שתל DREAM: מערכת שתלים קלה, מודולרית וחסכונית לאלקטרופיזיולוגיה כרונית בעכברים מקובעים ראש ומתנהגים בחופשיות
Summary
כאן, אנו מציגים מערכת שתלי בדיקה קלת משקל וחסכונית לאלקטרופיזיולוגיה כרונית במכרסמים המותאמת לקלות שימוש, שחזור בדיקה, רב-תכליתיות ניסיונית ותאימות להתנהגות.
Abstract
רישומים אלקטרופיזיולוגיים כרוניים במכרסמים שיפרו באופן משמעותי את הבנתנו את הדינמיקה העצבית ואת הרלוונטיות ההתנהגותית שלה. עם זאת, השיטות הנוכחיות להשתלה כרונית של גשושיות מציגות פשרות תלולות בין עלות, קלות שימוש, גודל, יכולת הסתגלות ויציבות לטווח ארוך.
פרוטוקול זה מציג מערכת חדשנית לשתלי בדיקה כרונית עבור עכברים בשם DREAM (דינמי, ניתן לשחזור, חסכוני, ניתן להתאמה ומודולרית), שנועדה להתגבר על הפשרות הקשורות לאפשרויות הזמינות כיום. המערכת מספקת פתרון קל, מודולרי וחסכוני עם רכיבי חומרה סטנדרטיים הניתנים לשילוב ולהשתלה בשלבים פשוטים ולשתול בבטחה לצורך התאוששות ושימוש חוזר מרובה בבדיקות, ובכך להפחית משמעותית את עלויות הניסוי.
מערכת השתלים DREAM משלבת שלושה מודולי חומרה: (1) מיקרו-כונן שיכול לשאת את כל בדיקות הסיליקון הסטנדרטיות, ומאפשר לנסיינים להתאים את עומק ההקלטה על פני מרחק נסיעה של עד 7 מ”מ; (2) עיצוב תלת-ממדי (תלת-ממדי) בקוד פתוח הניתן להדפסה עבור כלוב פאראדיי לביש המכוסה ברשת נחושת למיגון חשמלי, הגנה מפני פגיעות ומיקום מחברים, ו-(3) מערכת קיבוע ראש ממוזערת לשיפור רווחת בעלי החיים וקלות השימוש. פרוטוקול הניתוח המתאים הותאם למהירות (משך כולל: שעתיים), בטיחות הבדיקה ורווחת בעלי חיים.
לשתלים הייתה השפעה מינימלית על הרפרטואר ההתנהגותי של בעלי החיים, הם היו ישימים בקלות בהקשרים הנעים בחופשיות וקבועים בראשם, וסיפקו צורות גל ספייק ניתנות לזיהוי בבירור ותגובות עצביות בריאות במשך שבועות של איסוף נתונים לאחר ההשתלה. זיהומים וסיבוכי ניתוח אחרים היו נדירים ביותר.
ככזו, מערכת השתלים DREAM היא פתרון רב-תכליתי וחסכוני לאלקטרופיזיולוגיה כרונית בעכברים, המשפרת את רווחת בעלי החיים ומאפשרת ניסויים מבוססים יותר מבחינה אתולוגית. העיצוב שלה מפשט הליכים ניסיוניים על פני צרכי מחקר שונים, הגדלת הנגישות של אלקטרופיזיולוגיה כרונית במכרסמים למגוון רחב של מעבדות מחקר.
Introduction
אלקטרופיזיולוגיה עם גשושיות סיליקון מושתלות כרוניות התפתחה כטכניקה רבת עוצמה לחקר פעילות עצבית וקישוריות בבעלי חיים מתנהגים, במיוחד בעכברים, בשל הגמישות הגנטית והניסויית שלהם1. בדיקות סיליקון למינריות, במיוחד, הוכיחו את עצמן ככלי רב ערך לזיהוי קשרים תפקודיים בתוך עמודות קליפת המוח2 ולקשר את הדינמיקה של אוכלוסיות נוירונים גדולות להתנהגות באופן שלא היה אפשרי בעבר3.
שתי גישות משלימות הן תקני הזהב הנוכחיים לרישום פעילות עצבית in vivo: מיקרוסקופ דו-פוטוני 4,5 ואלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית6. הבחירה במתודולוגיית ההקלטה מגבילה את אופי הקריאות שניתן להשיג: מיקרוסקופיה של שני פוטונים מתאימה במיוחד למחקרי אורך של תאי עצב הניתנים לזיהוי אינדיבידואלי באוכלוסיות גדולות לאורך זמן, אך סובלת מעלויות ציוד גבוהות ומוגבלת לשכבות שטחיות של קליפת המוח במוחות שלמים. בנוסף, הרזולוציה הטמפורלית הטיפוסית של ~30 הרץ מגבילה את יכולתו ללכוד דינמיקה עצבית מתמשכת 7,8.
לעומת זאת, רישומים אלקטרופיזיולוגיים מציעים רזולוציה טמפורלית גבוהה (עד 40 קילוהרץ) כדי לעקוב אחר הפעילות העצבית רגע אחר רגע, ניתן ליישם אותם באופן נרחב על פני מינים כמו גם על פני מעמקי קליפת המוח, ויש להם הגדרות בעלות נמוכה יחסית בהשוואה למיקרוסקופ של שני פוטונים. עם זאת, זיהוי של נוירונים בודדים, כמו גם מעקב אורך של אוכלוסיות נוירונים, קשה להשיג. זה חל במיוחד על אלקטרודות תיל, למשל, טטרודים, ועל החדרת אלקטרודות חריפות. מלבד היעדר היכולת לעקוב אחר נוירונים לאורך הקלטות9, החדרות אקוטיות חוזרות ונשנות גורמות לטראומה מקומית10 המפעילה תגובה חיסונית11, ומגדילות את הסיכוי לזיהום וגליוזיס. זה בסופו של דבר מפחית את היציבות של הפעילות העצבית המתועדת ואת תוחלת החיים של חיות ניסוי, ומגביל את היקף מחקרי האורך הכוללים רישומים אלקטרופיזיולוגיים חריפים לימים ספורים12 בלבד.
הקלטות גשושיות סיליקון כרוניות בצפיפות גבוהה שואפות לשלב כמה מהתכונות הטובות ביותר של אלקטרופיזיולוגיה חריפה והדמיה של שני פוטונים. הם יכולים לעקוב אחר דינמיקה של אוכלוסייה עצבית על פני הפעלות עם יכולת נמוכה רק במקצת לזהות נוירונים בודדים בהשוואה לדימות של שני פוטונים13. הקלטות אלה מספקות גמישות גבוהה במיקום המרחבי וברזולוציה הטמפורלית המדויקת של האותות המוקלטים, כמו גם תוחלת חיים ורווחה משופרת של חיות ניסוי בהשוואה להקלטות אקוטיות14. יתר על כן, בניגוד לרישומים אקוטיים, אלקטרופיזיולוגיה כרונית מחייבת אירוע השתלה אחד בלבד, ובכך מפחיתה למעשה את הסיכון לזיהום ולנזק לרקמות וממזערת את הלחץ על בעלי החיים15 . יחד, יתרונות אלה הופכים את האלקטרופיזיולוגיה הכרונית לכלי רב עוצמה לחקר הארגון והתפקוד של מערכת העצבים.
עם זאת, טכניקות השתלה כרוניות נפוצות עבור עכברים מגבילות את החוקרים לבצע פשרות משמעותיות בין תאימות לרישומים התנהגותיים, משקל השתל, שכפול שתלים, עלויות כספיות וקלות השימוש הכוללת. פרוטוקולי שתלים רבים אינם מתוכננים להקל על שימוש חוזר בגשושיות16, מה שמעלה באופן תלול את העלות האפקטיבית של ניסויים בודדים ובכך מקשה כלכלית על מעבדות מסוימות להשתמש באלקטרופיזיולוגיה כרונית. הם גם דורשים לעתים קרובות אב טיפוס נרחב בתוך הבית ועבודת עיצוב, אשר המומחיות והמשאבים עשויים שלא להיות נוכחים.
מצד שני, מערכות שתלים משולבות17 מציעות פתרון נגיש יותר לאלקטרופיזיולוגיה כרונית במכרסמים. מערכות אלה מתוכננות לשלב מיקרו-כונן המחזיק את הבדיקה עם שאר השתל כדי לפשט את הטיפול בשתלים ואת ההליכים הכירורגיים. עם זאת, לאחר השתלתן, מערכות כאלה יכולות להיות כבדות ביותר ולהגביל את יכולתו של הנסיין להתאים ניסוי באופן גמיש לקואורדינטות מטרה שונות. לעתים קרובות, משקלם מונע השתלה בבעלי חיים קטנים יותר, עלול לפגוע בתנועת בעלי החיים ולגרום ללחץ18. זה יכול להשפיע באופן לא פרופורציונלי על מחקר על קבוצות צעירות ונשים, כמו מגבלות משקל נוטים יותר להשפיע על קבוצות אלה.
בנוסף, לא כל המערכות המשולבות מאפשרות התאמה של מיקומי האלקטרודות לאחר ההשתלה. זה רלוונטי, כמו גליוזיס או הצטלקות עקב החדרת בדיקה19, במיוחד ב 48 שעות הראשונות לאחר ההשתלה20, יכול להפחית את איכות הפעילות העצבית הרשומה. התאמות מיקרו לעומק החדרת הבדיקה יכולות להגביל השפעות שליליות אלה על שלמות האות. לכן, מנגנוני מיקרו-מיקום, הנקראים בדרך כלל מיקרו-כוננים, יכולים להיות מועילים גם בבדיקות עם מספר רב של אלקטרודות המפוזרות לאורכן.
כדי להתגבר על פשרות כאלה, אנו מציגים מערכת שתלים אלקטרופיזיולוגית כרונית חדשנית לעכברים המטפלת במגבלות של עיצובים קודמים על ידי הצעת פתרון קל, חסכוני ומודולרי. מערכת השתלים DREAM מתוכננת לשקול פחות מ-10% (~2.1 גרם) ממשקל הגוף הטיפוסי של עכבר, מה שמבטיח רווחת בעלי חיים והשפעה מינימלית על ההתנהגות. תיקוף של עיצוב שתל DREAM מראה השפעה מינימלית על מדדי מפתח התנהגותיים כגון תנועה – אשר יכולה להיות מושפעת באופן משמעותי במכרסמים כאשר עומסים מופעלים על הגולגולת. זה יכול להועיל לפרדיגמות ניסיוניות המשתמשות בתנועה חופשית, כמו גם בבעלי חיים קבועים מראש, על ידי הגברת רווחתם של בעלי חיים ומתן אפשרות לניסויים מבוססים יותר מבחינה אתולוגית.
המערכת כוללת מיקרו-דרייב לכוונון גמיש של עומק הקלטה עד 7 מ”מ וניתן להתאימה לסוגים שונים של גשושיות והתקני הקלטה, מה שמספק לחוקרים כלי חסכוני ורב-תכליתי ליישומים ניסיוניים שונים. המערכת משולבת באופן שגרתי עם מיקרו-כונן מתכת21, המציע שחזור גשושיות עקבי בהשוואה למערכות אחרות (שיעור התאוששות ממוצע צפוי: כשלושה שימושים חוזרים אמינים לכל גשוש) ומפחית באופן דרסטי את עלות הניסויים הבודדים.
העיצוב כולל כלוב מגן פאראדיי המודפס בתלת-ממד, המאפשר הגנה זולה אך חזקה מפני רעש אלקטרופיזיולוגי, פגיעות מכניות וחומרים זיהומיים, ומאפשר הקלטות יציבות ונטולות רעש הסובלות משיעורי זיהום מינימליים. כלוב מושתל זה מורכב ממה שמכונה “כתר”, המיועד להגנה מפני פגיעות ולספק מבנה לציפוי רשת המתכת המוליך של כלוב פאראדיי, וטבעת הכתר, המשמשת כתושבת למגבר מושתל ו/או מחבר בדיקה (ראה איור 1).
לבסוף, לוחות הראש הכלולים במערכת השתלים המודולרית מתוכננים להיות תואמים למערכת קיבוע ראש חדשנית ויעילה מבלי להוסיף נפח נוסף לשתל. בניגוד למערכות קיימות אחרות, היא אינה דורשת הידוק ברגים קטנים בסמוך לשתל, זירוז קיבוע עכברים במערך הניסוי ושיפור יחסי נסיין-חיה, כמו גם היענות התנהגותית. במקביל, לוחית הראש משמשת כבסיס לבניית המודולים האחרים של מערכת האלקטרופיזיולוגיה הכרונית DREAM.
קובצי עיצוב עבור שתל DREAM מתפרסמים כחומרת קוד פתוח ב-https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/. בסעיפים הבאים יתוארו התכנון והייצור של מערכת השתלים DREAM, יודגם יישומה המוצלח במודל עכבר, יידונו היישומים והיתרונות הפוטנציאליים שלה בהשוואה למערכות קיימות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה מציג פרוטוקול להשתלה מהירה, בטוחה וסטנדרטית של גשושיות, המאפשר גם שחזור גשושית ושימוש חוזר בסוף הניסוי. הגישה עושה שימוש במערכת מודולרית של רכיבי שתלים, במיוחד מיקרו-דרייב, התואמת לכל בדיקות הסיליקון ומערכות ההקלטה הנפוצות, לוחית ראש שניתן להשתמש בה לניסויים התנהגותיים קבועי ראש, וכלוב פאראדיי לביש להגנה על השתל. קונסטלציה זו מאפשרת למשתמשים להתאים את השתל שלהם באופן גמיש לפרדיגמות ניסיוניות שונות, כגון התנהגות מקובעת ראש לעומת תנועה חופשית או מזעור השתל (ללא כלוב פאראדיי) לעומת עמידות אותות מוגברת לטווח ארוך (עם כלוב פאראדיי) – מבלי להקריב את הסטנדרטיזציה של השתל בתהליך.
גישה זו הופכת את הרישומים האלקטרופיזיולוגיים הכרוניים לסטנדרטיים יותר (באמצעות אלמנטים טרומיים שאינם דורשים הרכבה ידנית), פחות יקרים (באמצעות שחזור בדיקה), פחות גוזלים זמן (על ידי פישוט שלבי הניתוח), ומתאימים יותר בקלות לרווחת בעלי החיים ולהתנהגותם (באמצעות הקטנת גודל השתל וקיבוע ראש ללא לחץ). ככזה, פרוטוקול זה נועד להפוך שתלים אלקטרופיזיולוגיים במכרסמים מתנהגים להשגה עבור מגוון רחב יותר של חוקרים מעבר למעבדות החלוציות בחוד החנית של התחום.
כדי להשיג מטרה זו, הפרוטוקול המוצג כאן ממזער את הפשרה בין מספר היבטים חיוניים לעתים קרובות באותה מידה של שתלי מיקרו-דרייב, כלומר גמישות, מודולריות, קלות ההשתלה, יציבות, עלות כוללת, תאימות להתנהגות ושימוש חוזר בבדיקה. נכון לעכשיו, גישות זמינות לעתים קרובות מצטיינות בחלק מההיבטים הללו, אך במחיר גבוה לתכונות אחרות. לדוגמה, עבור מקרי שימוש הדורשים יציבות שתל מוחלטת לאורך תקופות זמן ארוכות, גישת השתל הטובה ביותר עשויה להיות לקבע את הבדיקה ישירות על גולגולת25. עם זאת, זה גם מונע שימוש חוזר בבדיקה, כמו גם מיקום מחדש של אתרי הקלטה במקרה של איכות הקלטה גרועה, וזה לא תואם מיקום שתל סטנדרטי. באופן דומה, בעוד כונן AMIE מספק פתרון קל משקל וזול להשתלה ניתנת לשחזור של גשושיות, הוא מוגבל לגשושיות בודדות ומוגבל במיקום קואורדינטות המטרה17. בקצה השני של הספקטרום, חלק מהננו-כוננים הזמינים מסחרית (ראו טבלה 1 16,17,21,26,27,28,29,30) הם קטנים ביותר, ניתן למקם אותם בחופשיות על הגולגולת, ולמקסם את מספר הגשושיות שניתן להשתיל בחיה אחת 16. עם זאת, הם יקרים בהשוואה לפתרונות אחרים, דורשים מהנסיינים להיות מיומנים מאוד לניתוחי שתלים מוצלחים, ואוסרים על שימוש חוזר בבדיקה. המיקרו-כונן שפותח על ידי Vöröslakos et al.21, גרסה קלת משקל שלו היא גם חלק מפרוטוקול זה, מקריב גודל שתל קטן לטובת קלות שימוש טובה יותר, מחיר נמוך יותר ושימוש חוזר בבדיקה
טבלה 1: השוואה בין אסטרטגיות פופולריות לשתלי בדיקה כרוניים במכרסמים. זמינות: האם המיקרו-כונן הוא קוד פתוח (לחוקרים לבנות את עצמם), זמין מסחרית, או שניהם. מודולריות: מערכות משולבות מורכבות מרכיב אחד או מספר רכיבים הנמצאים ביחס קבוע זה לזה, בעוד מערכות מודולריות מאפשרות מיקום חופשי של הגשוש/מיקרו-כונן ביחס להגנה (הילוך ראש/כלוב פאראדיי) לאחר ייצור השתל (למשל בזמן הניתוח). המודולריות נקבעה ממידע שפורסם או פרוטוקולי השתלה של השתלים הרשומים. תיקון ראש: כן: לשתל יש מנגנונים לקיבוע ראש המשולבים בעיצוב שלו, X: השתל משאיר את החלל כדי להוסיף לוחית ראש נוספת לקיבוע ללא בעיות גדולות, לא: עיצוב השתל ככל הנראה יוצר בעיות חלל או דורש שינויי עיצוב מהותיים לשימוש עם קיבוע ראש. מיקום הבדיקה: מוגבל: מיקום הבדיקה מוגבל בשלב תכנון השתל. גמיש: ניתן להתאים את מיקום הבדיקה גם במהלך הניתוח. מספר הבדיקות: מספר הבדיקות שניתן להשתיל אותן. שימו לב שהשתלת בדיקות >2 על עכבר אכן מהווה אתגר משמעותי ללא תלות במערכת השתלים שנבחרה. שימוש חוזר בבדיקה: כן, אם הגשושיות יכולות, בתיאוריה, לעשות בהן שימוש חוזר. משקל/גודל: משקל ונפח השתל. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
כדי ליצור מערכת המיישבת את הדרישות השונות הללו בצורה חלקה יותר, שתל DREAM תוכנן על בסיס שתל Vöröslakos21, אך עם מספר שינויים בסיסיים. ראשית, כדי להפחית את משקל השתל הכולל, המיקרו-דרייב המשמש כאן מיוצר מאלומיניום במכונה ולא מפלדת אל-חלד מודפסת בתלת-ממד, וכתר פאראדיי ממוזער, ומשיג הפחתת משקל כוללת של 1.2-1.4 גרם בהתאם לבחירת חומר לוחית הראש (ראה טבלה 2). שנית, לוחית הראש המקיפה את המיקרו-כונן תוכננה לאפשר מנגנון קיבוע ראש משולב המאפשר קיבוע ראש מהיר וללא לחץ תוך הכפלה כבסיס לכלוב פאראדיי, מתן גישה לרוב אזורי המטרה הפוטנציאליים לרישומים עצביים והוספת משקל מינימלי בלבד לשתל. צורתו השטוחה של מנגנון הקיבוע והיעדר הבליטות מבטיחים גם פגיעה מינימלית בשדה הראייה או בתנועה של בעלי חיים (ראו איור 2A-C), שיפור ברור לעומת מערכות קודמות31,32. גם הכתר והטבעת של פאראדיי המקובעים על לוחית הראש שונו באופן משמעותי בהשוואה לעיצובים קודמים. כעת הם אינם דורשים כל התאמה אד-הוק (למשל, במונחים של מיקום מחברים) או הלחמה לאורך כל הניתוח, מה שמסיר גורמים פוטנציאליים לנזק לשתל ולשונות בלתי צפויה באיכות השתל. במקום זאת, שתל DREAM מספק מספר וריאציות סטנדרטיות של טבעת כתר המאפשרות למקם כל מחבר באחד מארבעה מיקומים מוגדרים מראש, תוך מזעור השונות והמאמץ במהלך הניתוח. לבסוף, על ידי אופטימיזציה של מערכת השתל להתאוששות הגשוש, שתל DREAM מאפשר לנסיינים לקצץ באופן דרסטי את העלות כמו גם את זמן ההכנה לכל שתל מכיוון שבדרך כלל ניתן לשחזר, לנקות ולעשות שימוש חוזר במיקרו-כונן ובבדיקה יחד.
לסקירה ממצה יותר של התמורות שמציבות מערכות שתלים שונות, ראה טבלה 1. בעוד שהגישה המוצגת כאן בדרך כלל אינה מספקת ביצועים מקסימליים בהשוואה לכל האסטרטגיות האחרות, למשל, במונחים של גודל, יציבות או עלות, היא פועלת בטווח העליון בכל הפרמטרים הללו, מה שהופך אותה לקלה יותר ליישום במגוון רחב של ניסויים.
שלושה היבטים של הפרוטוקול חיוניים במיוחד להתאמה לכל מקרה שימוש ספציפי: קונסטלציה של הארקה וייחוס, הטכניקה לביסוס המיקרו-דרייב, ותיקוף השתל באמצעות רישום עצבי. ראשית, בעת השתלת הקרקע וסיכות הייחוס, המטרה הייתה לזהות את הנקודה המתוקה בין יציבות מכנית/חשמלית לבין פולשניות. אמנם, למשל, חוטי כסף צפים המוטבעים באגר הם פחות פולשניים מברגי עצם33, אך סביר להניח שהם נוטים יותר להיעקר עם הזמן. השימוש בסיכות, יחד עם אגר, מבטיח חיבור חשמלי יציב תוך גם יתרון של קל יותר לשלוט במהלך החדרה, הימנעות טראומה רקמות. סיכות הארקה המודבקות לגולגולת אינן צפויות להיעקר ממקומן, ובמקרה שהחוט מופרד מהסיכה, החיבור מחדש הוא בדרך כלל פשוט בשל שטח הפנים הגדול יותר והיציבות של הסיכה המושתלת.
טבלה 2: השוואת משקלי רכיבים בין שתל DREAM לבין השתל המתואר על ידי Vöröslakos et al.21. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
שנית, צמנט של microdrive צריך להתרחש בדרך כלל לפני החדרת הבדיקה במוח. זה מונע תנועה לרוחב של הבדיקה בתוך המוח אם המיקרו-כונן אינו מקובע באופן מושלם במחזיק הסטריאוטקטי במהלך ההחדרה. כדי לבדוק את מיקום הגשושית לפני קיבוע המיקרו-דרייב במקומו, ניתן להוריד לזמן קצר את קצה שוק הגשושית כדי לוודא היכן הוא יבוא במגע עם המוח, מאחר שחישוב תנוחת המגע יכול להיות קשה בהתחשב בשינוי הפרלקסה של המיקרוסקופ. לאחר קביעת מיקום המיקרו-דרייב, ניתן להגן על הקרניוטומיה באמצעות אלסטומר סיליקון לפני צמנט המיקרו-כונן כדי להבטיח שהמלט לא יבוא בטעות במגע עם הקרניוטומיה; עם זאת, הורדת הבדיקה דרך אלסטומר הסיליקון אינה מומלצת, מכיוון ששאריות אלסטומר סיליקון יכולות להימשך לתוך המוח ולגרום לדלקת וגליוזיס.
שלישית, בהתאם לפרוטוקול הניסוי בו נעשה שימוש, הקלטת בדיקה מיד לאחר הניתוח עשויה להיות שימושית או לא. באופן כללי, פעילות עצבית שנרשמה מיד לאחר החדרת הגשושית לא תייצג ישירות את הפעילות שנרשמה באופן כרוני, בשל גורמים כגון נפיחות מוחית חולפת ותנועת רקמות סביב הגשושית, כלומר גם עומק ההחדרה וגם צורות גל ספייק לא צפויים להתייצב ישירות. ככזה, הקלטות מיידיות יכולות לשמש בעיקר כדי לוודא את איכות האות הכללית ואת שלמות השתל. מומלץ להשתמש במזחלת המיקרו-כונן הניתנת להזזה בימים שלאחר הניתוח לאחר שהמוח התייצב כדי לכוונן את המיקום. זה גם עוזר להימנע מהזזת הגשושית ביותר מ -1000 מיקרומטר ליום, למזער את הנזק לאתר ההקלטה ובכך לשפר את תוחלת החיים של אתר ההקלטה.
לבסוף, ייתכן שמשתמשים ירצו להתאים את המערכת להקלטה מיותר ממיקום יעד אחד. מכיוון שמערכת זו היא מודולרית, למשתמש יש מרחב תמרון רב כיצד להרכיב ולמקם רכיבים ביחס זה לזה (ראו לעיל איור משלים 3 ואיור משלים 4). זה כולל שינויים שיאפשרו להרכיב מעבורת מורחבת אופקית על המיקרו-דרייב, מה שיאפשר השתלת גשושיות מרובות או גשושיות מרובות שוקיים גדולות, כמו גם השתלה של מיקרו-כוננים נפרדים מרובים (ראו איור משלים 3 ואיור משלים 4). שינויים כאלה דורשים רק שימוש בטבעת כתר מותאמת, עם מספר מוגבר של אזורי הרכבה עבור מחברים/לוחות ממשק/במות. עם זאת, מגבלות המקום של עיצוב זה מוכתבות על ידי מודל החי, במקרה זה, העכבר, מה שהופך ערימה של בדיקות מרובות על מיקרו-כונן אחד אטרקטיבי יותר במונחים של טביעת רגל מאשר השתלת כמה microdrives בנפרד זה מזה. המיקרו-כוננים המשמשים כאן יכולים לתמוך בבדיקות מוערמות, ולכן, המגבלה האמיתית היחידה היא מספר שלבי הראש או המחברים שיכולים להתאים לאילוצי המקום והמשקל שהוגדרו על ידי מודל החיה. ניתן להשתמש בספייסרים גם כדי להגדיל עוד יותר נתיבי הרכבה והכנסה שאינם אנכיים.
לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר השתלה זולה, קלת משקל וחשוב מכך מתכווננת של גשושית, עם היתרון הנוסף של תכנון מיקרו-כונן שנותן עדיפות להתאוששות הגשושית. זה מתמודד עם הבעיות של העלות הגבוהה של בדיקות חד פעמיות, את המחסום הגבוה של מיומנויות ניתוח והשתלה, כמו גם את העובדה כי פתרונות מסחריים להשתלה כרונית הם לעתים קרובות קשה להסתגל למקרי שימוש ייחודיים. סוגיות אלה מציבות נקודת כאב למעבדות שכבר משתמשות באלקטרופיזיולוגיה חריפה ומרתיעה את אלה שעדיין לא מבצעות ניסויים באלקטרופיזיולוגיה. מערכת זו נועדה להקל על קליטה רחבה יותר של מחקר אלקטרופיזיולוגי כרוני מעבר למגבלות אלה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר ההולנדית (NWO; תוכנית קרוסאובר 17619 “אינטנסיבית”, TS) וקיבלה מימון מתוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7/2007-2013) במסגרת הסכם מענק מס ‘600925 (Neuroseeker, TS, FB, PT), כמו גם מאגודת מקס פלנק.
Materials
| 0.05" Solder Tail Socket | Mill-Max | 853-93-100-10-001000 | |
| 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- Reagent tetramethylindocarbocyanine perchlorate (’DiI’; DiIC18(3)) | ThermoFisher | D282 | Lipophilic dye used for easier histological verification of the probe location |
| Adhesive Putty (Blu-Tack) | Bostik | 308590110 | Variations (e.g. by Pritt) should be available in your stationary store |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296 | Make with saline for conductivity. |
| Amplifier (Miniamp-64) | Cambridge Neurotech | Miniature and implantable amplifier and digitiser. Alternative Implantable digitiser, or implantable Omnetics connector use possible. | |
| Analgesic Cream (EMLA Cream) | Aspen | 39699/0088 | Analgesic cream used for operative pain containing prilocaine, lidocaine. |
| Angled Spacer | 3DNeuro | Angled spacer for non-perpendicular drive mounting.. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/ | |
| Blue light curing LED | B.A. International | 818223 | Curing light for primer polymerisation. 420-480 nm wavelength |
| Bone wax | SMI | Z046 | Wax to protect craniotomy and probe post surgery. |
| Copper mesh | Dexmet | 3CU6-050FA | Copper mesh used to electrically and physically shield probe and craniotomy. |
| Cyanoacrylate glue (Loctite) | Loctite | 1363589 | Cyanoacrylate gel glue |
| Dental Cement (SuperBond C&B) | Sun Medical | K058E | Dental cement (SuperBond) |
| Depilation Cream (Veet) | Veet | 310000091434 | Hair removal cream for removal of hair around surgical site. |
| Faraday crown | 3DNeuro | 3D printed implantable protective cage. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/ | |
| Faraday ring | 3DNeuro | 3D printed implantable protective ring for faraday cage. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/ | |
| Haemostatic Sponge | SMI | ZHG101010 | Absorbable gelatin haemostatic sponge |
| Heat Shrink Tubing | HellermannTyton | TA32-9/3 BK | Heat Shrink tubing for making soft tipped forceps |
| Iodine | Braunol | 9322507 | Aqueous povidone-iodine solution. |
| Microdrive (R2Drive) | 3DNeuro | Recoverable Metal micro drive with moveable shuttle. Open souce, also available at https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/ |
|
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310-100ML | Oil used as solvent to create craniotomy protection gel. |
| Non-Shedding Wipes (Kimtech) | Kimtech | 7552 | Non-shedding wipes |
| Primer | Bisco | B-7202P | Universal skull adhesive preventing moisture from deteriorating the cement and providing a solid base to build up cement onto. |
| R2Drive holder | 3DNeuro | Stereotactic attachment for mounting R2Drive. Open souce, also available at https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/ |
|
| Self-adherent wrap | 3M | VB050 | Protective wrap for implant post surgery |
| Silicon probe (H2) | Cambridge Neurotech | Chronically implantable linear silicon probe with 32 channels. Alternative Probe use possible. | |
| Silicone Elastomer (Duragel) | Cambridge Neurotech | Silicone Elastomer | |
| Silicone Plaster (Kwikcast) | WPI | KWIK-CAST | |
| Silver conductive epoxy | MG Chemicals | 8331D-14G | Silver epoxy |
| Size 5 Dumont forceps | FSTools | 11251-10 | Small forceps for lifting bone flap. |
| Stainless steel wire, Teflon coated | Science Products GmBH | SS-3T | Ground wire |
| Stereotax (RWD) | RWD | 68803 | Stereotax for surgical procedures on mice. |
| Tergazyme | Alconox | 1304 | A possible enzymatic cleaner to clean probe |
| Two Part Fast setting Epoxy Resin | Gorilla | EP3 | Epoxy for permanent bonding of DREAM implant parts. |
| Vannas Spring Scissors Round Handle | FSTools | 15403-08 | 0.075mm straight tipped spring rebound veterinary scissors. |
| Veterinary Cyanoacrylate glue (Vetbond) | 3M | 70-0068-5256-3 | Veterinary cyanoacrylate glue |
References
- Epsztein, J., Brecht, M., Lee, A. K. Intracellular determinants of hippocampal CA1 place and silent cell activity in a novel environment. Neuron. 70 (1), 109-120 (2011).
- Okun, M., et al. Diverse coupling of neurons to populations in sensory cortex. Nature. 521 (7553), 511-515 (2015).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
- Znamenskiy, P., Kim, M. -. H., Muir, D. R., Iacaruso, M. F., Hofer, S. B., Mrsic-Flogel, T. D. Functional specificity of recurrent inhibition in visual cortex. Neuron. 112 (6), 991-1000.e8 (2024).
- Rowland, J. M., et al. Propagation of activity through the cortical hierarchy and perception are determined by neural variability. Nat Neurosci. 26 (9), 1584-1594 (2023).
- Roth, M. M., Dahmen, J. C., Muir, D. R., Imhof, F., Martini, F. J., Hofer, S. B. Thalamic nuclei convey diverse contextual information to layer 1 of visual cortex. Nat Neurosci. 19 (2), 299-307 (2016).
- Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).
- Demas, J., et al. High-speed, cortex-wide volumetric recording of neuroactivity at cellular resolution using light beads microscopy. Nat Methods. 18 (9), 1103-1111 (2021).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents – EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J Neurosci Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
- Savya, S. P., et al. In vivo spatiotemporal dynamics of astrocyte reactivity following neural electrode implantation. Biomaterials. 289, 121784 (2022).
- Perge, J. A., et al. Intra-day signal instabilities affect decoding performance in an intracortical neural interface system. J Neural Eng. 10 (3), 036004 (2013).
- Pachitariu, M., Steinmetz, N., Kadir, S., Carandini, M., Harris, K. D. Kilosort: realtime spike-sorting for extracellular electrophysiology with hundreds of channels. bioRxiv. , (2016).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: Drive fabrication. J Vis Exp. (26), e1094 (2009).
- Jacobs, T., Darch, H., Holtzman, T., De Zeeuw, C. I., Romano, V. Standard operating protocol: Implantation of Cambrige NeuroTech chronic silicon probe and mini-amp-64 digital headstage in mice. Protocol Exchange. , (2023).
- Juavinett, A. L., Bekheet, G., Churchland, A. K. An adaptable, reusable, and light implant for chronic Neuropixels probes. bioRxiv. , (2024).
- Kozai, T. D. Y., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chem Neurosci. 6 (1), 48-67 (2015).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. (26), 1098 (2009).
- Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp Neurol. 195 (1), 115-126 (2005).
- Vöröslakos, M., Petersen, P. C., Vöröslakos, B., Buzsáki, G. Metal microdrive and head cap system for silicon probe recovery in freely moving rodent. eLife. (10), e65859 (2021).
- . IMEC Neuropixels 1.0 User Manual V1.0.8 Available from: https://www.neuropixels.org/_files/ugd/328966_ca209d53ffb346b3bf98be39b903efa9.pdf (2023)
- Baranauskas, G., et al. Carbon nanotube composite coating of neural microelectrodes preferentially improves the multiunit signal-to-noise ratio. J Neural Eng. 8 (6), 066013 (2011).
- Niell, C. M., Stryker, M. P. Modulation of visual responses by behavioral state in mouse visual cortex. Neuron. 65 (4), 472-479 (2010).
- Okun, M., Carandini, M., Harris, K. D. Long term recordings with immobile silicon probes in the mouse cortex. bioRxiv. , (2015).
- Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes. Sci Rep. 7 (1), 2773 (2017).
- Bimbard, C., et al. An adaptable, reusable, and light implant for chronic Neuropixels probes. bioRxiv. , (2024).
- Jones, E. A. A. Chronic recoverable Neuropixels in mice. protocols.io. , (2023).
- . Neuronexus Products – dDrive Available from: https://www.neuronexus.com/products/accessories/microdrives/ddrive (2024)
- van Daal, R. J. J., et al. Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats. Nat Protoc. 16 (7), 3322-3347 (2021).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), e88678 (2014).
- Groblewski, P. A., et al. A standardized head-fixation system for performing large-scale, in vivo physiological recordings in mice. J Neurosci Methods. 346, 108922 (2020).
- Vasilev, D., Raposo, I., Totah, N. K. Brightness illusions evoke pupil constriction preceded by a primary visual cortex response in rats. Cereb Cortex. 33 (12), 7952-7959 (2023).
.