זרימה צידית פלואורסצנטית Immunoassay מבוסס על נקודות קוונטיות ננו-חרוזים
Summary
במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להכנת ננו-חרוזי נקודה קוונטית (QDNB) ולזיהוי סמנים ביולוגיים של מחלות באמצעות רצועות חיסון מבוססות זרימה צידית מבוססות QDNB. ניתן להעריך את תוצאות הבדיקה באופן איכותי תחת תאורת אור UV ולמדוד כמותית באמצעות קורא פס פלואורסצנטי תוך 15 דקות.
Abstract
נקודות קוונטיות, הידועות גם בשם ננו-גבישים מוליכים למחצה, הן תוויות פלואורסצנטיות חדשניות לדימות וחישה ביולוגיים. עם זאת, נוגדנים נקודתיים קוונטיים מצומדים עם ממדים קטנים (~ 10 ננומטר), שהוכנו באמצעות הליכי טיהור מייגעים, מפגינים רגישות מוגבלת בזיהוי סמנים מסוימים של מחלת קורט באמצעות רצועות חיסון זרימה רוחבית. כאן אנו מציגים שיטה להכנת ננו-חרוזי נקודה קוונטית (QDNB) בשיטת אידוי תחליב חד-שלבית. באמצעות QDNB כפי שהוכן, חיסון זרימה צידית פלואורסצנטית יוצר כדי לזהות סמנים ביולוגיים של מחלות באמצעות חלבון מגיב C (CRP) כדוגמה. שלא כמו ננו-חלקיקים של נקודה קוונטית בודדת, מצומדים של ננו-נוגדנים של נקודה קוונטית רגישים יותר כמו תוויות אימונואסאי בשל הגברת האות על ידי עטיפת מאות נקודות קוונטיות בננו-חרוז פולימרי מרוכב אחד. יתר על כן, הגודל הגדול יותר של QDNBs מאפשר הפרדת צנטריפוגות קלה יותר בעת הצמדת QDNB עם נוגדנים. בדיקת הזרימה הצידית הפלואורסצנטית המבוססת על QDNBs הייתה מפוברקת, וריכוז CRP בדגימה נמדד תוך 15 דקות. ניתן להעריך את תוצאות הבדיקה באופן איכותי תחת תאורת אור UV ולמדוד כמותית באמצעות קורא פלואורסצנטי תוך 15 דקות.
Introduction
רצועות Lateral flow immunoassay (LFIA) משמשות ככלים חיוניים לגילוי מהיר בנקודות טיפול 1,2, במיוחד בבדיקות סקר למחלות במהלך מגיפות. עם זאת, רצועות בדיקת LFIA מסורתיות מבוססות זהב קולואידיות מציגות רגישות זיהוי נמוכה ומספקות רק תוצאות איכותיות3. כדי לשפר את רגישות הזיהוי של LFIA, הופיעו ננו-חלקיקים חדשים שונים, כולל לטקס צבעוני 4,5,ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים 6, מיקרוספרות פלואורסצנטיות 7,8 ונקודות קוונטיות 9,10,11. נקודות קוונטיות (QDs)12,13, הידועות גם כננו-גבישים מוליכים למחצה, מציעות אורכי גל של פליטה מתכווננת, טווח עירור רחב ויעילות הארה גבוהה, מה שהופך אותן לתוויות אידיאליות לדימות ביולוגי.
עם זאת, האות הפלואורסצנטי הנפלט מנקודות קוונטיות בודדות נותר חלש, וכתוצאה מכך רגישות הזיהוי נמוכה יחסית באימונואסות. אנקפסולציה של נקודות קוונטיות רבות בתוך מיקרוספרות יכולה להגביר אותות ולשפר את הרגישות של בדיקות חיסוניות מבוססות נקודות קוונטיות. שיטות שונות, כגון הרכבה עצמית שכבה אחר שכבה 14,15,16,17,18, שיטת הנפיחות19,20, ומיקרספירת סיליקה 21,22,23,24 אנקפסולציה, שימשו כדי לתמצת נקודות קוונטיות בתוך מיקרוספרות. לדוגמה, ניתן להשיג תוויות ננו-ספירה של סיליקה עם פונקציונליות של נקודות קוונטיות על ידי הגדלת עומס QD לכל תגובה חיסונית דחוקה25. מייבש ריסוס המצויד באטומיזר על-קולי שימש גם להכנת ננו-ספירות QD-BSAננומטריות 26. עם זאת, השיטות הנ”ל סובלות מריבוי שלבים מורכבים, מרווה פלואורסצנטית ופרודוקטיביות נמוכה.
בעבודתנו הקודמת27 דווח על שיטת אידוי תחליב-ממס לעטיפת נקודות קוונטיות בתוך ננו-חרוזים פולימריים. טכניקת הכנה זו פשוטה, שומרת על היעילות הפלואורסצנטית של QDs, מבטיחה יעילות אנקפסולציה גבוהה ומאפשרת ייצור קל להרחבה. מספר קבוצות מחקר פיתחו בהצלחה רצועות LFIA באמצעות QDNB שהוכנו בשיטה זו ליישומים, כולל זיהוי רעלני מזון 28,29,30, זיהוי סמנים ביולוגיים של מחלות זיהומיות 31,32 וניטור סביבתי33.
פרוטוקול זה מציג שלבי הכנה ספציפיים עבור ננו-חרוזי נקודה קוונטית (QDNB), QDNB וצימוד נוגדנים, הכנת FFIA מבוסס QDNB ומדידה של חלבון מגיב C (CRP) בדגימות פלזמה אנושיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להכנת ננו-כדוריות נקודה קוונטית (QDNB)27 ושימוש ב-QDNB להכנת בדיקות חיסוניות פלואורסצנטיות לזרימה צידית (LFIA). מודגמת מדידה איכותית וכמותית של CRP במדגמים. LFIA מבוסס QDNB זה יכול להיות מיושם גם על סמנים ביולוגיים אחרים של מחלות25,32…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט ועדת המדע והטכנולוגיה של שנחאי (STCSM) (22S31902000) ותוכנית הדגירה למחקר קליני של בית החולים למחלות עור בשנחאי (NO. lcfy2021-10).
Materials
| (dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03450 | |
| Absorbance paper | Kinbio Biotech | CH37K | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | B2064 | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| CdSe/ZnS quantum dot | Suzhou Mesolight Inc. | CdSe/ZnS-625 | |
| Choloroform | Sino Pharm | 10006818 | |
| CRP antibody | Hytest Biotech | 4C28 | |
| Fluorescent lateral flow assay reader | Suzhou Helmence Precision Instrument | FIC-H1 | |
| Glass fiber pad | Kinbio Biotech | SB06 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D111018 | |
| Nitrocellulose membrane | Satorious | CN140 | |
| Poly(styrene-maleic anhydride) copolymer | Sigma-Aldrich | S458066 | |
| Rabbit IgG | Sangon Biotech | D110502 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sino Pharm | 30166428 | |
| Sodium hydroxide | Sino Pharm | 10019718 |
References
- de Puig, H., Bosch, I., Gehrke, L., Hamad-Schifferli, K. Challenges of the nano-bio interface in lateral flow and dipstick immunoassays. Trends Biotechnol. 35 (12), 1169-1180 (2017).
- Miller, B. S., et al. Spin-enhanced nanodiamond biosensing for ultrasensitive diagnostics. Nature. 587 (7835), 588-593 (2020).
- Gao, Z., et al. Platinum-decorated gold nanoparticles with dual functionalities for ultrasensitive colorimetric in vitro diagnostics. Nano Lett. 17 (9), 5572-5579 (2017).
- Fan, L., et al. Deeply-dyed nanobead system for rapid lateral flow assay testing of drugs at point-of-care. Sensors Actuators B Chem. 362, 131829 (2022).
- Garcia, V. S., Guerrero, S. A., Gugliotta, L. M., Gonzalez, V. D. G. A lateral flow immunoassay based on colored latex particles for detection of canine visceral leishmaniasis. Acta Trop. 212, 105643 (2020).
- You, M., et al. Household fluorescent lateral flow strip platform for sensitive and quantitative prognosis of heart failure using dual-color upconversion nanoparticles. ACS Nano. 11 (6), 6261-6270 (2017).
- Ye, Z., Tan, M., Wang, G., Yuan, J. Novel fluorescent europium chelate-doped silica nanoparticles: preparation, characterization and time-resolved fluorometric application. J Mater Chem. 14 (5), 851 (2004).
- Xu, Y., Li, Q. Multiple fluorescent labeling of silica nanoparticles with lanthanide chelates for highly sensitive time-resolved immunofluorometric assays. Clin Chem. 53 (8), 1503-1510 (2007).
- Zhang, B., et al. Improving detection sensitivity by oriented bioconjugation of antibodies to quantum dots with a flexible spacer arm for immunoassay. RSC Adv. 6 (55), 50119-50127 (2016).
- Li, Z., et al. Rapid and sensitive detection of protein biomarker using a portable fluorescence biosensor based on quantum dots and a lateral flow test strip. Anal Chem. 82 (16), 7008-7014 (2010).
- Wang, L., et al. Fluorescent strip sensor for rapid determination of toxins. Chem Commun. 47 (5), 1574-1576 (2011).
- Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labeling and sensing. Nat Mater. 4 (6), 435-446 (2005).
- Smith, A. M., Nie, S. Compact quantum dots for single-molecule imaging. J Vis Exp. 68, e4236 (2012).
- Wang, C., et al. Layer-by-layer assembly of magnetic-core dual quantum dot-shell nanocomposites for fluorescence lateral flow detection of bacteria. Nanoscale. 12 (2), 795-807 (2020).
- Hu, J., Tang, F., Jiang, Y. Z., Liu, C. Rapid screening and quantitative detection of Salmonella using a quantum dot nanobead-based biosensor. Analyst. 145 (6), 2184-2190 (2020).
- Wang, W., et al. Introduction of graphene oxide-supported multilayer-quantum dots nanofilm into multiplex lateral flow immunoassay: A rapid and ultrasensitive point-of-care testing technique for multiple respiratory viruses. Nano Res. 16 (2), 3063-3073 (2023).
- Wang, C., et al. Colorimetric-fluorescent dual-signal enhancement immunochromatographic assay based on molybdenum disulfide-supported quantum dot nanosheets for the point-of-care testing of monkeypox virus. Chem Eng J. 472, 144889 (2023).
- Zheng, S., et al. Dual-color MoS2@QD nanosheets mediated dual-mode lateral flow immunoassay for flexible and ultrasensitive detection of multiple drug residues. Sensors Actuators B Chem. 403, 135142 (2024).
- Wang, G., et al. Efficient incorporation of quantum dots into porous microspheres through a solvent-evaporation approach. Langmuir. 28 (14), 6141-6150 (2012).
- Li, H., et al. Fluorescent lateral flow immunoassay for highly sensitive detection of eight anticoagulant rodenticides based on cadmium-free quantum dot-encapsulated nanospheres. Sensors Actuators B Chem. 324, 128771 (2020).
- Gao, F., et al. Rational design of dendritic mesoporous silica nanoparticles’ surface chemistry for quantum dot enrichment and an ultrasensitive lateral flow immunoassay. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (18), 21507-21515 (2021).
- Xu, L. D., Zhu, J., Ding, S. N. Immunoassay of SARS-CoV-2 nucleocapsid proteins using novel red emission-enhanced carbon dot-based silica spheres. Analyst. 146 (16), 5055-5060 (2021).
- Tao, S., et al. SARS-Cov-2 Spike-S1 antigen test strip with high sensitivity endowed by high-affinity antibodies and brightly fluorescent QDs/silica nanospheres. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (23), 27612-27623 (2023).
- Wang, C., et al. Development of an ultrasensitive fluorescent immunochromatographic assay based on multilayer quantum dot nanobead for simultaneous detection of SARS-CoV-2 antigen and influenza A virus. Sensors Actuators B Chem. 345, 130372 (2021).
- Chen, L., Chen, C., Li, R., Li, Y., Liu, S. CdTe quantum dot functionalized silica nanosphere labels for ultrasensitive detection of biomarker. Chem Commun. 19, 2670-2672 (2009).
- Chu, M., et al. A novel method for preparing quantum dot nanospheres with narrow size distribution. Nanoscale. 2 (4), 542-547 (2010).
- Zhang, P., Lu, H., Chen, J., Han, H., Ma, W. Simple and sensitive detection of HBsAg by using a quantum dots nanobeads based dot-blot immunoassay. Theranostics. 4 (3), 307-315 (2014).
- Ouyang, S., et al. An on-site, ultra-sensitive, quantitative sensing method for the determination of total aflatoxin in peanut and rice based on quantum dot nanobeads strip. Toxins. 9 (4), 137 (2017).
- Liu, J., et al. Quantitative ciprofloxacin on-site rapid detections using quantum dot microsphere based immunochromatographic test strips. Food Chem. 335, 127596 (2021).
- Chen, Y., Fu, Q., Xie, J., Wang, H., Tang, Y. Development of a high sensitivity quantum dot-based fluorescent quenching lateral flow assay for the detection of zearalenone. Anal Bioanal Chem. 411 (10), 2169-2175 (2019).
- Zhang, Q., et al. SARS-CoV-2 detection using quantum dot fluorescence immunochromatography combined with isothermal amplification and CRISPR/Cas13a. Biosens Bioelectron. 202, 113978 (2022).
- Zhong, X., et al. CRISPR-based quantum dot nanobead lateral flow assay for facile detection of varicella-zoster virus. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (10), 3319-3328 (2023).
- Liu, Y., Xiao, M., Xu, N., Yang, M., Yi, C. Point-of-need quantitation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid using a ratiometric fluorescent nanoprobe and a smartphone-based sensing system. Sensors Actuators B Chem. 367, 132083 (2022).
- McCafferty, C., et al. Blood collection processing and handling for plasma and serum proteomics BT – Serum/plasma proteomics. Methods Mol Biol. 2628, 33-40 (2023).
- Zhang, P., et al. Rapid and quantitative detection of C-reactive protein based on quantum dots and immunofiltration assay. Int J Nanomedicine. 10, 6161-6173 (2015).
- Hu, J., et al. Sensitive and quantitative detection of C-reaction protein based on immunofluorescent nanospheres coupled with lateral flow test strip. Anal Chem. 88 (12), 6577-6584 (2016).
- Fan, L., et al. One-component dual-readout aggregation-induced emission nanobeads for qualitative and quantitative detection of c-reactive protein at the point of care. Anal Chem. 96 (1), 401-408 (2024).
- Gui, Y., et al. Colorimetric and reverse fluorescence dual-signal readout immunochromatographic assay for the sensitive determination of sibutramine. ACS Omega. 9 (6), 7075-7084 (2024).
