Fluoreszierender Lateral-Flow-Immunoassay auf Basis von Quantenpunkt-Nanokügelchen
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Quantenpunkt-Nanokügelchen (QDNB) und den Nachweis von Krankheitsbiomarkern mit QDNB-basierten Lateral-Flow-Immunoassay-Streifen. Die Testergebnisse können unter UV-Licht-Beleuchtung qualitativ beurteilt und mit einem fluoreszierenden Stripreader innerhalb von 15 min quantitativ gemessen werden.
Abstract
Quantenpunkte, auch Halbleiter-Nanokristalle genannt, sind neuartige Fluoreszenzmarkierungen für die biologische Bildgebung und Sensorik. Quantenpunkt-Antikörperkonjugate mit kleinen Abmessungen (~10 nm), die durch aufwendige Aufreinigungsverfahren hergestellt wurden, weisen jedoch eine begrenzte Sensitivität beim Nachweis bestimmter Marker für Spurenkrankheiten mit Lateral-Flow-Immunoassay-Streifen auf. Darin stellen wir ein Verfahren zur Herstellung von Quantenpunkt-Nanokügelchen (QDNB) unter Verwendung eines einstufigen Emulsionsverdampfungsverfahrens vor. Unter Verwendung des präparierten QDNB wurde ein fluoreszierender Lateral-Flow-Immunoassay zum Nachweis von Krankheitsbiomarkern am Beispiel des C-reaktiven Proteins (CRP) hergestellt. Im Gegensatz zu einzelnen Quantenpunkt-Nanopartikeln sind Quantenpunkt-Nanokügelchen-Antikörper-Konjugate aufgrund der Signalverstärkung als Immunoassay-Markierungen empfindlicher, indem sie Hunderte von Quantenpunkten in einer Polymerkomposit-Nanokügelchen verkapseln. Darüber hinaus erleichtert die größere Größe der QDNBs die Zentrifugationstrennung bei der Konjugation von QDNBs mit Antikörpern. Der fluoreszierende Lateral-Flow-Immunoassay auf Basis von QDNBs wurde hergestellt und die CRP-Konzentration in der Probe in 15 Minuten gemessen. Die Testergebnisse können unter UV-Licht-Beleuchtung qualitativ beurteilt und mit einem Fluoreszenz-Reader innerhalb von 15 min quantitativ gemessen werden.
Introduction
Lateral-Flow-Immunoassay-Streifen (LFIA) dienen als wichtige Instrumente für den Schnellnachweis am Point-of-Care 1,2, insbesondere beim Krankheitsscreening während Epidemien. Herkömmliche kolloidale LFIA-Teststreifen auf Goldbasis weisen jedoch eine geringe Nachweisempfindlichkeit auf und liefern nur qualitative Ergebnisse3. Um die Detektionsempfindlichkeit von LFIA zu erhöhen, sind verschiedene neue Nanopartikel entstanden, darunter farbiger Latex 4,5, fluoreszierende Nanopartikel6 mit Aufkonversion, zeitaufgelöste fluoreszierende Mikrosphären 7,8 und Quantenpunkte 9,10,11. Quantenpunkte (QDs)12,13, auch Halbleiter-Nanokristalle genannt, bieten abstimmbare Emissionswellenlängen, einen großen Anregungsbereich und eine hohe Lumineszenzeffizienz, was sie zu idealen Markierungen für die biologische Bildgebung macht.
Das Fluoreszenzsignal, das von einzelnen Quantenpunkten emittiert wird, bleibt jedoch schwach, was zu einer relativ geringen Nachweisempfindlichkeit in Immunoassays führt. Die Verkapselung zahlreicher Quantenpunkte in Mikrosphären kann Signale verstärken und die Empfindlichkeit von Quantenpunkt-basierten Immunoassays verbessern. Verschiedene Verfahren, wie die schichtweise Selbstorganisation 14,15,16,17,18, das Quellverfahren19,20 und die Verkapselung mit Siliziumdioxid-Mikrosphären 21,22,23,24, wurden verwendet, um Quantenpunkte innerhalb von Mikrosphären einzukapseln. Zum Beispiel können quantenpunktfunktionalisierte Siliziumdioxid-Nanosphärenmarkierungen durch Erhöhung der QD-Beladung pro Sandwich-Immunreaktion25 erreicht werden. Ein Sprühtrockner, der mit einem Ultraschallzerstäuber ausgestattet ist, wurde auch zur Herstellung von nanoskaligen QD-BSA-Nanosphärenverwendet 26. Die oben genannten Methoden leiden jedoch unter komplexen Mehrschritten, Fluoreszenzlöschung und geringer Produktivität.
In unserer vorherigen Arbeit27 wurde über eine Emulsions-Lösungsmittel-Verdampfungsmethode zur Verkapselung von Quantenpunkten in Polymer-Nanokügelchen berichtet. Diese Präparationstechnik ist einfach, behält die Fluoreszenzeffizienz von QDs bei, gewährleistet eine hohe Verkapselungseffizienz und ermöglicht eine einfach skalierbare Produktion. Mehrere Forschungsgruppen haben erfolgreich LFIA-Streifen unter Verwendung von QDNBs entwickelt, die mit dieser Methode für Anwendungen hergestellt wurden, einschließlich des Nachweises von Lebensmitteltoxinen 28,29,30, des Nachweises von Biomarkern für Infektionskrankheiten31,32 und der Umweltüberwachung 33.
Dieses Protokoll stellt spezifische Präparationsschritte für Quantenpunkt-Nanokügelchen (QDNB), QDNB- und Antikörperkonjugation, die Herstellung von QDNB-basierter LFIA und die Messung von C-reaktivem Protein (CRP) in humanen Plasmaproben vor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Herstellung von Quantenpunkt-Nanokügelchen (QDNB)27 und die Verwendung von QDNB zur Herstellung von fluoreszierenden Lateral-Flow-Immunoassays (LFIA). Die qualitative und quantitative Messung von CRP in Proben wird demonstriert. Diese QDNB-basierte LFIA kann auch auf andere Krankheitsbiomarker25,32, Lebensmitteltoxine29,30, Viren<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Projekt des Shanghai Science and Technology Committee (STCSM) (22S31902000) und das Clinical Research Incubation Program des Shanghai Skin Disease Hospital (NO. lcfy2021-10) unterstützt.
Materials
| (dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03450 | |
| Absorbance paper | Kinbio Biotech | CH37K | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | B2064 | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| CdSe/ZnS quantum dot | Suzhou Mesolight Inc. | CdSe/ZnS-625 | |
| Choloroform | Sino Pharm | 10006818 | |
| CRP antibody | Hytest Biotech | 4C28 | |
| Fluorescent lateral flow assay reader | Suzhou Helmence Precision Instrument | FIC-H1 | |
| Glass fiber pad | Kinbio Biotech | SB06 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D111018 | |
| Nitrocellulose membrane | Satorious | CN140 | |
| Poly(styrene-maleic anhydride) copolymer | Sigma-Aldrich | S458066 | |
| Rabbit IgG | Sangon Biotech | D110502 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sino Pharm | 30166428 | |
| Sodium hydroxide | Sino Pharm | 10019718 |
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