Флуоресцентный иммунологический анализ на основе наногранул квантовых точек
Summary
В данной статье мы описываем протокол получения наношариков на квантовых точках (QDNB) и обнаружения биомаркеров заболевания с помощью полосок для иммуноферментного анализа на основе квантовых точек на основе QDNB. Результаты испытаний могут быть качественно оценены при ультрафиолетовом освещении и количественно измерены с помощью считывателя флуоресцентных лент в течение 15 минут.
Abstract
Квантовые точки, также известные как полупроводниковые нанокристаллы, являются новыми флуоресцентными метками для биологической визуализации и зондирования. Тем не менее, конъюгаты антител на квантовых точках с малыми размерами (~10 нм), полученные с помощью трудоемких процедур очистки, демонстрируют ограниченную чувствительность при обнаружении определенных следовых маркеров заболевания с помощью иммуноферментных полосок с боковым потоком. В данной работе мы представляем способ получения наношариков на квантовых точках (QDNB) с использованием метода одноэтапного эмульсионного выпаривания. С использованием полученного QDNB был изготовлен флуоресцентный иммунологический анализ для выявления биомаркеров заболевания на примере С-реактивного белка (СРБ). В отличие от наночастиц на основе одиночных квантовых точек, конъюгаты наношариков и антител на основе квантовых точек более чувствительны в качестве меток иммуноферментного анализа благодаря усилению сигнала путем инкапсуляции сотен квантовых точек в одну полимерную композитную нанобусину. Кроме того, больший размер QDNB облегчает разделение центрифугированием при конъюгации QDNB с антителами. Был изготовлен флуоресцентный иммунологический анализ на основе QDNBs, а концентрация СРБ в образце была измерена за 15 минут. Результаты испытаний могут быть качественно оценены при ультрафиолетовом освещении и количественно измерены с помощью флуоресцентного считывателя в течение 15 минут.
Introduction
Полоски для иммуноферментного анализа бокового потока (LFIA) служат важнейшими инструментами быстрого выявления в местах оказания медицинской помощи 1,2, особенно при скрининге заболеваний во время эпидемий. Однако традиционные тест-полоски LFIA на основе коллоидного золота демонстрируют низкую чувствительность обнаружения и дают только качественные результаты3. Для повышения чувствительности детектирования LFIA были разработаны различные новые наночастицы, в том числе цветной латекс 4,5, флуоресцентные наночастицы с повышающей конверсией6, флуоресцентные микросферы 7,8 с временным разрешением и квантовые точки 9,10,11. Квантовые точки (КТ)12,13, также известные как полупроводниковые нанокристаллы, обладают настраиваемой длиной волны излучения, широким диапазоном возбуждения и высокой эффективностью люминесценции, что делает их идеальными метками для биологической визуализации.
Тем не менее, флуоресцентный сигнал, излучаемый отдельными квантовыми точками, остается слабым, что приводит к относительно низкой чувствительности обнаружения в иммунологических анализах. Инкапсуляция многочисленных квантовых точек в микросферах может усилить сигналы и повысить чувствительность иммунологических анализов на основе квантовых точек. Для инкапсуляции квантовых точек внутри микросфер были использованы различные методы, такие как послойная самосборка 14,15,16,17,18, метод набухания 19,20 и инкапсуляция микросфер кремнезема 21,22,23,24. Например, функционализированные квантовыми точками наносферы кремнезема могут быть достигнуты путем увеличения нагрузки квантовой точки на сэндвич-иммунореакцию25. Распылительная сушилка, оснащенная ультразвуковым распылителем, также использовалась для получения наноразмерных наносфер QD-BSA26. Однако вышеупомянутые методы страдают от сложной многоступенчатости, гашения флуоресценции и низкой производительности.
В нашей предыдущей работе27 сообщалось о методе испарения эмульсии-растворителем для инкапсуляции квантовых точек внутри полимерных наношариков. Этот метод приготовления прост, поддерживает флуоресцентную эффективность квантовых точек, обеспечивает высокую эффективность инкапсуляции и позволяет легко масштабировать производство. Несколько исследовательских групп успешно разработали полоски LFIA с использованием QDNB, полученных с помощью этого метода, для приложений, включая обнаружение пищевых токсинов 28,29,30, обнаружение биомаркеров инфекционных заболеваний31,32 и мониторинг окружающей среды33.
В этом протоколе представлены конкретные этапы подготовки наногранул квантовых точек (QDNB), конъюгации QDNB и антител, получения LFIA на основе QDNB и измерения C-реактивного белка (CRP) в образцах плазмы крови человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной статье мы описываем протокол получения наногранул квантовых точек (QDNB)27 и использование QDNB для подготовки флуоресцентных иммунологических анализов бокового потока (LFIA). Продемонстрировано качественное и количественное измерение СРБ в образцах. Этот LFIA на основе …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана проектом Шанхайского комитета по науке и технике (STCSM) (22S31902000) и Программой инкубации клинических исследований Шанхайской больницы кожных заболеваний (No lcfy2021-10).
Materials
| (dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03450 | |
| Absorbance paper | Kinbio Biotech | CH37K | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | B2064 | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| CdSe/ZnS quantum dot | Suzhou Mesolight Inc. | CdSe/ZnS-625 | |
| Choloroform | Sino Pharm | 10006818 | |
| CRP antibody | Hytest Biotech | 4C28 | |
| Fluorescent lateral flow assay reader | Suzhou Helmence Precision Instrument | FIC-H1 | |
| Glass fiber pad | Kinbio Biotech | SB06 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D111018 | |
| Nitrocellulose membrane | Satorious | CN140 | |
| Poly(styrene-maleic anhydride) copolymer | Sigma-Aldrich | S458066 | |
| Rabbit IgG | Sangon Biotech | D110502 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sino Pharm | 30166428 | |
| Sodium hydroxide | Sino Pharm | 10019718 |
References
- de Puig, H., Bosch, I., Gehrke, L., Hamad-Schifferli, K. Challenges of the nano-bio interface in lateral flow and dipstick immunoassays. Trends Biotechnol. 35 (12), 1169-1180 (2017).
- Miller, B. S., et al. Spin-enhanced nanodiamond biosensing for ultrasensitive diagnostics. Nature. 587 (7835), 588-593 (2020).
- Gao, Z., et al. Platinum-decorated gold nanoparticles with dual functionalities for ultrasensitive colorimetric in vitro diagnostics. Nano Lett. 17 (9), 5572-5579 (2017).
- Fan, L., et al. Deeply-dyed nanobead system for rapid lateral flow assay testing of drugs at point-of-care. Sensors Actuators B Chem. 362, 131829 (2022).
- Garcia, V. S., Guerrero, S. A., Gugliotta, L. M., Gonzalez, V. D. G. A lateral flow immunoassay based on colored latex particles for detection of canine visceral leishmaniasis. Acta Trop. 212, 105643 (2020).
- You, M., et al. Household fluorescent lateral flow strip platform for sensitive and quantitative prognosis of heart failure using dual-color upconversion nanoparticles. ACS Nano. 11 (6), 6261-6270 (2017).
- Ye, Z., Tan, M., Wang, G., Yuan, J. Novel fluorescent europium chelate-doped silica nanoparticles: preparation, characterization and time-resolved fluorometric application. J Mater Chem. 14 (5), 851 (2004).
- Xu, Y., Li, Q. Multiple fluorescent labeling of silica nanoparticles with lanthanide chelates for highly sensitive time-resolved immunofluorometric assays. Clin Chem. 53 (8), 1503-1510 (2007).
- Zhang, B., et al. Improving detection sensitivity by oriented bioconjugation of antibodies to quantum dots with a flexible spacer arm for immunoassay. RSC Adv. 6 (55), 50119-50127 (2016).
- Li, Z., et al. Rapid and sensitive detection of protein biomarker using a portable fluorescence biosensor based on quantum dots and a lateral flow test strip. Anal Chem. 82 (16), 7008-7014 (2010).
- Wang, L., et al. Fluorescent strip sensor for rapid determination of toxins. Chem Commun. 47 (5), 1574-1576 (2011).
- Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labeling and sensing. Nat Mater. 4 (6), 435-446 (2005).
- Smith, A. M., Nie, S. Compact quantum dots for single-molecule imaging. J Vis Exp. 68, e4236 (2012).
- Wang, C., et al. Layer-by-layer assembly of magnetic-core dual quantum dot-shell nanocomposites for fluorescence lateral flow detection of bacteria. Nanoscale. 12 (2), 795-807 (2020).
- Hu, J., Tang, F., Jiang, Y. Z., Liu, C. Rapid screening and quantitative detection of Salmonella using a quantum dot nanobead-based biosensor. Analyst. 145 (6), 2184-2190 (2020).
- Wang, W., et al. Introduction of graphene oxide-supported multilayer-quantum dots nanofilm into multiplex lateral flow immunoassay: A rapid and ultrasensitive point-of-care testing technique for multiple respiratory viruses. Nano Res. 16 (2), 3063-3073 (2023).
- Wang, C., et al. Colorimetric-fluorescent dual-signal enhancement immunochromatographic assay based on molybdenum disulfide-supported quantum dot nanosheets for the point-of-care testing of monkeypox virus. Chem Eng J. 472, 144889 (2023).
- Zheng, S., et al. Dual-color MoS2@QD nanosheets mediated dual-mode lateral flow immunoassay for flexible and ultrasensitive detection of multiple drug residues. Sensors Actuators B Chem. 403, 135142 (2024).
- Wang, G., et al. Efficient incorporation of quantum dots into porous microspheres through a solvent-evaporation approach. Langmuir. 28 (14), 6141-6150 (2012).
- Li, H., et al. Fluorescent lateral flow immunoassay for highly sensitive detection of eight anticoagulant rodenticides based on cadmium-free quantum dot-encapsulated nanospheres. Sensors Actuators B Chem. 324, 128771 (2020).
- Gao, F., et al. Rational design of dendritic mesoporous silica nanoparticles’ surface chemistry for quantum dot enrichment and an ultrasensitive lateral flow immunoassay. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (18), 21507-21515 (2021).
- Xu, L. D., Zhu, J., Ding, S. N. Immunoassay of SARS-CoV-2 nucleocapsid proteins using novel red emission-enhanced carbon dot-based silica spheres. Analyst. 146 (16), 5055-5060 (2021).
- Tao, S., et al. SARS-Cov-2 Spike-S1 antigen test strip with high sensitivity endowed by high-affinity antibodies and brightly fluorescent QDs/silica nanospheres. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (23), 27612-27623 (2023).
- Wang, C., et al. Development of an ultrasensitive fluorescent immunochromatographic assay based on multilayer quantum dot nanobead for simultaneous detection of SARS-CoV-2 antigen and influenza A virus. Sensors Actuators B Chem. 345, 130372 (2021).
- Chen, L., Chen, C., Li, R., Li, Y., Liu, S. CdTe quantum dot functionalized silica nanosphere labels for ultrasensitive detection of biomarker. Chem Commun. 19, 2670-2672 (2009).
- Chu, M., et al. A novel method for preparing quantum dot nanospheres with narrow size distribution. Nanoscale. 2 (4), 542-547 (2010).
- Zhang, P., Lu, H., Chen, J., Han, H., Ma, W. Simple and sensitive detection of HBsAg by using a quantum dots nanobeads based dot-blot immunoassay. Theranostics. 4 (3), 307-315 (2014).
- Ouyang, S., et al. An on-site, ultra-sensitive, quantitative sensing method for the determination of total aflatoxin in peanut and rice based on quantum dot nanobeads strip. Toxins. 9 (4), 137 (2017).
- Liu, J., et al. Quantitative ciprofloxacin on-site rapid detections using quantum dot microsphere based immunochromatographic test strips. Food Chem. 335, 127596 (2021).
- Chen, Y., Fu, Q., Xie, J., Wang, H., Tang, Y. Development of a high sensitivity quantum dot-based fluorescent quenching lateral flow assay for the detection of zearalenone. Anal Bioanal Chem. 411 (10), 2169-2175 (2019).
- Zhang, Q., et al. SARS-CoV-2 detection using quantum dot fluorescence immunochromatography combined with isothermal amplification and CRISPR/Cas13a. Biosens Bioelectron. 202, 113978 (2022).
- Zhong, X., et al. CRISPR-based quantum dot nanobead lateral flow assay for facile detection of varicella-zoster virus. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (10), 3319-3328 (2023).
- Liu, Y., Xiao, M., Xu, N., Yang, M., Yi, C. Point-of-need quantitation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid using a ratiometric fluorescent nanoprobe and a smartphone-based sensing system. Sensors Actuators B Chem. 367, 132083 (2022).
- McCafferty, C., et al. Blood collection processing and handling for plasma and serum proteomics BT – Serum/plasma proteomics. Methods Mol Biol. 2628, 33-40 (2023).
- Zhang, P., et al. Rapid and quantitative detection of C-reactive protein based on quantum dots and immunofiltration assay. Int J Nanomedicine. 10, 6161-6173 (2015).
- Hu, J., et al. Sensitive and quantitative detection of C-reaction protein based on immunofluorescent nanospheres coupled with lateral flow test strip. Anal Chem. 88 (12), 6577-6584 (2016).
- Fan, L., et al. One-component dual-readout aggregation-induced emission nanobeads for qualitative and quantitative detection of c-reactive protein at the point of care. Anal Chem. 96 (1), 401-408 (2024).
- Gui, Y., et al. Colorimetric and reverse fluorescence dual-signal readout immunochromatographic assay for the sensitive determination of sibutramine. ACS Omega. 9 (6), 7075-7084 (2024).
