Bewertung der Reparaturaktivität von DNA-Doppelstrangbrüchen mit Hilfe von Hochdurchsatz- und quantitativen Lumineszenz-basierten Reporter-Assays
Summary
Wir präsentieren Protokolle zur Bewertung der Kompetenz des Doppelstrangbruch-Reparaturwegs in Zellen unter Verwendung einer Reihe von lumineszenzbasierten extrachromosomalen Reportersubstraten.
Abstract
Die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Genomstabilität und der Zellviabilität. Die DSB-Reparatur (DSBR) in Zellen wird durch mehrere Mechanismen vermittelt: homologe Rekombination (HR), nicht-homologe Endverbindung (NHEJ), Mikrohomologie-vermittelte Endverbindung (MMEJ) und Einzelstrang-Annealing (SSA). Zelluläre Assays sind unerlässlich, um die Leistungsfähigkeit und Modulation dieser Signalwege als Reaktion auf verschiedene Reize zu messen.
Hier stellen wir eine Reihe von extrachromosomalen Reporter-Assays vor, die jeweils die Rekonstitution eines Nanoluziferase-Reportergens über einen der vier wichtigsten DSBR-Signalwege in Zellen messen. Nach transienter Transfektion in interessierende Zellen kann die Reparatur von signalwegspezifischen Reportersubstraten in weniger als 24 Stunden durch den Nachweis von Nanoluciferase (NanoLuc) Lumineszenz gemessen werden.
Diese robusten Assays sind quantitativ, sensitiv, titraierbar und eignen sich für ein Hochdurchsatz-Screening-Format. Diese Eigenschaften bieten breite Anwendungen in der DNA-Reparaturforschung und Wirkstoffforschung und ergänzen das derzeit verfügbare Toolkit an zellulären DSBR-Assays.
Introduction
DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) stellen eine besonders toxische Klasse von DNA-Schäden1 dar, aufgrund derer Zellen mehrere DSB-Reparaturwege (DSBR) entwickelt haben, um diese Läsionen zu reparieren. Die vier wichtigsten DSBR-Mechanismen sind die homologe Rekombination (HR), die nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ), die mikrohomologievermittelte Endverknüpfung (MMEJ) und das Einzelstrangglühen (SSA)2,3. DSBR-Signalwege tragen zur Aufrechterhaltung einer gesunden Gewebeentwicklung und -physiologie bei und schützen vor Krankheiten wie Krebs. Darüber hinaus bergen diese Reparaturmechanismen therapeutisches Potenzial für die Entwicklung von niedermolekularen Modulatoren in der Präzisionsonkologie. Zum Beispiel hat die Ausrichtung auf die DNA-Polymerase θ (Polθ), ein zentrales Enzym im MMEJ-Reparaturweg, aufgrund seiner synthetischen Letalität bei HR-Mangel bei Krebs Interesse geweckt4.
Das Verständnis von DSBR hat daher weitreichende klinische Implikationen, und es werden funktionelle zelluläre Assays benötigt, die in der Lage sind, die Aktivität aller wichtigen DSBR-Signalwege zu messen5. Die Assays müssen sowohl für genetische als auch für pharmakologische Untersuchungen geeignet sein und in allen interessierenden Zellmodellen eingesetzt werden können. Um die Entwicklung niedermolekularer Wirkstoffe zu unterstützen, müssen die Assays hochempfindlich und titraierbar sein, eine schnelle Durchlaufzeit aufweisen und auf Hochdurchsatzformate skalierbar sein, die für das Wirkstoffscreening geeignet sind.
Im Allgemeinen wurde DSBR bisher mit fluoreszenzbasierten Reporter-Assay-Systemen gemessen, die stabil in das Zellgenom integriert waren6. Obwohl die physiologische Rekapitulation des chromosomalen DSBR ein deutlicher Vorteil ist, sind solche Assays auf ein Wirtsmodell beschränkt, in das der Reporter integriert ist, nutzen eine arbeitsintensive Probenvorbereitung und -analyse mittels Durchflusszytometrie und weisen einen begrenzten Durchsatz, eine begrenzte Durchlaufzeit, Robustheit und Empfindlichkeit auf, alles wesentliche Merkmale, die für die Wirkstoffforschung erforderlich sind.
Im Folgenden beschreiben wir eine Reihe von DSBR-Reporter-Assays, die eine Bewertung der vier wichtigsten DSBR-Signalwege ermöglichen. Die Suite der Reporter-Assay-Substrate ist in Abbildung 1 skizziert und in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichungnäher beschrieben 7. Sie sind extrachromosomal und ermöglichen ihre Einführung in Zellen durch einfache vorübergehende Transfektion, und der Einbau eines Nanoluziferase-Reportergens8, das durch die Interaktion mit spezifischen DSBR-Mechanismen rekonstituiert werden muss, erzeugt Sensitivität, Robustheit und Skalierbarkeit. Die folgenden DSBR-Reportersubstratvarianten sind im Protokoll enthalten (Abbildung 1):
Resektionsunabhängiges MMEJ: Dieses lineare Substrat besteht aus einer Kernregion doppelsträngiger DNA (dsDNA) mit einzelsträngigen DNA-Überhängen (ssDNA), die resezierte DNA-Endennachahmen 9. Vier Nukleotid-Mikrohomologien an den Enden der ssDNA-Regionen kodieren für das Startcodon für das Reportergen. Die Reparatur dieses Substrats durch MMEJ stellt den offenen Leserahmen (ORF) des Reportergens wieder her.
Resektionsabhängige MMEJ: Das Exon des N-terminalen Reportergens wird durch ein Segment unterbrochen, das ein Stoppcodon enthält, das von 8 Basenpaaren (bp) Mikrohomologien flankiert wird. Vor der MMEJ-vermittelten Reparatur ist eine nukleolytische Endresektion erforderlich, um das intakte Reportergen wiederherzustellen.
Stumpfer NHEJ: Das Reportergen wird in N- und C-terminale Abschnitte aufgeteilt, wobei letzterer dem Promotor vorgeschaltet ist. Das DSB wird unter Verwendung von EcoRV hergestellt und erfordert eine direkte Ligation (ohne Endverarbeitung) durch NHEJ, damit beide Reportergenteile wieder verbunden und der Reporter-ORF wiederhergestellt werden kann.
Nicht stumpfes NHEJ: Das DSB befindet sich in einem Intron und hat je nach Wahl des Restriktionsenzyms kohäsive oder nicht-kohäsive Enden. Die Reparatur dieses Substrats durch NHEJ erfordert eine Ligation, der eine Endverarbeitung vorausgeht.
Lange Vorlage HR: Das N-terminale Exon des Reportergens wird durch ein DNA-Segment unterbrochen, das Restriktionsstellen enthält, die 22 bp der ursprünglichen Reportergensequenz ersetzen. Um diese Sequenz wiederherzustellen, wird bei der Reparatur durch HR die Homologievorlage mit 2,5 Kilobasen (kb) verwendet, die stromabwärts des C-terminalen Exons platziert sind.
Kurzvorlage HR: Die Restriktionsstelle, die zur Erzeugung des DSB benötigt wird, ersetzt einen Teil der nativen Reportergensequenz und führt ein In-Frame-Stoppcodon ein. Wie die lange Template-Version benötigt auch dieses HR-Substrat das Downstream-Homologie-Template (360 bp) für eine genaue Reparatur und Wiederherstellung des Reporter-ORF.
SSA: Dieses Substrat enthält ein vorzeitiges Stoppcodon, das sich im N-terminalen Exon des Reportergens befindet. Die Entfernung dieses Stoppcodons und die Wiederherstellung der intakten Reportergensequenz erfordert eine Reparatur durch SSA, die eine bidirektionale Langstreckenresektion vor dem Alignment der Homologien beinhaltet.
Zur Erzeugung des DSB können einige der Reportersubstrate mit I-SceI verdaut werden (Abbildung 1). Dadurch wird ein lineares Substrat mit nicht-kohäsiven Enden in den resektionsabhängigen MMEJ-, nicht-stumpfen NHEJ-, Long-Template-HR- und SSA-Reportern erzeugt, die Tandem-I-Sce I-Stellenin invertierten Orientierungen aufweisen. Im kurzen Template-HR-Reportersubstrat erzeugt der Aufschluss der einzelnen I-Sce I-Stellekohäsive Enden. Die nicht-stumpfen NHEJ-, resektionsabhängigen MMEJ-, Long-Template-HR- und SSA-Plasmide können auch mit HindIII verdaut werden, wodurch komplementäre kohäsive Enden erzeugt werden.
Wir stellen Protokolle für die Generierung der Reporter-Assay-Substrate zur Verfügung und beschreiben, wie die Assays durchgeführt werden können, und liefern Details darüber, wie sie zur Quantifizierung von DSBR verwendet werden können, einschließlich titrierbarer Reaktionen auf kleine Moleküle, der Bewertung der zellulären Potenz, der On-Target-Aktivität und der Selektivität des Signalwegs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir Protokolle für die Generierung und Implementierung einer Reihe von extrachromosomalen Lumineszenz-basierten Reportern zur Messung der zellulären Kompetenz der vier wichtigsten DSBR-Signalwege (HR, NHEJ, MMEJ und SSA) beschrieben7. Reportersubstrate können durch transiente Transfektion in Zellen eingeführt und zur Beurteilung der DSBR-Aktivität verwendet werden, indem eine empfindliche und robuste plattenbasierte Auslesung der NanoLuc-Lumineszenz verwendet wird, die bei Interaktion mit verwandten zellulären DSBR-Signalwegen rekonstituiert wird.
Mehrere Stufen der Generierung von Reportersubstraten, der Transfektion der Substrate in Zellen und der Dateninterpretation sind entscheidend für die erfolgreiche Durchführung dieser Assays. Obwohl zur Erzeugung der Reportersubstrate Standardtechniken der Molekularbiologie verwendet werden, gewährleistet die Visualisierung des Prozesses durch Gelelektrophorese die höchste Qualität und Reinheit der Substrate vor der Transfektion. Da diese Assays auf transienter Transfektion beruhen, gelten für diese Methoden gängige Überlegungen. Dazu gehören die Optimierung der Aussaatdichte, der Transfektionsbedingungen (einschließlich Reagenzien und DNA-Mengen) und die Beurteilung der Eignung für Vorwärts- und Rückwärtstransfektionsformate. Diese Reporter-Assays wurden erfolgreich mit einer Reihe von Elektroporations- und Lipofektionsprotokollen durchgeführt, und die Optionen sollten vor der Durchführung dieser Assays vollständig untersucht werden. Es sollte auch darauf geachtet werden, die NanoLuc- und Firefly-Signale der Komponenten zu untersuchen und nicht nur das Komposit-Reparatursignal, das durch Normalisierung des NanoLuc-Signals (Reportersubstrat) auf das Firefly-Signal (Steuerung) abgeleitet wird. Artefakte können dadurch entstehen, dass das Verhältnis durch Änderungen im Firefly-Signal gesteuert wird. Zum Beispiel sollte die Beurteilung der Hemmung im Dosis-Wirkungs-Modus mit einer hochspezifischen Verbindung das NanoLuc-Signal auf titrierbare Weise unterdrücken, ohne das Firefly-Signal zu stören, das stabil bleiben sollte (Abbildung 4G,H). In Fällen, in denen Firefly-Signale gestört sind, können nützliche Auswirkungen auf die Reparatur jedoch immer noch bestimmt werden, indem ein Dosisfenster identifiziert wird, in dem das Firefly-Signal nicht beeinflusst wird (Abbildung 5).
Im Vergleich zu den am häufigsten verwendeten DSBR-Reporter-Assays haben diese extrachromosomalen Lumineszenz-basierten Reporter-Assays einige deutliche Vorteile. Da die DSBR-Signalwege hochgradig konserviert sind, können die Assays auch dann über die DSBR-Kompetenz und die Wahl des Signalwegs berichten, selbst wenn die zelluläre Maschinerie zwischen den Zellmodellen variiert. Dies eröffnet die Bewertung von DSBR für jedes Modell, das für den Benutzer von Interesse ist, solange im Voraus optimale transiente Transfektionsbedingungen festgelegt werden.
Die Verwendung von Nanoluciferase als Reportergen bietet auch Vorteile gegenüber fluoreszierenden Optionen, die traditionell in DSBR-Reporterassays verwendet werden. NanoLuc reift schnell und Lumineszenz wird mit einem Platten-Reader8 mit hoher Empfindlichkeit detektiert. In Verbindung mit der Geschwindigkeit der Substratreparatur (da die Reportersubstrate in Zellen mit reparaturbereiten DSB-Enden transfiziert werden) ist dieses Format des DSBR-Reporterassays ideal für die schnelle Abwicklung und quantitative Robustheit, die für das Screening kleiner Moleküle im Rahmen einer industriellen Wirkstoffforschungskaskade erforderlich sind. In der Tat haben wir kürzlich die Implementierung des resektionsunabhängigen MMEJ-Reporterassays in der Entdeckungskaskade beschrieben, die zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren der Polθ-Polymerasedomäne13 verwendet wird.
Es gibt auch Flexibilität bei der Implementierung der Reporter-Assays, um spezifische Fragen zu genetischen und pharmakologischen Störungen von DSBR zu beantworten (Abbildung 3). Zum Beispiel können Zellen vor der Transfektion der Reportersubstrate 48-72 h lang mit siRNA gegen ein Gen von Interesse transfiziert werden. Alternativ können die Auswirkungen einer Genüberexpression auf DSBR-Signalwege getestet werden, indem eine Plasmidtransfektion 24-48 Stunden vor der Transfektion der Reportersubstrate durchgeführt wird. Für pharmakologische Studien beschreibt das vorliegende Protokoll bereits, wie die Verwendung kleiner Moleküle in den Standard-Arbeitsablauf integriert werden kann, aber alternative Formate können Änderungen in den Behandlungsregimen der Verbindung beinhalten, wie z. B. Vorinkubationen oder Auswaschungen.
Die Skalierbarkeit der transienten Transfektion könnte auch groß angelegte Screening-Ansätze unterstützen, bei denen die Batch-Transfektion von Reportersubstraten vor dem Screening durchgeführt wird. Darüber hinaus kann auch die Dauer des Assays von der Transfektion bis zum Auslesen variiert werden. Obwohl die Standarddauern 16-24 Stunden betragen können, können einige Assays in nur 6 Stunden ausgelesen werden7. Bedenken hinsichtlich der Toxizität von kleinen Molekülen oder siRNAs, die die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen können, sollten bei der Bestimmung der Assay-Dauer ebenfalls berücksichtigt werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in dieser Studie skizzierten und in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung7 vollständig beschriebenen Assays eine schnelle und robuste Bewertung der zellulären DSBR-Kompetenz ermöglichen. Sie sind hochempfindlich und titraierbar, so dass sie sowohl für genetische als auch für pharmakologische Studien geeignet sind. Entscheidend ist, dass die Reportersubstrate, da sie durch transiente Transfektion in Zellen eingeführt werden können, das Potenzial haben, in jedem transfizierbaren Zellmodell von Interesse verwendet zu werden, anstatt durch stabile Integration auf bestimmte Zelllinien beschränkt zu sein, wie es bei chromosomalen DSBR-Reportern der Fall ist. Eine deutliche Einschränkung dieser extrachromosomalen Reporter-Assays besteht jedoch darin, dass die fehlende Integration in das Genom den physiologischen, chromatinisierten Kontext der DNA-Reparatur und die damit verbundenen regulatorischen Signale und Orchestrierung möglicherweise nicht vollständig rekapituliert15. Zu diesem Zweck ergänzen extrachromosomale Reporter-Assays die bestehenden Methoden der DSBR-Bewertung und erweitern das Instrumentarium an Ressourcen, die sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die Wirkstoffforschung geeignet sind.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle Arbeiten wurden von Artios Pharma Ltd. finanziert. Abbildung 1 und Abbildung 3 wurden mit Biorender.com erstellt.
Materials
| 10x TBE buffer | Thermo Fisher | AM9863 | |
| 20% TBE-acrylamide gel | Invitrogen | EC6315BOX | |
| 50x TAE buffer | Fisher Scientific | BP13321 | |
| 6x Gel Loading Dye, Purple | NEB | B7024S | |
| 96-well white plate (with transparent bottom and lid) | Porvair | 204012 | |
| Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | For bead-based purification of DNA |
| Antarctic phosphatase and 10X buffer | NEB | M0289L | |
| CLARIOstar | BMG Labtech | 430-101 | Plate reader |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Cell counter |
| Custom oligonucleotides | Sigma-Aldrich | Custom order | For resection-independent MMEJ substrate. See Table 2. |
| D300e | Tecan | 30100152 | DMSO-based compound dispenser |
| D300e D4+ cassette | Tecan | 30097371 | High volume cassette for D300e compound dispenser |
| D300e T8+ cassette | Tecan | 30097370 | Low volume cassette for D300e compound dispenser |
| Dimethyl sulfoxide, cell culture grade | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehicle for compounds, used in Figure 4 and Figure 5 |
| DSBR reporter source plasmids | Artios | Available to the academic community upon request | |
| EcoRV-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3195M | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.365 | |
| Foetal Bovine Serum | PAN-Biotech | P30-3031 | |
| GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder | Thermo Fisher | SM1211 | Low molecular weight DNA ladder |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | Example cell line used in protocol |
| HindIII-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3104M | |
| HyClone Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | 10275262 | |
| I-SceI and 10x Tango Buffer | Invitrogen | ER1771 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.33 | |
| JetPRIME reagent and buffer | PolyPlus | 114-15 | Lipid-based transfection reagent |
| MegaStar 1.6 | VWR | 521-1749 | Centrifuge for 15 or 50 mL tubes |
| MEM Eagle | PAN-Biotech | P04-08056 | Culture medium for HEK-293 cells |
| Microplate shaker | Fisherbrand | 15504070 | Microplate orbital shaker |
| MicroStar 17R | VWR | 521-1647 | Centrifuge for 1.5 or 2 mL tubes |
| MultiDrop | Thermo Fisher | 5840300 | Cell or water-based reagent dispenser |
| MultiDrop Standard Cassette | Thermo Fisher | 24072670 | Cassette for MultiDrop reagent dispenser |
| NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Reporter luciferase (NanoLuc) reagent to quench Firefly luminescence and detect NanoLuc luminescence. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
| ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Control luciferase (Firefly) assay reagent to detect Firefly. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
| PBS (without calcium or magnesium) | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| pGL4 Firefly plasmid (or similar) | Promega | E1310 (or equivalent) | Firefly control plasmid |
| pNL1.1 NanoLuc plasmid (or similar) | Promega | N1091 (or equivalent) | NanoLuc control plasmid, for adjustment of equipment settings/optimisation experiments |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder | NEB | N0552S | High molecular weight DNA ladder |
| Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 | Thermo Fisher | AM9740 | For pH adjustment during gel extraction with QIAquick Gel Extraction Kit |
| SYBR Gold (10,000x) | Invitrogen | S11494 | For visualisation of ssDNA and dsDNA |
| SYBR Safe (10,000x) | Invitrogen | S33102 | For visualisation of dsDNA only |
| T4 DNA Ligase and 10x Ligase buffer | NEB | M0202L | |
| Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | For measurement of viability during cell counting |
| Trypsin-EDTA solution; 0.25% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| XhoI and 10x CutSmart buffer | NEB | R0146M |
References
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