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
- Carniglia, L., et al. Neuropeptides and microglial activation in inflammation, pain, and neurodegenerative diseases. Mediators Inflamm. 2017, 5048616 (2017).
- Zhao, S., Umpierre, A. D., Wu, L. J. Tuning neural circuits and behaviors by microglia in the adult brain. Trends Neurosci. 47 (3), 181-194 (2024).
- Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: New roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
- Haidar, M. A., et al. Crosstalk between microglia and neurons in neurotrauma: An overview of the underlying mechanisms. Curr Neuropharmacol. 20 (11), 2050-2065 (2022).
- Cserép, C., Pósfai, B., Dénes, &. #. 1. 9. 3. ;. Shaping neuronal fate: Functional heterogeneity of direct microglia-neuron interactions. Neuron. 109 (2), 222-240 (2021).
- Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
- Eyo, U. B., Wu, L. J. Bidirectional microglia-neuron communication in the healthy brain. Neural Plast. 2013, 456857 (2013).
- Strosznajder, J. B., Czapski, G. A. Glutamate and GABA in microglia-neuron cross-talk in Alzheimer’s disease. Int J Mol Sci. 22 (21), 11677 (2021).
- Lyons, A., et al. CD200 ligand-receptor interaction modulates microglial activation in vivo and in vitro A role for IL-4. J Neurosci. 27 (31), 8309-8313 (2007).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: Actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends Neurosci. 36 (4), 209-217 (2013).
- Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nat Neurosci. 24 (1), 19-23 (2021).
- Chen, Z., et al. Microglial displacement of inhibitory synapses provides neuroprotection in the adult brain. Nat Commun. 5 (1), 4486 (2014).
- Cantaut-Belarif, Y., et al. Microglia control the glycinergic but not the GABAergic synapses via prostaglandin E2 in the spinal cord. J Cell Biol. 216 (9), 2979-2989 (2017).
- Szepesi, Z., Manouchehrian, O., Bachiller, S., Deierborg, T. Bidirectional microglia-neuron communication in health and disease. Front Cell Neurosci. 12, 323 (2018).
- Chamera, K., Trojan, E., Szuster-Głuszczak, M., Basta-Kaim, A. The potential role of dysfunctions in neuron-microglia communication in the pathogenesis of brain disorders. Curr Neuropharmacol. 18 (5), 408-430 (2020).
- Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: Mechanism and potential therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 359 (2023).
- Brisch, R., et al. The role of microglia in neuropsychiatric disorders and suicide. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 272 (6), 929-945 (2022).
- Dong, Y., et al. Oxidized phosphatidylcholines found in multiple sclerosis lesions mediate neurodegeneration and are neutralized by microglia. Nat Neurosci. 24 (4), 489-503 (2021).
- Alvarez-Carbonell, D., et al. Cross-talk between microglia and neurons regulates HIV latency. PLoS Pathog. 15 (12), e1008249 (2019).
- Lorenzen, K., et al. Microglia induce neurogenic protein expression in primary cortical cells by stimulating PI3K/AKT intracellular signaling in vitro. Mol Biol Rep. 48 (1), 563-584 (2021).
- Güler, B. E., Krzysko, J., Wolfrum, U. Isolation and culturing of primary mouse astrocytes for the analysis of focal adhesion dynamics. STAR Protoc. 2 (4), 100954 (2021).
- Tomassoni-Ardori, F., Hong, Z., Fulgenzi, G., Tessarollo, L. Generation of functional mouse hippocampal neurons. Bio Protoc. 10 (15), e3702 (2020).
- Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2.7), (2006).
- Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-culture of neurons and microglia. Curr Protoc Toxicol. 74, 11.24.1-11.24.17 (2017).
- Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 155 (2020).
- Carroll, J. A., Foliaki, S. T., Haigh, C. L. A 3D cell culture approach for studying neuroinflammation. J Neurosci Methods. 358, 109201 (2021).
- Baxter, P. S., et al. Microglial identity and inflammatory responses are controlled by the combined effects of neurons and astrocytes. Cell Rep. 34 (12), 108882 (2021).
- Luchena, C., et al. A neuron, microglia, and astrocyte triple co-culture model to study Alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 844534 (2022).
- Park, J., et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer’s disease. Nat Neurosci. 21 (7), 941-951 (2018).
- Vahsen, B. F., et al. Human iPSC co-culture model to investigate the interaction between microglia and motor neurons. Sci Rep. 12 (1), 12606 (2022).
- Giacomelli, E., et al. Human stem cell models of neurodegeneration: from basic science of amyotrophic lateral sclerosis to clinical translation. Cell Stem Cell. 29 (1), 11-35 (2022).
- Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
- Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: relationship to neurodegeneration and therapeutics. J Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
- Dong, Y., Lozinski, B. M., Silva, C., Yong, V. W. Studying the microglia response to oxidized phosphatidylcholine in primary mouse neuron culture and mouse spinal cord. STAR Protoc. 2 (4), 100853 (2021).
- Anderson, S. R., et al. Neuronal apoptosis drives remodeling states of microglia and shifts in survival pathway dependence. eLife. 11, e76564 (2022).
- Harry, G. J., McPherson, C. A. Microglia: Neuroprotective and neurodestructive properties. Handbook of Neurotoxicity. , 109-132 (2014).
.