DREAMインプラント:頭部固定マウスと自由行動マウスの慢性電気生理学のための軽量でモジュール式で費用対効果の高いインプラントシステム

すべての実験手順は、マックス・プランク協会の制度ガイドラインに従って実施され、地方自治体の倫理委員会によって承認された(Beratende Ethikkommission nach §15 Tierschutzgesetz, Regierungspräsidium Hessen, Project approval code: F149-2000)。 図1:インプラントの設計(A)シリコンプローブをプローブコネクタに接続されたマウスの頭蓋骨に重ね合わせたインプラントの3Dレンダリング。ヘッドプレートの中央開口部はスケールのために約10mmです。ドライブの高さは約17mmです。ファラデークラウンの外側を形成する銅メッシュ、およびアース/参照線は示されていません。(B)(A)と同じで、プローブコネクタの代わりにアンプボードに接続されています。(C)インプラントの分解された技術図面、そのコンポーネントを示しています。(D)マイクロドライブの下に埋め込むことができる角度付きスペーサーのレンダリングにより、事前定義された角度(ここでは20°)でマイクロドライブを一貫して埋め込むことができます。(E)統合された頭部固定メカニズムのレンダリング、ファラデークラウン付きの埋め込みヘッドプレート、周囲の頭部固定クランプ、およびセットアップへのダブテール接続を示しています。(F)インプラントの統合された頭部固定機構を使用してトレッドミルに頭を固定したマウスの画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 注:セクション1と2では、術前の準備について説明します 1. シリコンプローブの調製 プローブを再利用する場合は、プローブ供給業者の推奨に従ってシリコンプローブを清掃してください。プローブを酵素クリーナー( 材料の表を参照)に5〜10分間浸し、脱塩水ですすいでください。これは、摘出後できるだけ早く行ってください。(再)移植の前日に、プローブを70%エタノールに少なくとも30分間浸して消毒します。 チャンネルインピーダンスを測定して、記録された信号の仕様内にあることを確認します。Neuropixelsユーザーマニュアル22のノイズレベルをテストするためのプロトコルに従い、目的の記録ソフトウェア(https://open-ephys.github.io/gui-docs/User-Manual/Plugins/Acquisition-Board.html#impedance-testing など)を介してインピーダンスを測定し、シリコンプローブの製造元またはデータシートのターゲットチャネルインピーダンスに従います。インピーダンスが高すぎる場合は、電極サイト23の再コーティングを検討してください。 0.05インチのはんだテールソケット( 材料の表を参照)をプローブのアース(GND)ワイヤーにはんだ付けします。手術中にソケットをGNDピンに接続します(次のステップ)。メモ:このプロトコルでは、GNDとREFが使用するヘッドステージで短絡するため、個別のリファレンス(REF)ピンは使用されません。したがって、プロトコルの残りの部分では GND ピンのみについて説明します。別の REF を使用する場合は、REF ピンに対して次の手順を繰り返します。 GNDピンを準備するには、0.05インチのはんだテールソケット( 材料の表を参照)のピン側をGND 0.05インチのはんだテールソケットに繰り返し挿入します。金メッキのピンを使用すると、この平滑化ステップの必要性を減らすことができます。これにより、手術中にGNDピンとソケットを簡単に接続でき、過度の圧力をかける必要がなくなり、動物の怪我やプローブの損傷のリスクが軽減されます。 シリコンプローブ用の埋め込み型プリアンプを使用する場合は、サプライヤーの手順に従って慢性的な埋め込みに備えてください。次に、シリコン石膏を使用してファラデーケージのリングにリファイア/コネクタを接着し、リファイアを保持するように設計されたファラデーリングの領域にリファイア/コネクタを取り付けます( 図1を参照)。注意: サプライヤーの手順に従って、シリコンプローブ用の埋め込み型プレアンプを準備するには、湿気による電子機器の損傷を防ぐためにシリコンまたはエポキシでコーティングすること、およびアンプコネクタを繰り返し嵌合して、録音中にアンプを録音システムに接続する際の嵌合力を減らすことが含まれる場合があります。これは、Omneticsのユーザーにとって特に便利です。 2. マイクロドライブとヘッドギアの準備 マイクロドライブ本体のネジを回して、マイクロドライブシャトルがほぼ完全に上向きに引っ込められるようにします。 オプションで、シアノアクリレート接着剤または歯科用セメントを使用してマイクロドライブの底部に角度付きスペーサー( 図1Dを参照)を取り付けます。これにより、たとえば、中央溝内の領域の皮質層を介して記録する場合や、垂直でないアプローチが必要になる可能性のある深い構造内で記録する場合など、特定の程度の傾きを使用できます(角度付きスペーサーの場合、 資料の表を参照)。 マイクロドライブをマイクロドライブホルダーに水平に置きます(補足図1)。 マイクロドライブホルダーのヘッドステージコネクタが配置されるマイクロドライブからの距離に、小さな接着剤パテ( 材料の表を参照)を置きます。この距離は、シリコンプローブをヘッドステージコネクタに接続するフレックスケーブルの長さによって異なります。 シャトルにシリコン石膏の小さな滴( 材料の表を参照)を置きます。 シリコンプローブをパッケージから取り出し、鈍くて先端が柔らかい鉗子を使用します。これらは、標準的なニードルノーズ鉗子を直径3mmの熱収縮チューブでコーティングして作成します( 材料の表を参照)。フレックスケーブル付きのプローブを最初にマイクロドライブのシャトルに置き、フレックスケーブルの下端がマイクロドライブシャトルの下端にわずかにぶら下がるようにします。 フレックスケーブルの下端がマイクロドライブシャトルの下端に接するまで、フレックスケーブルをマイクロドライブの上部に向かってゆっくりと引っ張ります。この手順では、フレックスケーブルをマイクロドライブシャトルの左端に押し付けて、マイクロドライブの端に正確に垂直に配置されるようにしてください。この時点で、シリコンプローブのシャンクがマイクロドライブの下端から突き出ていない(または最小限にしか出ていない)ことを確認します(プローブシャンクの正確な長さとターゲットの脳領域の深さによって異なります)。 プローブのヘッドステージコネクタをホルダー上部の接着剤パテに配置して、プローブが脱落するのを防ぎます。 27 Gシリンジ針を使用して、フレックスケーブルとシャトルの間にシアノアクリレート接着剤( 材料表を参照)を少量塗布し、プローブを所定の位置に固定します。接着剤がマイクロドライブに流れたり、シャトルを超えてフレックスケーブルに沿って流れたりしないことを確認します(これは非常に重要です) フレックスケーブルが所定の位置に接着されたら、シリコン絆創膏を使用してアンプをクラウンリング( 材料の表を参照)に取り付けます。次に、フレックスケーブルを取り付けます amplifier接続とケーブルをシリコンプラスターの薄い層で覆います。 5分後、石膏がセットされたら、マイクロドライブとプローブを次の使用まで安全に保管します。 銅メッシュの断片( 材料の表を参照)を開いたドーナツ形状にカットします( 補足図2のカットパターンを参照)ファラデーケージを覆います。 銅メッシュの切り欠きをエポキシ樹脂の小滴でファラデーケージに固定します( 材料の表を参照)。このステップでは、エポキシを歯科用セメントに置き換えることもできます。注意: ファラデーケージには、プローブコネクタまたはアンプを収納するスペースがあります。このスペースは、デザインファイルではXでマークされており、アンプ/コネクターのサポートベースと、ケージの隣接する2つのスポーク間の距離が広くなっています。周囲に十分なスペースを作るために amplifier/コネクタは、隣接する2つのスポークの間に少量の余分なメッシュを固定し、突起を作成します。これにより、アンプ/コネクタを後でファラデーケージに触れることなく、この「ポケット」に配置できます。反りを抑えてしっかりと密着させるには、リューズに直接置いたリューズリングを使用して形状を保ち、リューズの細いスポークを支えます。さらに、はんだ付けの助けの手を使用して、乾燥中にクラウンとメッシュを固定します。施術中にクラウンの形状を維持するのが難しい場合は、反りを防ぐために一度に2つだけクラウンアームをエポキシ化してみてください。 ファラデーケージの個別の接地が必要な場合は、小さなヘッダーピンを30 mmの接地線( 材料の表を参照)にはんだ付けし、導電性エポキシを使用してワイヤを銅メッシュの切り欠きに接着します。注:この手順はラボでは遵守されていません。 この時点で、準備したパーツは安全に保管し、後から手術を行います。注:セクション3〜6では、マイクロドライブとヘッドギアの埋め込みについて説明します。 3.手術:プローブとワークスペースの準備 手術器具を滅菌し、承認された手順に従って手術室に設置します。注:これには、ビーズ滅菌器の使用、オートクレーブ器具の使用、または承認された実験プロトコルに応じて、30%過酸化物または90%エタノールですすいでいることが含まれます。 歯科用セメントキットの指示に従って、歯科用セメントの準備に使用したセラミック皿をアイスボックス、冷蔵庫、または冷凍庫に入れます( 材料の表を参照)。セメントの混合中に冷却したセラミック皿を使用して、セメントが可鍛性になる時間を増やします。より長いセメンチングステップが必要な場合は、常に冷却した皿を使用してください。 実験終了時のプローブ配置の組織学的検証が必要な場合は、手術の直前にマイクロドライブのネジを反時計回りに回してシリコンプローブを伸ばし、プローブを少量の染料に浸して親油性染料( 材料の表を参照)をプローブに塗布します。市販のジメチルスルホキシド(DMSO)またはエタノール(EtOH)で希釈したストック溶液( 材料の表を参照)から親油性染料を調製し、PBSなどの適切な緩衝液で1〜5μMの濃度で希釈します。 4.手術:動物の準備 承認された麻酔プロトコルに従って、無菌条件下での2〜4時間のげっ歯類手術を行います。これには、全身麻酔および局所麻酔、鎮痛、眼軟膏の塗布、生理食塩水の注射が含まれます。ここでは、注射麻酔(ケタミン100[mg / kg]/メデトミジン0.5[mg / kg])を局所鎮痛クリームと眼軟膏( 材料の表を参照)と一緒に使用し、動物を温熱パッドの上に置いて体温を調節します。 動物が完全に麻酔されたら、別の非滅菌シェービングエリアに移動します。動物が十分に温められていることを確認してください。たとえば、加熱パッドの上に置きます。頭蓋骨上部の毛を取り除きます。これを行うには、電気シェーバーまたは脱毛クリーム( 材料の表を参照)を使用するか、70%エタノールで覆われたメスで頭のてっぺんを繰り返し剃ります。 抜け毛は慎重に取り除き、後で露出した組織に接触しないようにします。毛を取り除くには、例えば、70%エタノールで濡らしたティッシュやスクイーズボールポンプなどを使用します。脱毛クリームを使用する場合は、綿棒と生理食塩水を使用してこれを十分に取り除いてください。 剃った部分をヨウ素ベースの消毒剤( 材料の表を参照)と綿棒を使用したアルコールで複数回消毒し、頭の中心から側面に移動して、切開部位から残っている抜け毛をブラッシングします。 ベタジンを使用して頭の上と周りの毛皮を消毒します。これにより、無菌の作業領域が確保され、手術器具や材料が未滅菌の毛皮と接触するのを防ぎます。 イヤーバーとノーズホルダーを使用して動物を定位フレームに置きます( 材料の表を参照)。 小さな手術用ハサミ( 材料の表を参照)を使用して、頭蓋骨の上の皮膚にアーモンド型の開口部を切り取り、ラムダ縫合糸のすぐ後部から目の間まで到達します。 濡れたまま皮下膜と骨膜を切り取って除去し、メスの刃で頭蓋骨を引っ掻いて、歯科用セメントの接着を妨げる可能性のある頭蓋骨表面の軟膜組織を取り除きます。 オプション:頭蓋骨から膜組織を取り除いたら、0.5%過酸化物の薄層を短時間塗布し、水性ヨウ素消毒剤(ベタジンなど)で洗い流してから、頭蓋骨の表面を粗くして、頭蓋骨へのプライマーの接着性を向上させます。 メスの先端を逆さまにして十字形の模様を引っ掻くなど、頭蓋骨の表面を丁寧に粗くします。これにより、歯科用セメントが後で頭蓋骨に付着するのに役立ちます。注:縫合糸の上部を強く引っ掻きすぎると、縫合糸が破裂して頭蓋内液が漏れ、歯科用セメントの接着が損なわれる可能性があります。 メスの刃と滅菌綿棒を交互に使用して、ラムダ縫合糸の側面に取り付けられた首の筋肉を優しく引っ掻いたり押したりして、筋肉が小脳の上の頭蓋骨の「端」に押し戻されるまで押し戻します。これにより、ニューロンの記録における筋肉のノイズを最小限に抑えることができます。 1 mLのシリンジに27 Gの針( 材料の表を参照)に少量の外科用シアノアクリレート接着剤( 材料の表を参照)を入れます。.次に、注射器を使用して皮膚を頭蓋骨の端に接着し、瞬間接着剤の小さな滴を塗ります。組織を頭蓋骨にできるだけ平らに接着して、インプラント用のスペースを確保します。この手順により、皮膚や筋肉がインプラントの一部に直接接触することがなくなり、録音中の筋肉のノイズが回避され、歯科用セメントの接着性が向上します。 頭蓋骨全体にデンタルセメントプライマーを塗布して接着力を高め、UV光で硬化させます( 材料の表を参照)。これにより、歯科用セメントの接着性が向上し、頭蓋縫合糸が漏れて時間の経過とともに頭蓋セメントの結合が弱くなるのを防ぎます。 ブレグマまたはラムダに対するプローブの埋め込みの目標位置を見つけ、その周囲の開頭術の輪郭を外科マーカーで概説します。ヘッドプレートを頭蓋骨に配置して、開頭術が頭蓋骨の内側にくるようにし、開頭術の片側にマイクロドライブ用のスペースを確保し、1〜2本の接地ピンを取り付けます。 デンタルセメントを使用してヘッドプレートを埋め込みます。指定された冷却されたセラミック皿で歯科用セメントを混合します(手順3.2を参照)。ヘッドプレートがすべての側面で頭蓋骨に付着し、水密の「井戸」を形成していることを確認します。 歯科用ドリル(サイズUS 1/2 HP)を使用して、ステップ1.4で準備したヘッダーピンの幅に小さなバリ穴をGND/REFとして使用する脳領域にドリルで穴を開けます。ファラデーケージを接地したい場合は、ファラデーケージの端近くに別の小さなバリ穴を開けて、ファラデー-GNDヘッダーピン用に穴を開けます。注意: GND/REFヘッダーピンの場合、開頭術をケージの端から十分な距離に置いて、ヘッダーピン自体を後でファラデーケージに触れずにケージ内に配置できるようにします。 開頭術をシリンジで滅菌生理食塩水を優しく滴下し、脱落しないワイプで取り除いて、開頭術を清掃します( 材料の表を参照)。すべての血液とゆるい組織が除去されるまで繰り返します。 生理食塩水に0.7%寒天溶液( 材料の表を参照)を調製し、わずかに冷却し、1mLシリンジに27Gの針を使用して開頭術に導入します。 GNDピン(手順1.3を参照)を、前の手順でドリルで開けた各開頭術にそっと挿入します。ピンは、すべての側面が寒天で囲まれます(ステップ4.17を参照)。ヘッダーピンの周囲にセメントを塗布して固定し、電気的絶縁を提供します。 セラミック皿を掃除し、冷蔵庫/冷凍庫に戻します。 歯科用ドリルを使用して、より大きな開頭術(円形または正方形)の輪郭を、安定した動きで端を動かしてドリルで開けます。開頭術が1 mm x 1 mmから2 mm x 2 mmであることを確認して、プローブの配置を微調整して、皮質を露出しすぎずに血管を回避できるようにします。可能であれば、縫合糸の上に開頭術を置かないでください。20〜30秒のラウンドでドリルし、ドリルラウンドの合間に生理食塩水で頭蓋骨を冷やします。注:穴あけを開始するときは、マイクロドライブの先端をマーカーでマークすると便利です。これにより、穴あけ時にマイクロドライブの先端と平行に直線エッジを形成できます。これにより、マイクロドライブを所定の位置に固定する際に開頭術でセメントが付着するのを防ぐだけでなく、接着性が向上し、マイクロドライブが開頭術にオーバーハングするのを防ぎ、マイクロドライブを最終的な記録部位の位置に対して配置する際の横方向の操作性が向上します。 最初のドリルを数回行った後、細い鉗子(サイズ5以上、 材料の表を参照)で骨のドリルアウト部分をそっと押して、骨の穴あけ部分の抵抗をテストします。押されたときに骨が鉗子の下で「跳ね返る」ようになるまで、穴あけラウンドの合間にテストを続けます。このような場合は、開頭術の上に生理食塩水を一滴垂らして骨を柔らかくし、鉗子を使用してドリルで穴を開けた骨片をそっと取り除きます。 骨を優しく取り除くことができない場合は、骨がまだ強く付着しているポイントに焦点を当てて、もう一度穴を開けます。一般に、頭蓋骨を完全に穴を開ける前に、鉗子から穏やかな圧力で頭蓋骨を取り除くことを目指します。注:硬膜の表面が定期的に湿っていることを確認してください、温度を下げるための穴あけ中と骨皮弁の除去後の両方で。これにより、硬膜が乾燥して浸透しにくくなるのを防ぎ、プローブの挿入が容易になる可能性が高まります。硬膜が硬すぎて貫通できないことが判明した場合、または鈍器プローブまたはマルチシャンクプローブが使用されている場合は、27G針で硬膜を持ち上げ、生理食塩水浸漬下で小さな切開を行うことにより硬膜切開術が行われ、硬膜が脳表面に付着するのを防ぎます。 硬膜と脳を保護するために、冷たく滅菌された生理食塩水に浸した止血スポンジ( 材料の表を参照)で開頭術を覆います。 5.手術:プローブ埋め込み カスタムマイクロドライブホルダー( 材料の表を参照)を定位装置のアームに取り付けます。プローブの準備後にマイクロドライブをマイクロドライブホルダーから取り外した場合は、シリコンプローブが取り付けられたマイクロドライブをマイクロドライブホルダーに入れます。必要に応じてステレオタックスアームを傾けて、目的のターゲット脳領域に到達します。アンプが取り付けられたクラウンリングを、マイクロドライブホルダーの背面にある3本の垂直ピンに配置します( 補足図1を参照)。 マイクロドライブを開頭術から~0.5 mm以内に下げてから、鉗子を使用してプローブに取り付けられたGND/REFヘッダーピンを頭蓋骨に埋め込まれた対応するGND/REFピンに接続します(手順4.14-4.15を参照)。ドライブ、開頭術、および GND/REF ピンの配置の例については、 補足図 3 と 補足図 4 を参照してください。 所定の位置に設置したら、オプションでピンを導電性銀エポキシの滴で固定します( 材料の表を参照)より堅牢に接続します。銀エポキシが硬化したら、接続されたピンを少量の歯科用セメントで覆い( 材料の表を参照)、接続が長期間にわたって安定し、周囲の組織やインプラント要素と電気的に接続されていないことを確認します。 止血スポンジを開頭術から取り外します(手順4.22を参照)。 定位アームをマイクロドライブで開頭術の上に置きます。注意: プローブが引っ込められている場合は、プローブが大きな血管を含まない開頭術の部分に接地するようにマイクロドライブが配置されていることを確認してください。 必要に応じて、プローブシャンクがターゲット領域の硬膜または脳の表面(ステップ4.21を参照)に触れるまで位置と角度を調整して、マイクロドライブを下げます。 指定されたセラミック皿(ステップ3.2を参照)で歯科用セメントを混合し、電極に面していないマイクロドライブベースの3つの側面に焦点を当てて、マイクロドライブのベースを所定の位置にセメントで固定します。セメントが取り外し可能な「ベース」の上のマイクロドライブに触れないようにしてください( 図1Dを参照)。ベースと頭蓋骨の間のスペースが歯科用セメントで完全に覆われていることを確認してください。セラミック皿を掃除し、冷蔵庫/冷凍庫に戻します。セメントが硬化するのを約10〜15分待ちます。注:マイクロドライブベースと頭蓋骨の間には小さな隙間が残されており、セメントは最も流動的な形で埋められています。セメントがわずかに厚くなると、マイクロドライブベースの壁と頭蓋骨の間のセメントが蓄積されます。物質の流れは予測不可能であり、望ましくない領域に大量のセメントが流れ込む可能性があるため、常に非常に少量のセメントが使用されます。生理食塩水に浸した少量の止血スポンジを使用して、開頭術の一部を覆うことができます。セメントが誤って開頭術に流れ込んだ場合は、フィルム状の粘稠度に入ったら、鉗子でセメントを取り除きます。 シリコンプローブを脳に下ろし、顕微鏡でプローブの位置を注意深く監視します。プローブのシャンクが脳に触れたら、プローブを~250μm(ネジを1回転させると282μm)すばやく下げて、プローブが硬膜/皮質表面の抵抗を突破することを確認します。これを視覚的に確認します。プローブが皮質に侵入していない場合は、5分間待ってから、硬膜/皮質がプローブ先端から張力を受けている間にプローブを数十マイクロメートルずつ繰り返し上下させることにより、シャンク先端で硬膜をエッチングしようとします。 プローブが皮質の表面を突き破ったら、ターゲット座標に到達するか、プローブが1000μm以上移動するまで、ゆっくりとしたペース(100〜200μm/分)で徐々に下げます。ターゲットがプローブを1000μm以上移動する必要がある場合は、ターゲット座標に到達するまで、次の記録セッションで最大1000μm /セッションのステップでプローブを進めます。注:シリコンプローブを下げながらニューロン信号をモニタリングすることが望ましい場合は、この手順をスキップしてください。この手順については、セクション 7 で説明します。 指示に従ってシリコーンエラストマーを調製し( 材料の表を参照)、1mLのシリンジを使用して開頭術に少量の滴を分注します( 材料の表を参照)。 乾いたら、シリコンエラストマーをボーンワックスとミネラルオイルの50/50混合物で覆います。このステップにより、プローブがさらに保護され、開頭術上の破片や乾燥血漿の蓄積が防止され、抽出がより簡単かつ安全になります。プローブを下げた状態でプローブの周りで作業すると、破損する可能性があるため、注意してください。 6.手術:ファラデーケージの埋め込み 歯科用セメントが完全に固まったら、六角レンチでドライブを固定している横方向のネジを緩めて、マイクロドライブホルダーを緩めます( 補足図1を参照)。マイクロドライブが自立するように、ホルダーを~1cmゆっくりと引っ込めますが、プローブアンプ/コネクタはフレックスケーブルを伸ばさずにインプラントホルダーに固定されたままになります。 既製のクラウンとファラデーメッシュをヘッドプレートの周りに配置するには、開口部でケージを伸ばし、マイクロドライブとフレックスケーブルに水平にスロットしてから、デンタルセメントでヘッドプレートに固定します。注意: インプラントを汚染から保護するために、ファラデーケージと頭蓋骨の間のすべてのスペースを歯科用セメントで閉じてください。 プローブコネクタ/ヘッドステージ付きのファラデークラウンリング( 材料の表を参照)をクラウンの上に置き、プローブアンプ/コネクタの一体型ホルダーをファラデークラウンのインデントされた「X」でマークされた領域に合わせます(手順2.13を参照)。 各スポークリング接合部にシアノアクリレート接着剤または歯科用セメントを少量垂らして、リングをファラデーケージに固定します。 プローブアンプ/コネクタが統合されたファラデーリングが所定の位置に固定されたら、マイクロドライブホルダーで定位アームを完全に引っ込めます。これらのコンポーネントの組み立てに関するステップバイステップのガイドについては、 補足図3 を参照してください。 7. 術後検査記録 プローブを接続します amplifier/コネクタを録音ハードウェアに取り付けて、録音を開始します。 最初の挿入時にプローブがまだ目標位置に達していない場合(ステップ5.9を参照)、ニューロン信号を監視しながら、マイクロドライブのネジをゆっくりと反時計回りに回してプローブを下げます。注:信号は、a)電極が開頭術の上のシリコーンエラストマーの層に触れたとき、およびb)電極が脳に移動し始めたときに変化する必要があります(ステップ7.2を参照)。高周波のニューロン活動は、脳に完全に挿入された電極によって記録されますが、脳表面のCSFと接触している電極は、通常、スパイク活動(EEGトレースに類似)のないローパスフィルタリングされたニューロン集団信号を示し、空気中の記録部位は電気ノイズの増加を記録します。テスト記録後に個々のチャンネルのインピーダンスを測定することにより、プローブの挿入深さを追加で確認することが可能です。空気と接触するチャネルは、高インピーダンス(開回路を示す)と、CSFに接触しているチャネルまたはすでに脳内にあるチャネルに対して手術前に測定されたインピーダンスのようなインピーダンスを示す必要があります。シリコンプローブをセッションごとに最大合計距離約1000μm、最大速度約75μm / minで進めます(手順5.5を参照)。 プローブ全体に神経局所電位が見える場合、および/またはプローブが最大1000μm進んだ場合は、テスト記録を終了し、ヘッドステージコネクタを外します。 8. リカバリー ファラデーケージを自己接着性の獣医用ラップで覆います( 材料の表を参照)。 麻酔を終了し、承認された実験ガイドラインに従って数日間動物を回復させます。 シリコンプローブの電極がまだ目的の位置にない場合は、マイクロドライブのネジを小さなステップで回し、セッションごとに最大4回転(または~1000μm)します。必要に応じて、目標に達するまでこの手順を数日間繰り返します。プローブの動きと同時記録を組み合わせて、横方向の領域の電気生理学的活動を評価することをお勧めします。 9. 行動実験と慢性的な記録 タスクパフォーマンス中の慢性的な頭部固定記録の場合は、手動でクランプを開き、埋め込まれたヘッドプレートをクランプすることにより、ファラデーケージの基部にあるヘッドプレートを頭部固定クランプに取り付けます( 図1C、E、Fを参照)。注:頭部固定が不要な場合、このインプラントシステムは自由に動く録音にも使用できます。録音を自由に移動する場合は、手順9.1と9.7をスキップします。 インプラントから自己接着性の獣医用ラップをはがします。注:動物の不快感を最小限に抑えるために、実験者がインプラントで作業している間、気晴らしとしてこのステップの前にシンプルでやりがいのある行動タスクを開始することをお勧めします。 アンプ/コネクタを録音機器に取り付けます。 動物がタスクを実行するときにニューロンの記録を行います。注:記録される細胞外ユニットの数を最大化することが目標である場合は、ある場所での神経収量が減少するたびにシャトルを数十マイクロメートル動かします。プローブを動かした後、信号が安定するまでに数分から数時間かかる場合があることに注意してください。したがって、セッションの終了時にプローブを移動して、次のセッションの開始まで信号が回復できるようにすると便利な場合があります。 記録装置を取り外し、行動記録の最後に新しい獣医用ラップでインプラントを覆います。 頭部固定クランプを開いて、動物を頭部固定から外します。 10. プローブの回復 最終録音の最後に、ネジを時計回りに回して、シリコンプローブをマイクロドライブにできるだけ引っ込めます。これは、動物が頭を固定して行動しているとき、または手術のセットアップで動物を麻酔した状態で行います。ニューロン信号を同時に監視し、脳に浸されている、脳表面に触れている、または空気と接触している電極のシグネチャを確認することにより、脳からのプローブの出口をグラフ化します(ステップ7.3を参照)。注:組織学のプロトコルとプローブに応じて、プローブを引っ込める前に電解病変を行い、プローブ上の一部の電極の正確な位置を決定します。ニューロン記録によるプローブ出口のモニタリングが必要ない場合は、動物が終了した後にプローブを引っ込めることも可能です。 承認されたガイドラインに従って動物を終了します(これには、その後の組織学のために脳を固定することが計画されている場合、動物を灌流することが含まれます)。 動物が死んでから~10分待ちます。次に、ステレオタックスで動物を頭部固定し、外植片中に動物の頭部が動かないようにして、プローブの破損を防ぎます。 開頭術の上に生理食塩水を一滴垂らし、数分間浸してプローブシャンクの乾燥した生体組織を柔らかくし、シャンクの破損の可能性を減らします。 定位固定ホルダーをマイクロドライブの約0.5cm上に置きます。次に、ファラデーケージのスポークの上端を小さな手術用ハサミで切断します( 材料の表を参照)ファラデーリングを固定しています amplifier/コネクタを保持しているファラデーリングを解放し、リングを定位ホルダーの上部にある垂直ピンに戻します(ステップ5.1および 補足図1を参照)。 ファラデークラウンのスポーク間のメッシュのU字型の領域を切り取ることにより、同じ手術用ハサミで銅メッシュを慎重に切り取ります。次に、リューズのプラスチック製スポークをベースで切り取ります。注意: 印刷されたプラスチックスポークは、折れてプラスチックの破片がプローブに向かって飛んでくる可能性があるため、カットするときに曲げないでください。 ホルダーの横ネジを使用してマイクロドライブをホルダーに固定できるようになるまで定位ホルダーを下げ、マイクロドライブを固定してから、マイクロドライブ本体をマイクロドライブベースに接続しているT1ネジを緩めます。 インプラントホルダーで定位アームをゆっくりと引っ込めて、マイクロドライブをベースから持ち上げます。マイクロドライブがベースから垂直な角度(つまり、ベースから「垂直」)に離れていることを確認します。注意: マイクロドライブ本体とベースが簡単に分離しない場合は、定位アームの動きがマイクロドライブの向きに比べて斜めになっていないことを確認してください。必要に応じて、動物の頭の固定をわずかに緩め、それに応じて再配置することにより、ホルダーとマイクロドライブを互いに再配置します。正しい位置合わせは、マイクロドライブを簡単に回復するための重要な側面の1つです。また、マイクロドライブとマイクロドライブベースを接続している歯科用セメントが残っていないか確認してください(手順5.5を参照)。その場合、セメントの量に応じて、メスや歯科用ドリルでセメントを慎重に削り取ります。 付属のプローブで定位アームを持ち上げ、その下に十分なスペースを作ります。 動物を定位固定から取り出し、必要に応じて承認された組織学プロトコルに従って脳を準備します。埋め込まれたマイクロドライブベースを回復し、後で再利用するためにアセトンに数時間浸して清掃します。 清潔なマイクロドライブベースを接着パテ( 材料の表を参照)に置き、マイクロドライブをベースに下ろしてネジを締めます。破損を防ぐために、プロセス全体を通して顕微鏡でプローブの位置を監視します。この手順は、埋め込み型マイクロドライブベースを最初に再利用するためにクリーニングする必要がある場合は、後で完了できます。注:このプロトコルでは、ベースのプラットフォームとして接着剤パテを使用することが求められており、ベースを固定すると同時にある程度のギブを持ち、ベースが滑ってプローブと衝突しないようにするために重要です。パテは、プローブが下降するマイクロドライブベースの側面で垂直の「崖面」に形作られている必要があります。これにより、プローブがベースを超えて下がった場合でも、プローブが下のパテに接触しないようにします。パテの「タワー」は、マイクロドライブのベースを超えて下げると、プローブがパテが置かれているテーブル面に接触しないように、十分な高さにする必要があります。最後に、パテが滑ったり落ちたりしないように、パテを表面にしっかりと固定します。パテで保持されているマイクロドライブベースにマイクロドライブを下げるときは、プローブが下がるときにプローブがベースまたはパテに衝突しないように、顕微鏡からの側面図を確認して進行状況を監視します。 製造元の指示に従ってプローブを洗浄および滅菌します。最も一般的に入手可能なプローブについては、酵素クリーナー( 材料の表を参照)に12時間浸した後、脱塩水ですすぎ、アルコールで消毒します。これを行うには、プローブを酵素クリーナーが入った大きなビーカーに下げ、定位アームのマイクロドライブホルダーに取り付けたままにします。注意: 必要に応じて、クリーニング後にプローブ上の電極のインピーダンスを測定して、個々の電極の電位劣化を監視します。 クリーニングしたプローブを入れたマイクロドライブは、次の実験まで安全に保管してください。