ハイスループットで定量的な発光ベースのレポーターアッセイを用いたDNA二本鎖切断修復活性の評価
Summary
私たちは、一連の発光ベースの染色体外レポーター基質を使用して、細胞内の二本鎖切断修復経路の習熟度を評価するためのプロトコルを提示します。
Abstract
DNA二本鎖切断(DSB)の修復は、ゲノムの安定性と細胞生存率の維持に重要です。細胞内のDSB修復(DSBR)は、相同組換え(HR)、非相同末端結合(NHEJ)、マイクロホモロジーを介した末端結合(MMEJ)、一本鎖アニーリング(SSA)など、いくつかのメカニズムを介して媒介されます。細胞アッセイは、さまざまな刺激に応答したこれらの経路の習熟度と調節を測定するために不可欠です。
ここでは、細胞内の4つの主要なDSBR経路の1つによるナノルシフェラーゼレポーター遺伝子の再構成をそれぞれが測定する一連の染色体外レポーターアッセイを紹介します。目的の細胞に一過性トランスフェクションすると、ナノルシフェラーゼ(NanoLuc)発光を検出することにより、経路特異的レポーター基質の修復を24時間未満で測定できます。
これらの堅牢なアッセイは、定量性、感度、滴定性があり、ハイスループットスクリーニングフォーマットに適しています。これらの特性は、DNA修復研究や創薬に幅広いアプリケーションを提供し、現在利用可能な細胞DSBRアッセイのツールキットを補完します。
Introduction
DNA二本鎖切断(DSB)は、細胞がこれらの病変を修復するために複数のDSB修復(DSBR)経路を進化させたため、特に毒性のあるDNA損傷1のクラスです。DSBRの4つの主要なメカニズムは、相同組換え(HR)、非相同末端結合(NHEJ)、ミクロホモロジー媒介端結合(MMEJ)、および一本鎖アニーリング(SSA)である2,3。DSBR経路は、健康な組織の発達と生理機能の維持に貢献し、がんなどの疾患から保護します。さらに、これらの修復メカニズムは、精密腫瘍学における低分子モジュレーターの開発に治療の可能性を秘めています。例えば、MMEJ修復経路の極めて重要な酵素であるDNAポリメラーゼθ(Polθ)を標的とすることは、がんにおけるHR欠損を伴う合成致死性により、関心を集めています4。
したがって、DSBRを理解することには広範な臨床的意味があり、すべての主要なDSBR経路の活性を測定できる機能的な細胞アッセイが必要です5。アッセイは、遺伝的および薬理学的調査の両方に適しており、関心のある細胞モデル全体に展開可能でなければなりません。低分子創薬の取り組みをサポートするためには、アッセイは高感度で滴定可能であり、ターンアラウンドが速く、化合物スクリーニングに適したハイスループットフォーマットにスケーラブルである必要があります。
一般に、DSBRは、細胞ゲノムに安定して組み込まれた蛍光ベースのレポーターアッセイシステムを使用して以前に測定されてきました6。しかし、染色体DSBRの生理学的再現は明確な利点ですが、そのようなアッセイは、レポーターが統合されたホストモデルに限定され、フローサイトメトリーによる労働集約的なサンプル調製と分析を利用し、創薬活動に必要なすべての重要な機能であるスループット、ターンアラウンドタイム、頑健性、感度が制限されています。
ここでは、4つの主要なDSBR経路の評価を可能にする一連のDSBRレポーターアッセイについて説明します。レポーターアッセイ基質のスイートは、 図1 に概説されており、最近の出版物7でさらに説明されています。それらは染色体外であり、単純な一過性トランスフェクションによって細胞への導入を可能にし、特定のDSBRメカニズムとの関与によって再構成する必要があるナノルシフェラーゼレポーター遺伝子8の取り込みは、感度、堅牢性、およびスケーラビリティを生み出します。このプロトコルには、以下のDSBRレポーター基質バリアントが含まれています(図1)。
切除非依存性MMEJ: この線状基質は、切除されたDNA末端9を模倣する一本鎖DNA(ssDNA)のオーバーハングを有するコア二本鎖DNA(dsDNA)領域から構成されている。ssDNA領域の末端にある4つのヌクレオチドマイクロホモロジーは、レポーター遺伝子の開始コドンをコードしています。この基質をMMEJで修復すると、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)が回復します。
切除依存性MMEJ: N末端レポーター遺伝子のエクソンは、8つの塩基対(bp)マイクロホモロジーに隣接する終止コドンを含むセグメントによって中断されます。MMEJを介した修復の前に、無傷のレポーター遺伝子を回復させるためには、核溶解性末端切除が必要です。
鈍的NHEJ: レポーター遺伝子はN末端とC末端に分割され、C末端はプロモーターの上流に配置されます。DSBは EcoRVを使用して産生され、レポーター遺伝子部分の再結合とレポーターORFの修復の両方に対して、NHEJによる直接ライゲーション(末端処理なし)が必要です。
ノンブラントNHEJ: DSBはイントロン内に位置し、制限酵素の選択に応じて、凝集性または非凝集性の末端を持ちます。NHEJによるこの基質の修復には、ライゲーションの前に末端処理が必要です。
長いテンプレートHR: レポーター遺伝子のN末端エクソンは、制限部位を含むDNAセグメントによって中断され、元のレポーター遺伝子配列の22 bpを置き換えます。この配列を復元するために、HRによる修復では、C末端エクソンの下流に配置された2.5キロベース(kb)の相同性テンプレートを使用します。
短いテンプレートHR: DSBを生成するために必要な制限部位は、ネイティブレポーター遺伝子配列の一部を置き換え、インフレーム停止コドンを導入します。長いテンプレートバージョンと同様に、このHR基質は、レポーターORFの正確な修復と修復のために、ダウンストリームの相同性テンプレート(360 bp)を必要とします。
SSAの この基質には、レポーター遺伝子のN末端エクソン内に位置する早期終止コドンが含まれています。この終止コドンの除去と無傷のレポーター遺伝子配列の回復には、相同性の整列に先立って双方向の長距離切除を行うSSAによる修復が必要です。
DSBの生成には、レポーター基質の一部をI-SceIで分解することができます(図1)。これにより、切除依存性MMEJ、非平滑NHEJ、長テンプレートHRおよびSSAレポーターに非凝集性末端を持つ線形基質が生成されます。ショートテンプレートHRレポーター基質では、単一のI-SceI部位の消化により凝集性末端が生成されます。非鈍的NHEJ、切除依存性MMEJ、長鎖テンプレートHRおよびSSAプラスミドもHindIIIで消化でき、相補的な凝集末端が生成されます。
レポーターアッセイ基質の作製のためのプロトコルを提供し、アッセイの実施方法を説明し、低分子への滴定可能な応答、細胞の効力、オンターゲット活性、および経路選択性の評価など、DSBRの定量にそれらをどのように使用できるかについて詳しく説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、4つの主要なDSBR経路(HR、NHEJ、MMEJ、およびSSA)の細胞能力を測定するための染色体外発光ベースのレポーターのスイートの生成と実装のためのプロトコルについて説明しました7。レポーター基質は、一過性トランスフェクションによって細胞に導入し、NanoLucルミネッセンスの高感度で堅牢なプレートベースの読み出しを使用してDSBR活性を評価するために使用できます。
レポーター基質の生成、細胞への基質のトランスフェクション、およびデータ解釈のいくつかの段階は、これらのアッセイを成功させるために重要です。レポーター基質の生成には標準的な分子生物学的手法が使用されますが、ゲル電気泳動でプロセスを可視化することで、トランスフェクション前に基質の最高品質と純度が保証されます。これらのアッセイは一過性トランスフェクションに依存しているため、これらの方法に共通の考慮事項が適用されます。これには、播種密度、トランスフェクション条件(試薬やDNA量を含む)の最適化、フォワードおよびリバーストランスフェクションフォーマットでの適合性の評価が含まれます。これらのレポーターアッセイは、さまざまなエレクトロポレーションおよびリポフェクションプロトコルで成功裏に実施されており、これらのアッセイを実行する前にオプションを十分に検討する必要があります。また、NanoLuc信号(レポーター基板)をFirefly信号(制御)に正規化して得られる複合修復信号だけでなく、NanoLucおよびFirefly信号の検査にも注意が必要です。アーティファクトは、Firefly信号の変化によって駆動される比率から発生する可能性があります。例えば、特異性の高い化合物を用いて用量反応モードでの阻害を評価すると、Fireflyシグナルを乱すことなくNanoLucシグナルを滴定可能な方法で抑制できるはずであり、これは安定しているはずです(図4G、H)。しかし、Fireflyの信号が摂動されている場合でも、Fireflyの信号が影響を受けない線量ウィンドウを特定することで、修復への有用な影響を判断できます(図5)。
最も頻繁に使用されるDSBRレポーターアッセイと比較して、これらの染色体外発光ベースのレポーターアッセイにはいくつかの明確な利点があります。DSBR経路は高度に保存されているため、細胞モデル間で細胞機構が異なる場合でも、アッセイはDSBRの習熟度と経路の選択を報告できます。これにより、最適な一過性トランスフェクション条件が事前に確立されている限り、ユーザーが関心のある任意のモデルに対してDSBRの評価が可能になります。
レポーター遺伝子としてナノルシフェラーゼを使用することは、DSBRレポーターアッセイで伝統的に使用されてきた蛍光オプションよりも利点もあります。NanoLucは成熟が早く、プレートリーダー8を用いて発光を高感度に検出します。このフォーマットのDSBRレポーターアッセイは、基質修復の速度(レポーター基質がすぐに修復可能なDSB末端を持つ細胞にトランスフェクションされる)と相まって、工業創薬カスケードの一部として低分子をスクリーニングするために必要な迅速なターンアラウンドと定量的堅牢性に最適です。実際、私たちは最近、Polθポリメラーゼドメイン13の低分子阻害剤の同定に使用される発見カスケードにおける切除非依存性MMEJレポーターアッセイの実施について説明しました。
また、レポーターアッセイの実施には柔軟性があり、DSBRの遺伝的および薬理学的摂動に関する特定の問題に対処することができます(図3)。例えば、レポーター基質のトランスフェクションに先立ち、細胞に目的の遺伝子に対するsiRNAを48〜72時間トランスフェクションすることができる。あるいは、DSBR経路に対する遺伝子過剰発現の影響は、レポーター基質のトランスフェクションの24〜48時間前にプラスミドトランスフェクションを行うことで試験できます。薬理学的研究のために、本プロトコルは、低分子の使用を標準的なワークフローにどのように組み込むことができるかをすでに説明していますが、代替フォーマットには、プレインキュベーションまたはウォッシュアウトなどの化合物処理レジメンの変更が含まれる場合があります。
一過性トランスフェクションのスケーラビリティは、スクリーニングの前にレポーター基質のバッチトランスフェクションを実行する大規模なスクリーニングアプローチもサポートできます。さらに、トランスフェクションからリードアウトまでのアッセイの期間も変化させることができます。標準的な持続時間は16〜24時間ですが、一部のアッセイはわずか6時間7で読み出される場合があります。また、低分子やsiRNAによる毒性が細胞の生存率を損なう可能性があることも、アッセイ期間を決定する際に考慮する必要があります。
要約すると、この研究で概説され、最近の出版物7 で詳細に説明されているアッセイは、細胞のDSBR習熟度の迅速かつ堅牢な評価を提供します。それらは非常に感度が高く、滴定可能なため、遺伝学的研究と薬理学的研究の両方に適しています。重要なことは、レポーター基質は一過性トランスフェクションによって細胞に導入できるため、染色体DSBRレポーターのように安定した統合によって特定の細胞株に限定されるのではなく、目的のトランスフェクション可能な細胞モデルで利用できる可能性があるということです。しかし、これらのレポーター染色体外アッセイの明確な制限は、ゲノムへの統合の欠如が、DNA修復の生理学的、クロマチン化された状況、およびそれに関連する調節手がかりおよびオーケストレーション15を完全に再現しない可能性があることである。この目的のために、染色体外レポーターアッセイは、既存のDSBR評価法を補完し、基礎研究と創薬の両方に適したリソースのツールキットを拡大します。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
すべての作業はArtios Pharma Ltd.によって資金提供されました。 図1 と 図3 は Biorender.com で作成されました。
Materials
| 10x TBE buffer | Thermo Fisher | AM9863 | |
| 20% TBE-acrylamide gel | Invitrogen | EC6315BOX | |
| 50x TAE buffer | Fisher Scientific | BP13321 | |
| 6x Gel Loading Dye, Purple | NEB | B7024S | |
| 96-well white plate (with transparent bottom and lid) | Porvair | 204012 | |
| Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | For bead-based purification of DNA |
| Antarctic phosphatase and 10X buffer | NEB | M0289L | |
| CLARIOstar | BMG Labtech | 430-101 | Plate reader |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Cell counter |
| Custom oligonucleotides | Sigma-Aldrich | Custom order | For resection-independent MMEJ substrate. See Table 2. |
| D300e | Tecan | 30100152 | DMSO-based compound dispenser |
| D300e D4+ cassette | Tecan | 30097371 | High volume cassette for D300e compound dispenser |
| D300e T8+ cassette | Tecan | 30097370 | Low volume cassette for D300e compound dispenser |
| Dimethyl sulfoxide, cell culture grade | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehicle for compounds, used in Figure 4 and Figure 5 |
| DSBR reporter source plasmids | Artios | Available to the academic community upon request | |
| EcoRV-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3195M | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.365 | |
| Foetal Bovine Serum | PAN-Biotech | P30-3031 | |
| GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder | Thermo Fisher | SM1211 | Low molecular weight DNA ladder |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | Example cell line used in protocol |
| HindIII-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3104M | |
| HyClone Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | 10275262 | |
| I-SceI and 10x Tango Buffer | Invitrogen | ER1771 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.33 | |
| JetPRIME reagent and buffer | PolyPlus | 114-15 | Lipid-based transfection reagent |
| MegaStar 1.6 | VWR | 521-1749 | Centrifuge for 15 or 50 mL tubes |
| MEM Eagle | PAN-Biotech | P04-08056 | Culture medium for HEK-293 cells |
| Microplate shaker | Fisherbrand | 15504070 | Microplate orbital shaker |
| MicroStar 17R | VWR | 521-1647 | Centrifuge for 1.5 or 2 mL tubes |
| MultiDrop | Thermo Fisher | 5840300 | Cell or water-based reagent dispenser |
| MultiDrop Standard Cassette | Thermo Fisher | 24072670 | Cassette for MultiDrop reagent dispenser |
| NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Reporter luciferase (NanoLuc) reagent to quench Firefly luminescence and detect NanoLuc luminescence. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
| ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Control luciferase (Firefly) assay reagent to detect Firefly. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
| PBS (without calcium or magnesium) | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| pGL4 Firefly plasmid (or similar) | Promega | E1310 (or equivalent) | Firefly control plasmid |
| pNL1.1 NanoLuc plasmid (or similar) | Promega | N1091 (or equivalent) | NanoLuc control plasmid, for adjustment of equipment settings/optimisation experiments |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder | NEB | N0552S | High molecular weight DNA ladder |
| Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 | Thermo Fisher | AM9740 | For pH adjustment during gel extraction with QIAquick Gel Extraction Kit |
| SYBR Gold (10,000x) | Invitrogen | S11494 | For visualisation of ssDNA and dsDNA |
| SYBR Safe (10,000x) | Invitrogen | S33102 | For visualisation of dsDNA only |
| T4 DNA Ligase and 10x Ligase buffer | NEB | M0202L | |
| Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | For measurement of viability during cell counting |
| Trypsin-EDTA solution; 0.25% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| XhoI and 10x CutSmart buffer | NEB | R0146M |
References
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