Yüksek Verimli ve Kantitatif Lüminesans Tabanlı Raportör Testleri Kullanılarak DNA Çift İplikli Kırılma Onarım Aktivitesinin Değerlendirilmesi
Summary
Bir dizi lüminesans tabanlı ekstrakromozomal raportör substrat kullanarak hücrelerde çift iplikli kopma onarım yolu yeterliliğinin değerlendirilmesi için protokoller sunuyoruz.
Abstract
DNA çift iplikçik kırılmalarının (DSB’ler) onarımı, genom stabilitesinin ve hücre canlılığının korunması için çok önemlidir. Hücrelerde DSB onarımına (DSBR) çeşitli mekanizmalar aracılık eder: homolog rekombinasyon (HR), homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ), mikrohomoloji aracılı uç birleştirme (MMEJ) ve tek iplikli tavlama (SSA). Hücresel tahliller, çeşitli uyaranlara yanıt olarak bu yolların yeterliliğini ve modülasyonunu ölçmek için gereklidir.
Burada, her biri hücrelerdeki dört ana DSBR yolundan biri tarafından bir nanolusiferaz raportör geninin sulandırılmasını ölçen bir dizi ekstrakromozomal raportör testi sunuyoruz. İlgilenilen hücrelere geçici transfeksiyon üzerine, yola özgü raportör substratların onarımı, Nanolusiferaz (NanoLuc) lüminesansının tespiti ile 24 saatin altında ölçülebilir.
Bu sağlam tahliller kantitatif, hassas, titre edilebilir ve yüksek verimli bir tarama formatına uygundur. Bu özellikler, DNA onarım araştırmalarında ve ilaç keşfinde geniş uygulamalar sağlar ve şu anda mevcut olan hücresel DSBR tahlilleri araç setini tamamlar.
Introduction
DNA çift iplikçik kırılmaları (DSB’ler), hücrelerin bu lezyonları onarmak için çoklu DSB onarım (DSBR) yolları geliştirmesi nedeniyle özellikle toksik bir DNA hasarı1 sınıfını temsil eder. Dört ana DSBR mekanizması, homolog rekombinasyon (HR), homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ), mikrohomoloji aracılı uç birleştirme (MMEJ) ve tek iplikli tavlamadır (SSA)2,3. DSBR yolakları, sağlıklı doku gelişiminin ve fizyolojisinin korunmasına katkıda bulunur ve kanser gibi hastalıklara karşı koruma sağlar. Ayrıca, bu onarım mekanizmaları, hassas onkolojide küçük molekül modülatörlerinin geliştirilmesi için terapötik potansiyele sahiptir. Örneğin, MMEJ onarım yolunda çok önemli bir enzim olan DNA Polimeraz θ’yi (Polθ) hedeflemek, kanserde HR eksikliği ile sentetik ölümcüllüğü nedeniyle ilgi çekmiştir4.
Bu nedenle DSBR’yi anlamak geniş klinik etkilere sahiptir ve tüm ana DSBR yollarının aktivitesini ölçebilen fonksiyonel hücresel tahlillere ihtiyaç vardır5. Tahliller hem genetik hem de farmakolojik sorgulama için uygun olmalı ve ilgilenilen hücre modellerinde konuşlandırılabilir olmalıdır. Küçük moleküllü ilaç keşif çabalarını desteklemek için, tahlillerin son derece hassas olması, titre edilebilir olması, hızlı bir geri dönüşe sahip olması ve bileşik taraması için uygun yüksek verimli formatlara ölçeklenebilir olması gerekir.
Genel olarak, DSBR daha önce hücre genomuna6 kararlı bir şekilde entegre edilmiş floresan tabanlı raportör tahlil sistemleri kullanılarak ölçülmüştür. Bununla birlikte, kromozomal DSBR’nin fizyolojik rekapitülasyonu belirgin bir avantaj olsa da, bu tür tahliller, raportörün entegre edildiği, emek yoğun numune hazırlama ve akış sitometrisi ile analiz kullandığı ve sınırlı verim, geri dönüş süresi, sağlamlık ve duyarlılığa sahip olduğu bir konak modelle sınırlıdır, ilaç keşif çabaları için gerekli tüm temel özellikler.
Burada, dört ana DSBR yolunun değerlendirilmesine izin veren bir dizi DSBR raportör tahlilini açıklıyoruz. Raportör tahlil substratları paketi Şekil 1’de özetlenmiştir ve yakın tarihli bir yayın7’de daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Ekstrakromozomaldirler, basit geçici transfeksiyon yoluyla hücrelere girmelerine izin verirler ve belirli DSBR mekanizmaları ile etkileşime girerek yeniden yapılandırılması gereken bir nanolusiferaz raportör gen8’in dahil edilmesi, duyarlılık, sağlamlık ve ölçeklenebilirlik sağlar. Aşağıdaki DSBR raportör substrat varyantları protokole dahil edilmiştir (Şekil 1):
Rezeksiyondan bağımsız MMEJ: Bu doğrusal substrat, rezeke edilmiş DNA uçları9’u taklit eden tek sarmallı DNA (ssDNA) çıkıntılarına sahip bir çekirdek çift sarmallı DNA (dsDNA) bölgesinden oluşur. ssDNA bölgelerinin terminalindeki dört nükleotid mikrohomolojisi, raportör gen için başlangıç kodonunu kodlar. Bu substratın MMEJ yoluyla onarımı, raportör gen açık okuma çerçevesini (ORF) geri yükler.
Rezeksiyona bağımlı MMEJ: N-terminal raportör gen ekzonu, 8 baz çifti (bp) mikrohomoloji ile çevrili bir durdurma kodonu içeren bir segment tarafından kesilir. Sağlam raportör geni eski haline getirmek için MMEJ aracılı onarımdan önce nükleolitik uç rezeksiyonu gereklidir.
Künt NHEJ: Raportör gen, N ve C terminal bölümlerine ayrılır ve bunlardan ikincisi promotörün yukarısına yerleştirilir. DSB, EcoRV kullanılarak üretilir ve hem raportör gen bölümlerinin yeniden birleştirilmesi hem de raportör ORF’nin geri yüklenmesi için NHEJ tarafından doğrudan ligasyon (son işleme olmadan) gerektirir.
Künt olmayan NHEJ: DSB bir intron içinde bulunur ve restriksiyon enziminin seçimine bağlı olarak kohezif veya kohezif olmayan uçlara sahip olacaktır. Bu alt tabakanın NHEJ tarafından onarımı, ligasyonun son işlemden önce yapılmasını gerektirir.
Uzun şablon İK: Raportör genin N-terminal ekzonu, orijinal raportör gen dizisinin 22 bp’sinin yerini alan kısıtlama bölgelerini içeren bir DNA segmenti tarafından kesilir. Bu diziyi geri yüklemek için, HR ile onarım, C-terminal eksonunun akış aşağısına yerleştirilen 2,5 kilobaz (kb) homoloji şablonunu kullanır.
Kısa şablon İK: DSB’yi oluşturmak için gereken kısıtlama bölgesi, yerel raportör gen dizisinin bir kısmının yerini alır ve çerçeve içi bir durdurma kodonu sunar. Uzun şablon sürümü gibi, bu HR alt tabakası da raportör ORF’nin doğru onarımı ve geri yüklenmesi için aşağı akış homoloji şablonunu (360 bp) gerektirir.
SSA: Bu substrat, raportör genin N-terminal ekzonu içinde bulunan bir erken durdurma kodonu içerir. Bu durdurma kodonunun çıkarılması ve sağlam raportör gen dizisinin eski haline getirilmesi, homolojilerin hizalanmasından önce iki yönlü uzun menzilli rezeksiyonu içeren SSA ile onarım gerektirir.
DSB’nin üretilmesi için, raportör substratların bir kısmı I-SceI ile sindirilebilir (Şekil 1). Bu, ters oryantasyonlarda tandem I-SceI bölgelerine sahip rezeksiyona bağımlı MMEJ, künt olmayan NHEJ, uzun şablon HR ve SSA raportörlerinde kohezif olmayan uçlara sahip doğrusal bir substrat oluşturacaktır. Kısa şablon HR raportör substratında, tek I-SceI sitesinin sindirimi uyumlu uçlar oluşturacaktır. Künt olmayan NHEJ, rezeksiyona bağımlı MMEJ, uzun şablon HR ve SSA plazmitleri de HindIII ile sindirilebilir, bu da tamamlayıcı kohezif uçlar üretecektir.
Raportör tahlil substratlarının oluşturulması için protokoller sağlıyoruz ve tahlillerin nasıl gerçekleştirilebileceğini açıklıyoruz, küçük moleküllere titre edilebilir yanıtlar, hücresel gücün, hedef üzerindeki aktivitenin ve yol seçiciliğinin değerlendirilmesi dahil olmak üzere DSBR’yi ölçmek için nasıl kullanılabileceğine dair ayrıntılar sağlıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, dört ana DSBR yolunun (HR, NHEJ, MMEJ ve SSA) hücresel yeterliliğini ölçmek için bir dizi ekstrakromozomal lüminesans tabanlı raportörün oluşturulması ve uygulanması için protokolleri tanımladık7. Raportör substratlar, geçici transfeksiyon yoluyla hücrelere sokulabilir ve aynı kökenli hücresel DSBR yolakları ile etkileşime girdikten sonra yeniden oluşturulan hassas ve sağlam bir plaka bazlı NanoLuc lüminesans okuması kullanılarak DSBR aktivitesini değerlendirmek için kullanılabilir.
Raportör substrat üretiminin çeşitli aşamaları, substratların hücrelere transfeksiyonu ve veri yorumlama, bu tahlillerin başarılı bir şekilde yürütülmesi için kritik öneme sahiptir. Raportör substratları oluşturmak için standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılsa da, sürecin jel elektroforezi ile görselleştirilmesi, transfeksiyondan önce substratların en yüksek kalitesini ve saflığını sağlar. Bu tahliller geçici transfeksiyona bağlı olduğundan, bu yöntemler için ortak hususlar geçerlidir. Bunlar, tohumlama yoğunluğunun, transfeksiyon koşullarının (reaktifler ve DNA miktarları dahil) optimize edilmesini ve ileri ve geri transfeksiyon formatlarında uygunluğun değerlendirilmesini içerir. Bu raportör tahlilleri, bir dizi elektroporasyon ve lipofeksiyon protokolü ile başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir ve bu tahliller yapılmadan önce seçenekler tam olarak araştırılmalıdır. Ayrıca, NanoLuc sinyalinin (raportör substratı) Firefly sinyaline (kontrol) normalleştirilmesiyle türetilen kompozit onarım sinyali yerine, bileşen NanoLuc ve Firefly sinyallerinin incelenmesine de özen gösterilmelidir. Artefaktlar, Firefly sinyalindeki değişiklikler tarafından yönlendirilen orandan kaynaklanabilir. Örneğin, oldukça spesifik bir bileşik kullanılarak doz-yanıt modunda inhibisyonu değerlendirmek, NanoLuc sinyalini, kararlı kalması gereken Firefly sinyalini bozmadan titre edilebilir bir şekilde bastırmalıdır (Şekil 4G, H). Bununla birlikte, Firefly sinyallerinin bozulduğu durumlarda, Firefly sinyalinin etkilenmediği bir doz penceresi belirlenerek onarım üzerindeki yararlı etkiler yine de belirlenebilir (Şekil 5).
En sık kullanılan DSBR raportör tahlilleri ile karşılaştırıldığında, bu ekstrakromozomal lüminesans tabanlı raportör tahlillerinin bazı belirgin avantajları vardır. DSBR yolları yüksek oranda korunduğundan, hücresel makineler hücre modelleri arasında farklılık gösterse bile, tahliller yine de DSBR yeterliliği ve yol seçimi hakkında rapor verebilir. Bu, DSBR’nin değerlendirmesini, optimum geçici transfeksiyon koşulları önceden oluşturulduğu sürece, kullanıcının ilgilendiği herhangi bir modele açar.
Raportör gen olarak Nanolusiferaz’ın kullanılması, DSBR raportör tahlillerinde geleneksel olarak kullanılan floresan seçeneklerine göre de avantajlar sunar. NanoLuc hızlı olgunlaşır ve lüminesans, bir plaka okuyucu8 kullanılarak yüksek hassasiyetle tespit edilir. Substrat onarımının hızıyla birleştiğinde (raportör substratlar, onarıma hazır DSB uçlarına sahip hücrelere transfekte edildiğinden), bu DSBR raportör testi formatı, endüstriyel bir ilaç keşif kademesinin bir parçası olarak küçük molekülleri taramak için gereken hızlı geri dönüş ve kantitatif sağlamlık için idealdir. Gerçekten de, yakın zamanda, Polθ polimeraz alanı13’ün küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanması için kullanılan keşif kaskadında rezeksiyondan bağımsız MMEJ raportör testinin uygulanmasını tanımladık.
DSBR’nin genetik ve farmakolojik bozulmaları hakkında spesifik soruları ele almak için raportör testlerinin uygulanmasında da esneklik vardır (Şekil 3). Örneğin, raportör substratların transfeksiyonundan önce, hücreler 48-72 saat boyunca ilgilenilen bir gene karşı siRNA ile transfekte edilebilir. Alternatif olarak, gen aşırı ekspresyonunun DSBR yolakları üzerindeki etkileri, raportör substratların transfeksiyonundan 24-48 saat önce plazmit transfeksiyonu gerçekleştirilerek test edilebilir. Farmakolojik çalışmalar için, mevcut protokol zaten küçük moleküllerin kullanımının standart iş akışına nasıl dahil edilebileceğini açıklamaktadır, ancak alternatif formatlar, ön inkübasyonlar veya yıkamalar gibi bileşik tedavi rejimlerinde değişiklikler içerebilir.
Geçici transfeksiyonun ölçeklenebilirliği, raportör substratlarının toplu transfeksiyonunun taramadan önce gerçekleştirildiği büyük ölçekli tarama yaklaşımlarını da destekleyebilir. Ayrıca, transfeksiyondan okumaya kadar testin süresi de değişebilir. Standart süreler 16-24 saat olabilse de, bazı testler 6 saat gibi kısa bir sürede okunabilir7. Hücre canlılığını tehlikeye atabilecek küçük moleküllerden veya siRNA’dan kaynaklanan toksisite ile ilgili endişeler de test süresinin belirlenmesinde dikkate alınmalıdır.
Özetle, bu çalışmada özetlenen ve yakın tarihli bir yayında7 tam olarak açıklanan tahliller, hücresel DSBR yeterliliğinin hızlı ve sağlam bir değerlendirmesini sağlar. Oldukça hassas ve titre edilebilirler, bu da onları hem genetik hem de farmakolojik çalışmalara uygun hale getirir. En önemlisi, raportör substratlar geçici transfeksiyon yoluyla hücrelere sokulabildiğinden, kromozomal DSBR raportörlerinde olduğu gibi kararlı entegrasyon ile belirli hücre hatlarıyla sınırlı kalmak yerine, ilgilenilen herhangi bir transfekte edilebilir hücre modelinde kullanılma potansiyeline sahiptirler. Bununla birlikte, bu raportör ekstrakromozomal tahlillerin belirgin bir sınırlaması, genoma entegrasyon eksikliğinin, DNA onarımının fizyolojik, kromatinize bağlamını ve bununla ilişkili düzenleyici ipuçlarını ve orkestrasyonunu tam olarak özetleyemeyebilmesidir15. Bu amaçla, ekstrakromozomal raportör tahlilleri, mevcut DSBR değerlendirme yöntemlerini tamamlayıcı niteliktedir ve hem temel araştırma hem de ilaç keşfi için uygun kaynak araç setini genişletir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tüm çalışmalar Artios Pharma Ltd. tarafından finanse edildi. Şekil 1 ve Şekil 3 Biorender.com ile oluşturuldu.
Materials
| 10x TBE buffer | Thermo Fisher | AM9863 | |
| 20% TBE-acrylamide gel | Invitrogen | EC6315BOX | |
| 50x TAE buffer | Fisher Scientific | BP13321 | |
| 6x Gel Loading Dye, Purple | NEB | B7024S | |
| 96-well white plate (with transparent bottom and lid) | Porvair | 204012 | |
| Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | For bead-based purification of DNA |
| Antarctic phosphatase and 10X buffer | NEB | M0289L | |
| CLARIOstar | BMG Labtech | 430-101 | Plate reader |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Cell counter |
| Custom oligonucleotides | Sigma-Aldrich | Custom order | For resection-independent MMEJ substrate. See Table 2. |
| D300e | Tecan | 30100152 | DMSO-based compound dispenser |
| D300e D4+ cassette | Tecan | 30097371 | High volume cassette for D300e compound dispenser |
| D300e T8+ cassette | Tecan | 30097370 | Low volume cassette for D300e compound dispenser |
| Dimethyl sulfoxide, cell culture grade | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehicle for compounds, used in Figure 4 and Figure 5 |
| DSBR reporter source plasmids | Artios | Available to the academic community upon request | |
| EcoRV-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3195M | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.365 | |
| Foetal Bovine Serum | PAN-Biotech | P30-3031 | |
| GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder | Thermo Fisher | SM1211 | Low molecular weight DNA ladder |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | Example cell line used in protocol |
| HindIII-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3104M | |
| HyClone Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | 10275262 | |
| I-SceI and 10x Tango Buffer | Invitrogen | ER1771 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.33 | |
| JetPRIME reagent and buffer | PolyPlus | 114-15 | Lipid-based transfection reagent |
| MegaStar 1.6 | VWR | 521-1749 | Centrifuge for 15 or 50 mL tubes |
| MEM Eagle | PAN-Biotech | P04-08056 | Culture medium for HEK-293 cells |
| Microplate shaker | Fisherbrand | 15504070 | Microplate orbital shaker |
| MicroStar 17R | VWR | 521-1647 | Centrifuge for 1.5 or 2 mL tubes |
| MultiDrop | Thermo Fisher | 5840300 | Cell or water-based reagent dispenser |
| MultiDrop Standard Cassette | Thermo Fisher | 24072670 | Cassette for MultiDrop reagent dispenser |
| NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Reporter luciferase (NanoLuc) reagent to quench Firefly luminescence and detect NanoLuc luminescence. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
| ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Control luciferase (Firefly) assay reagent to detect Firefly. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
| PBS (without calcium or magnesium) | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| pGL4 Firefly plasmid (or similar) | Promega | E1310 (or equivalent) | Firefly control plasmid |
| pNL1.1 NanoLuc plasmid (or similar) | Promega | N1091 (or equivalent) | NanoLuc control plasmid, for adjustment of equipment settings/optimisation experiments |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder | NEB | N0552S | High molecular weight DNA ladder |
| Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 | Thermo Fisher | AM9740 | For pH adjustment during gel extraction with QIAquick Gel Extraction Kit |
| SYBR Gold (10,000x) | Invitrogen | S11494 | For visualisation of ssDNA and dsDNA |
| SYBR Safe (10,000x) | Invitrogen | S33102 | For visualisation of dsDNA only |
| T4 DNA Ligase and 10x Ligase buffer | NEB | M0202L | |
| Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | For measurement of viability during cell counting |
| Trypsin-EDTA solution; 0.25% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| XhoI and 10x CutSmart buffer | NEB | R0146M |
References
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).
- Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).
- Ceccaldi, R., et al. Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair. Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).
- van de Kooij, B., van Attikum, H. Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks. Front Genet. 12, 809832 (2021).
- Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).
- Rajendra, E., et al. titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells. Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- Wyatt, D. W., et al. Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks. Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).
- Wood, R. D., Doublié, S. Genome protection by DNA polymerase θ. Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).
- Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Mol Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
- Zatreanu, D., et al. Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance. Nat Commun. 12 (1), 3636 (2021).
- Stockley, M. L., et al. Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta. J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).
- Scott, D. E., et al. A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death. Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847 (2021).
- Schep, R., et al. Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance. Mol Cell. 81 (10), 2216-2230 (2021).
