Immunodosage fluorescent à flux latéral basé sur des nanobilles de points quantiques
Summary
Ici, nous décrivons un protocole pour la préparation de nanobilles de points quantiques (QDNB) et la détection de biomarqueurs de maladies à l’aide de bandelettes d’immunodosage à flux latéral basées sur QDNB. Les résultats des tests peuvent être évalués qualitativement sous un éclairage à la lumière UV et mesurés quantitativement à l’aide d’un lecteur de bande fluorescente dans les 15 minutes.
Abstract
Les points quantiques, également connus sous le nom de nanocristaux semi-conducteurs, sont de nouveaux marqueurs fluorescents pour l’imagerie et la détection biologiques. Cependant, les conjugués d’anticorps à points quantiques de petites dimensions (~10 nm), préparés par des procédures de purification laborieuses, présentent une sensibilité limitée dans la détection de certains marqueurs de maladies à l’état de traces à l’aide de bandelettes d’immunodosage à flux latéral. Ici, nous présentons une méthode de préparation de nanobilles de points quantiques (QDNB) à l’aide d’une méthode d’évaporation d’émulsion en une étape. À l’aide du QDNB tel que préparé, un test immunologique fluorescent à flux latéral a été fabriqué pour détecter les biomarqueurs de la maladie en utilisant la protéine C-réactive (CRP) à titre d’exemple. Contrairement aux nanoparticules à point quantique unique, les conjugués nanobilles-anticorps sont plus sensibles en tant que marqueurs d’immunodosage en raison de l’amplification du signal en encapsulant des centaines de points quantiques dans une nanobille composite polymère. De plus, la plus grande taille des QDNB facilite la séparation par centrifugation lors de la conjugaison des QDNB avec des anticorps. L’immunodosage fluorescent à flux latéral basé sur les QDNB a été fabriqué, et la concentration de CRP dans l’échantillon a été mesurée en 15 min. Les résultats des tests peuvent être évalués qualitativement sous un éclairage à la lumière UV et mesurés quantitativement à l’aide d’un lecteur fluorescent dans les 15 minutes.
Introduction
Les bandelettes d’immunodosage à flux latéral (LFIA) constituent des outils de détection rapide essentiels au point de service 1,2, en particulier dans le dépistage des maladies pendant les épidémies. Cependant, les bandelettes de test LFIA traditionnelles à base d’or colloïdal présentent une faible sensibilité de détection et ne fournissent que des résultats qualitatifs3. Pour améliorer la sensibilité de détection du LFIA, diverses nouvelles nanoparticules ont émergé, notamment du latex coloré 4,5, des nanoparticules fluorescentesà conversion ascendante 6, des microsphères fluorescentes résolues en temps 7,8 et des points quantiques 9,10,11. Les points quantiques (QD)12,13, également connus sous le nom de nanocristaux semi-conducteurs, offrent des longueurs d’onde d’émission accordables, une large plage d’excitation et une efficacité de luminescence élevée, ce qui en fait des marqueurs idéaux pour l’imagerie biologique.
Cependant, le signal de fluorescence émis par les points quantiques individuels reste faible, ce qui entraîne une sensibilité de détection relativement faible dans les immunoessais. L’encapsulation de nombreux points quantiques dans des microsphères peut amplifier les signaux et améliorer la sensibilité des immunoessais basés sur les points quantiques. Diverses méthodes, telles que l’auto-assemblage couche par couche 14,15,16,17,18, la méthode de gonflement19,20 et l’encapsulation de microsphères de silice 21,22,23,24, ont été utilisées pour encapsuler des points quantiques à l’intérieur de microsphères. Par exemple, il est possible d’obtenir des marquages de nanosphères de silice fonctionnalisés par des points quantiques en augmentant la charge QD par immunoréaction prise en sandwich25. Un sécheur par atomisation équipé d’un atomiseur à ultrasons a également été utilisé pour préparer des nanosphères QD-BSA26 à l’échelle nanométrique. Cependant, les méthodes susmentionnées souffrent de plusieurs étapes complexes, d’une extinction par fluorescence et d’une faible productivité.
Dans nos travaux précédents27, une méthode d’évaporation émulsion-solvant pour encapsuler des points quantiques à l’intérieur de nanobilles de polymère a été rapportée. Cette technique de préparation est simple, maintient l’efficacité fluorescente des QD, assure une efficacité d’encapsulation élevée et permet une production facile et évolutive. Plusieurs groupes de recherche ont réussi à mettre au point des bandelettes LFIA à l’aide de QDNB préparés par cette méthode pour des applications, notamment la détection des toxines alimentaires 28,29,30, la détection des biomarqueurs de maladies infectieuses 31,32 et la surveillance environnementale33.
Ce protocole présente des étapes spécifiques de préparation pour la conjugaison des nanobilles de points quantiques (QDNB), des QDNB et des anticorps, la préparation de LFIA à base de QDNB et la mesure de la protéine C-réactive (CRP) dans des échantillons de plasma humain.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous décrivons un protocole pour la préparation de nanobilles de points quantiques (QDNB)27 et l’utilisation de QDNB pour la préparation d’immunoessais fluorescents à flux latéral (LFIA). La mesure qualitative et quantitative de la CRP dans les échantillons est démontrée. Cette LFIA basée sur QDNB peut également être appliquée à d’autres biomarqueurs de maladies25,32, toxines alimentaires29,30</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Projet du Comité des sciences et de la technologie de Shanghai (STCSM) (22S31902000) et le Programme d’incubation de la recherche clinique de l’Hôpital des maladies de la peau de Shanghai (NO. lcfy2021-10).
Materials
| (dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03450 | |
| Absorbance paper | Kinbio Biotech | CH37K | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | B2064 | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| CdSe/ZnS quantum dot | Suzhou Mesolight Inc. | CdSe/ZnS-625 | |
| Choloroform | Sino Pharm | 10006818 | |
| CRP antibody | Hytest Biotech | 4C28 | |
| Fluorescent lateral flow assay reader | Suzhou Helmence Precision Instrument | FIC-H1 | |
| Glass fiber pad | Kinbio Biotech | SB06 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D111018 | |
| Nitrocellulose membrane | Satorious | CN140 | |
| Poly(styrene-maleic anhydride) copolymer | Sigma-Aldrich | S458066 | |
| Rabbit IgG | Sangon Biotech | D110502 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sino Pharm | 30166428 | |
| Sodium hydroxide | Sino Pharm | 10019718 |
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