El implante DREAM: un sistema de implantes ligero, modular y rentable para la electrofisiología crónica en ratones de cabeza fija y de comportamiento libre

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales de la Sociedad Max Planck y fueron aprobados por el comité de ética del gobierno local (Beratende Ethikkommission nach §15 Tierschutzgesetz, Regierungspräsidium Hessen, Código de aprobación del proyecto: F149-2000). Figura 1: Diseño del implante. (A) Representación en 3D del implante superpuesto en el cráneo de un ratón con una sonda de silicona conectada a un conector de sonda. La apertura central de la placa frontal es de aproximadamente 10 mm para la escala. La altura de la unidad es de aproximadamente 17 mm. La malla de cobre que forma el exterior de la corona de Faraday, así como los cables de tierra/referencia, no se muestran. (B) Igual que (A) con una conexión a una placa amplificadora en lugar de un conector de sonda. (C) Dibujo técnico despiece del implante, mostrando sus componentes. (D) Renderizado de un espaciador en ángulo que se puede implantar debajo de un microdrive, lo que permite implantar consistentemente el microdrive en un ángulo predefinido (aquí: 20°). (E) Representación del mecanismo de fijación de la cabeza integrado, que muestra la placa de la cabeza implantada con la corona de Faraday con la abrazadera de fijación de la cabeza circundante y la conexión de la cola de milano a la configuración. (F) Imagen de la cabeza del ratón fijada en una cinta de correr utilizando el mecanismo de fijación de la cabeza integrado en el implante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. NOTA: En las secciones 1 y 2 se analizan los preparativos prequirúrgicos 1. Preparación de la sonda de silicio En caso de reutilización de la sonda, limpie la sonda de silicona de acuerdo con las recomendaciones del proveedor de la sonda. Remoje la sonda en un limpiador enzimático (consulte la tabla de materiales) durante 5-10 minutos, luego enjuáguela con agua desmineralizada. Haga esto lo más rápido posible después de la explantación. Un día antes de la (re)implantación, remoje la sonda en etanol al 70% durante al menos 30 minutos para la desinfección. Mida las impedancias de los canales para asegurarse de que están dentro de las especificaciones de la señal grabada. Siga el protocolo para probar los niveles de ruido del manual del usuario de Neuropixels22, mida la impedancia a través del software de grabación deseado (por ejemplo, https://open-ephys.github.io/gui-docs/User-Manual/Plugins/Acquisition-Board.html#impedance-testing) y siga las impedancias del canal objetivo del fabricante de la sonda de silicona o de la hoja de datos. Si las impedancias son demasiado altas, considere recubrir los sitios de los electrodos23. Suelde un zócalo de cola de soldadura de 0.05″ (consulte la Tabla de materiales) al cable de tierra (GND) de la sonda. Conecte el enchufe a la clavija GND (siguiente paso) durante la cirugía.NOTA: En este protocolo, no se utiliza un pin de referencia (REF) separado, ya que GND y REF están cortocircuitados en la etapa principal utilizada. Por lo tanto, solo se mencionará el pin GND en el resto del protocolo. Si se utiliza una REF independiente, repita el siguiente paso para el pin REF. Para preparar el pin GND, inserte repetidamente el lado del pin de un zócalo de cola de soldadura de 0.05″ (consulte la Tabla de materiales) en el zócalo de cola de soldadura GND de 0.05″ hasta que la inserción sea prácticamente sin esfuerzo. El uso de alfileres chapados en oro puede reducir la necesidad de este paso de alisado. Esto asegura que el pin y el zócalo GND se puedan conectar fácilmente durante la cirugía sin necesidad de aplicar una presión excesiva, lo que reduce el riesgo de lesiones para el animal y daños en la sonda. Si se utiliza un preamplificador implantable para la sonda de silicona, prepárelos para la implantación crónica siguiendo los procedimientos del proveedor. A continuación, fije el amplificador/conector al anillo de la jaula de Faraday utilizando yeso de silicona para pegarlo en la zona del anillo de Faraday diseñada para sujetar el amplificador (véase la Figura 1).NOTA: La preparación del preamplificador implantable para la sonda de silicio para la implantación crónica siguiendo los procedimientos del proveedor puede incluir recubrirlos con silicona o epoxi para evitar que la humedad dañe la electrónica, así como acoplar repetidamente el conector del amplificador para reducir la fuerza de acoplamiento al conectar el amplificador al sistema de grabación durante las grabaciones. Esto es especialmente útil para los usuarios de Omnetics. 2. Preparación del microdrive y del arnés Gire el tornillo del cuerpo del microaccionamiento de modo que la lanzadera del microaccionamiento quede casi completamente retraída hacia arriba. Opcionalmente, fije un espaciador en ángulo (consulte la figura 1D) a la parte inferior del microaccionamiento con pegamento de cianoacrilato o cemento dental, que se puede usar para permitir que se use un grado específico de inclinación, por ejemplo, cuando se registra a través de capas corticales en una región dentro del surco central, o dentro de estructuras profundas que pueden requerir un enfoque no perpendicular (para espaciador en ángulo, ver Tabla de Materiales). Coloque el microdrive horizontalmente sobre el soporte del microdrive (Figura complementaria 1). Coloque un pequeño trozo de masilla adhesiva (consulte la tabla de materiales) en el soporte del microaccionamiento a una distancia por encima del microaccionamiento en el que se colocará el conector de la etapa principal. Esta distancia depende de la longitud del cable flexible que conecta la sonda de silicona al conector de la cabecera. Coloque una pequeña gota de yeso de silicona (consulte la tabla de materiales) en la lanzadera. Saque la sonda de silicona de su embalaje con la ayuda de unas pinzas romas de punta blanda. Hágalos recubriendo pinzas de punta de aguja estándar con un tubo termorretráctil de 3 mm de diámetro (consulte la tabla de materiales). Coloque la sonda con el cable flexible primero en la lanzadera del microaccionamiento de modo que el borde inferior del cable flexible cuelgue ligeramente sobre el borde inferior de la lanzadera del microaccionamiento. Tire suavemente del cable flexible hacia la parte superior del microdrive hasta que el borde inferior del cable flexible se encuentre con el borde inferior de la lanzadera del microdrive. Asegúrese de empujar el cable flexible contra el borde izquierdo de la lanzadera de microdrive durante este paso para que quede exactamente vertical en el microdrive en el extremo. En este punto, asegúrese de que los vástagos de la sonda de silicona no sobresalgan (o solo mínimamente) más allá del borde inferior del micromotor (dependiendo de la longitud exacta de los vástagos de la sonda y la profundidad del área cerebral objetivo). Coloque el conector de la etapa principal de la sonda en la masilla adhesiva en la parte superior del soporte para proteger la sonda y evitar que se caiga. Utilice una aguja de jeringa de 27 G para aplicar una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato (consulte la tabla de materiales) entre el cable flexible y la lanzadera para asegurar la sonda en su lugar. Asegúrese de que el pegamento no se escurra en el microdrive o a lo largo del cable flexible más allá de la lanzadera (esto es muy importante) Una vez que el cable flexible esté pegado en su posición, fije el amplificador al anillo de la corona (consulte la tabla de materiales) con yeso de silicona. A continuación, conecte el cable flexible al amplificador y cubra la conexión y el cable con una fina capa de yeso de silicona. Después de 5 minutos, cuando el yeso esté listo, guarde el microdrive y la sonda de forma segura hasta su uso posterior. Corte pedazos de malla de cobre (ver Tabla de Materiales) en forma de rosquilla abierta (vea el patrón de corte en la Figura Suplementaria 2) para cubrir la jaula de Faraday. Fije el recorte de malla de cobre a la jaula de Faraday con pequeñas gotas de resina epoxi (consulte la tabla de materiales). Para este paso, también se puede reemplazar el epoxi con cemento dental.NOTA: La jaula de Faraday contiene un espacio para albergar un conector de sonda o amplificador. Este espacio está marcado con una X en el archivo de diseño, y contiene una base de soporte para el amplificador/conector, así como una mayor distancia entre los dos radios adyacentes de la jaula. Para crear suficiente espacio alrededor del amplificador/conector, fije una pequeña cantidad de malla adicional entre los dos radios adyacentes, creando una protuberancia. Esto garantiza que el amplificador/conector pueda colocarse posteriormente en este “bolsillo” sin tocar la jaula de Faraday. Para garantizar una adherencia segura con una deformación mínima, utilice el anillo de corona colocado directamente sobre la corona para mantener la forma y apoyar los radios finos de la corona. Además, utilice manos amigas para soldar para asegurar la corona y la malla durante el secado. Si uno tiene dificultades para mantener la forma de la corona cuando se somete al procedimiento, intente aplicar epoxi solo dos de los brazos de la corona a la vez para evitar que se deformen. Si se desea una conexión a tierra separada de la jaula de Faraday, suelde un pequeño pin de cabecera en un cable de conexión a tierra de 30 mm (consulte la Tabla de materiales), luego use epoxi conductor para adherir el cable al corte de la malla de cobre.NOTA: Este paso no se cumple en el laboratorio. En este punto, almacene las piezas preparadas de forma segura y realice la cirugía en una etapa posterior.NOTA: En las secciones 3 a 6 se analiza la implantación del microaccionamiento y el arnés. 3. Cirugía: Preparación de la sonda y del espacio de trabajo Esterilice y coloque los instrumentos quirúrgicos en el espacio de trabajo quirúrgico después de un procedimiento aprobado.NOTA: Esto puede incluir el uso de un esterilizador de perlas, instrumentos de autoclave o enjuague con peróxido al 30% o etanol al 90%, según el protocolo experimental aprobado. Coloque el plato de cerámica utilizado para preparar el cemento dental en una caja de hielo, refrigerador o congelador, siguiendo las instrucciones del kit de cemento dental (consulte la Tabla de materiales). Use el plato de cerámica enfriado durante la mezcla de cemento para aumentar el tiempo que el cemento es maleable. Utilice un plato enfriado siempre que se requieran pasos de cementación más largos. Si se desea la verificación histológica de la colocación de la sonda al final del experimento, extienda la sonda de silicona justo antes de la cirugía girando el tornillo del micromotor en sentido contrario a las agujas del reloj y aplique un tinte lipofílico (consulte la Tabla de materiales) a la sonda sumergiéndola en una pequeña gota del tinte. Prepare el colorante lipofílico a partir de una solución madre diluida de dimetilsulfóxido (DMSO) o etanol (EtOH) comprada comercialmente (consulte la Tabla de materiales) diluyéndola en un tampón adecuado, como PBS, a una concentración de 1-5 μM. 4. Cirugía: Preparación del animal Siga un protocolo de anestesia aprobado para una cirugía con roedores de 2 a 4 h en condiciones asépticas. Esto puede incluir anestesia general y local, analgesia, aplicación de ungüentos para los ojos e inyecciones de solución salina. En este caso, utilice anestesia inyectable (ketamina 100 [mg/kg]/medetomidina 0,5 [mg/kg]) junto con crema analgésica local y ungüento para los ojos (ver Tabla de materiales), y coloque al animal sobre una almohadilla térmica para regular la temperatura corporal. Cuando el animal esté completamente anestesiado, muévalo a un área de afeitado separada y no estéril.Asegúrese de que el animal esté lo suficientemente caliente; Por ejemplo, colócalo sobre una almohadilla térmica. Quita el vello de la parte superior del cráneo. Hazlo con una afeitadora eléctrica o una crema depilatoria (ver Tabla de Materiales) o afeitando repetidamente la parte superior de la cabeza con un bisturí cubierto con etanol al 70%. Retire con cuidado los pelos sueltos para asegurarse de que no entren en contacto con el tejido expuesto más adelante. Para eliminar el vello, utilice, por ejemplo, pañuelos humedecidos con etanol al 70% y/o una bomba de bola exprimible. Si usa crema depilatoria, asegúrese de eliminarla bien con hisopos de algodón y solución salina. Desinfecte el área afeitada varias veces con un desinfectante a base de yodo (consulte la Tabla de materiales) y alcohol con hisopos de algodón, moviéndose desde el centro de la cabeza hacia los lados para cepillar los pelos sueltos restantes del sitio de la incisión. Desinfecte el pelaje de la cabeza y alrededor de ella con betadine. Esto garantiza un área de trabajo estéril y protege los instrumentos y materiales quirúrgicos para que no entren en contacto con pieles no estériles. Coloque al animal en un marco estereotáctico usando barras para los oídos y soporte para la nariz (ver Tabla de Materiales). Con unas tijeras quirúrgicas pequeñas (ver Tabla de Materiales), corte una abertura en forma de almendra en la piel de la parte superior del cráneo, que llegue desde la parte posterior de la sutura lambda hasta entre los ojos. Retire la membrana subcutánea y el periostio cortando mientras aún están húmedos, luego rasque el cráneo con una hoja de bisturí para eliminar el tejido blando de la membrana en la superficie del cráneo que pueda impedir la adhesión del cemento dental. Opcional: Una vez que el cráneo se haya limpiado de tejido de membrana, aplique brevemente una capa delgada de peróxido al 0.5% y lávela con desinfectante de yodo a base de agua (por ejemplo, Betadine) antes de raspar la superficie del cráneo para mejorar la adherencia del cebador al cráneo. Raspa con cuidado la superficie del cráneo rascando un patrón entrecruzado con la punta del bisturí al revés. Esto ayuda a que el cemento dental se adhiera al cráneo más tarde.NOTA: No rasque con demasiada fuerza la parte superior de las suturas, ya que esto puede hacer que las suturas se rompan y pierdan líquido intracraneal, lo que perjudica la adherencia del cemento dental. Alterne entre la hoja de bisturí y los bastoncillos de algodón estériles para rascar/empujar suavemente los músculos del cuello unidos a los lados de la sutura lambda hasta que los músculos hayan sido empujados hacia atrás hasta el “borde” del cráneo en la parte superior del cerebelo. Esto ayuda a minimizar el ruido muscular en las grabaciones neuronales. Llene una jeringa de 1 ml con una aguja de 27 g (ver Tabla de Materiales) con pequeñas cantidades de pegamento de cianoacrilato quirúrgico (ver Tabla de Materiales). Luego, pega la piel a los bordes del cráneo con la jeringa para untar pequeñas gotas de superpegamento sobre ella. Pegue el tejido lo más plano posible al cráneo para dejar espacio para los implantes. Este procedimiento asegura que la piel y los músculos no entren en contacto directo con partes del implante, lo que evita el ruido muscular en las grabaciones y mejora la adherencia del cemento dental. Aplique imprimación de cemento dental en el cráneo para una mayor adherencia y endurezca con luz ultravioleta (consulte la tabla de materiales). Esto mejora la adherencia del cemento dental y evita que las suturas craneales se filtren y debiliten la unión cráneo-cemento con el tiempo. Encuentre la ubicación objetivo para el implante de la sonda en relación con bregma o lambda y delinee la craneotomía a su alrededor con un marcador quirúrgico. Coloque la placa de la cabeza en el cráneo de modo que la craneotomía quede dentro de él, con espacio para el micromotor a un lado de la craneotomía, así como para 1-2 clavijas de conexión a tierra. Implante la placa de cabeza con cemento dental. Mezcle el cemento dental en el plato de cerámica enfriado designado (consulte el paso 3.2). Asegúrese de que la placa de la cabeza se adhiera al cráneo por todos los lados, formando un “pozo” hermético. Con un taladro dental (tamaño US 1/2 HP), perfore un pequeño orificio de fresa del ancho de los pasadores de cabecera preparados en el paso 1.4 sobre las áreas del cerebro que se utilizarán como GND / REF. Si desea conectar a tierra la jaula de Faraday, perfore otro pequeño orificio cerca del borde de la jaula de Faraday para el pin del cabezal de Faraday-GND.NOTA: Para los pines del cabezal GND/REF, coloque la craneotomía a una distancia suficiente del borde de la jaula para que el propio pin del cabezal pueda colocarse dentro de él más tarde sin tocar la jaula de Faraday. Limpie la craneotomía goteando suavemente solución salina estéril sobre ella con una jeringa y retirándola con toallitas que no se desprendan (consulte la Tabla de materiales). Repita hasta que se elimine toda la sangre y el tejido suelto. Prepare una solución de agar al 0,7% (ver Tabla de Materiales) en solución salina, enfríela ligeramente e introdúzcala en la craneotomía con una aguja de 27 G en una jeringa de 1 mL. Inserte suavemente un clavo GND (consulte el paso 1.3) en cada craneotomía perforada en el paso anterior. Los alfileres estarán rodeados de agar en todos los lados (ver paso 4.17). Aplique cemento alrededor de los pasadores del cabezal para asegurarlos y proporcionar aislamiento eléctrico. Limpie el plato de cerámica y vuelva a colocarlo en el refrigerador / congelador. Con un taladro dental, perfora el contorno de una craneotomía más grande (circular o cuadrada) moviéndote alrededor del borde con movimientos constantes. Asegúrese de que la craneotomía sea de 1 mm x 1 mm a 2 mm x 2 mm para permitir pequeños ajustes en la colocación de la sonda para evitar los vasos sanguíneos sin exponer demasiado la corteza. Si es posible, evite colocar craneotomías sobre las suturas. Perfore en rondas de 20-30 s y enfríe el cráneo con solución salina entre rondas de perforación.NOTA: Al comenzar a perforar, es útil marcar el borde de ataque del microaccionamiento con un marcador, asegurándose así de que al perforar, se pueda formar un borde recto en paralelo al borde de ataque del microaccionamiento. Esto mejora las posibilidades de evitar el cemento en la craneotomía al fijar el microdrive en su lugar, así como mejorar la adherencia, evitando el sobrevolamiento del microdrive sobre la craneotomía y permitiendo una mayor maniobrabilidad lateral al colocar el microdrive en relación con la posición final del sitio de registro. Después de algunas rondas iniciales de perforación, pruebe la resistencia de la porción perforada del hueso empujándola suavemente con pinzas finas (tamaño 5 o más fino; consulte la tabla de materiales).Siga probando entre rondas de perforación hasta que el hueso comience a “rebotar” debajo de las pinzas cuando se empuje. Cuando este sea el caso, agregue una gota de solución salina sobre la craneotomía para ablandar el hueso, luego use las pinzas para quitar suavemente la pieza de hueso perforada. Si el hueso no se puede quitar suavemente, haga otra ronda de perforación, concentrándose en los puntos donde el hueso aún está unido con más fuerza. En general, trate de extraer el cráneo con una presión suave de las pinzas antes de que se haya perforado por completo, ya que esto generalmente minimiza el daño tisular.NOTA: Asegúrese de que la superficie de la duramadre se humedezca regularmente, tanto durante la perforación para reducir las temperaturas como después de la extracción del colgajo óseo. Esto mejora las posibilidades de una fácil inserción de la sonda al evitar que la duramadre se seque y se vuelva más difícil de penetrar. Si la duramadre resulta ser demasiado dura para penetrar, o si se utilizan sondas romas o de múltiples vástagos, se realiza una durotomía levantando la duramadre con una aguja de 27 G y realizando una pequeña incisión bajo inmersión salina para evitar que la duramadre se pegue a la superficie del cerebro. Cubra la craneotomía con una esponja hemostática (consulte la Tabla de materiales) empapada en solución salina fría y estéril para proteger la duramadre y el cerebro. 5. Cirugía: Implantación de la sonda Coloque el soporte de microdrive personalizado (consulte la tabla de materiales) en el brazo del aparato estereotáctico. Si el microdrive se retiró del soporte del microdrive después de la preparación de la sonda, coloque el microdrive con la sonda de silicona adjunta en el soporte del microdrive. Incline el brazo estereotástico según sea necesario para alcanzar el área cerebral objetivo deseada. Coloque el anillo de corona con el amplificador conectado en las tres clavijas verticales en la parte posterior del soporte del microaccionamiento (consulte la Figura complementaria 1). Baje el microdrive hasta ~0,5 mm de la craneotomía, luego use pinzas para conectar los pines del cabezal GND/REF conectados a la sonda con los pines GND/REF correspondientes implantados en el cráneo (consulte los pasos 4.14-4.15). Consulte la Figura complementaria 3 y la Figura complementaria 4 para ver ejemplos de impulsión, craneotomía y colocación de clavijas GND/REF. Una vez en su lugar, opcionalmente asegure las clavijas con una gota de epoxi de plata conductor (consulte la Tabla de materiales) para una conexión más robusta. Una vez que el epoxi de plata esté curado, cubra los clavos conectados con una pequeña cantidad de cemento dental (consulte la Tabla de materiales) para asegurarse de que la conexión permanezca estable durante largos períodos y que no haya conexión eléctrica con los tejidos circundantes y/o los elementos del implante. Retire la esponja hemostática de la craneotomía (ver paso 4.22). Coloque el brazo estereotáctico con el microimpulsor sobre la craneotomía.NOTA: Si la sonda está retraída, asegúrese de que el micromotor esté colocado de manera que la sonda toque una parte de la craneotomía que no contenga vasos sanguíneos grandes. Baje el microdrive, si es necesario, ajustando la ubicación y el ángulo hasta que el vástago de la sonda toque la duramadre o la superficie del cerebro (consulte el paso 4.21) en el área objetivo. Mezcle el cemento dental en la placa de cerámica designada (consulte el paso 3.2) y cemente la base del micromotor en su lugar, concentrándose en los tres lados de la base del micromotor que no están orientados hacia el electrodo. Asegúrese de que el cemento no toque el microaccionamiento por encima de la “base” extraíble (ver Figura 1D).Asegúrese de que cualquier espacio entre la base y el cráneo esté completamente cubierto con cemento dental. Limpie el plato de cerámica y vuelva a colocarlo en el refrigerador / congelador. Espere a que el cemento se cure, aproximadamente 10-15 min.NOTA: Se deja un pequeño espacio entre la base del micromotor y el cráneo, y el cemento se utiliza en su forma más fluida para rellenarlo. Una vez que el cemento se ha espesado ligeramente, se acumula el cemento entre las paredes de la base del micromotor y el cráneo. Siempre se utilizan cantidades muy pequeñas de cemento, ya que el flujo de la sustancia puede ser impredecible y volúmenes más grandes pueden fluir hacia regiones no deseadas. Se pueden usar pequeñas cantidades de esponja hemostática sumergida en solución salina para cubrir partes de la craneotomía. Si el cemento fluye accidentalmente sobre la craneotomía, retírelo con pinzas una vez que adquiera una consistencia similar a una película. Baje la sonda de silicona sobre el cerebro, monitoreando cuidadosamente la posición de la sonda a través de un microscopio. Cuando los vástagos de la sonda toquen el cerebro, baje la sonda rápidamente en ~ 250 μm (una vuelta completa del tornillo es 282 μm) para asegurarse de que la sonda rompa la resistencia de la superficie duramadre / cortical.Compruébalo visualmente. Si la sonda no ha entrado en la corteza, espere 5 minutos, luego intente grabar a través de la duramadre con la punta del vástago subiendo y bajando repetidamente la sonda unas pocas decenas de micrómetros mientras la duramadre/corteza está bajo tensión desde la punta de la sonda. Una vez que la sonda haya atravesado la superficie de la corteza, bájela gradualmente a un ritmo más lento (100-200 μm / min) hasta que se alcancen las coordenadas objetivo o la sonda se haya movido más de 1000 μm. Si el objetivo requiere que la sonda se mueva más de 1000 μm, avance la sonda en pasos de un máximo de 1000 μm/sesión durante las siguientes sesiones de grabación hasta que se alcancen las coordenadas del objetivo.NOTA: Omita este paso si prefiere monitorear las señales neuronales mientras baja la sonda de silicona. Los pasos para esto se describen en la sección 7. Prepare el elastómero de silicona de acuerdo con las instrucciones (consulte la Tabla de materiales) y dispense una pequeña gota en la craneotomía con una jeringa de 1 ml (consulte la Tabla de materiales). Una vez seco, cubra el elastómero de silicona con una mezcla 50/50 de cera de hueso y aceite mineral. Este paso protege aún más la sonda y evita la acumulación de residuos y plasma seco sobre la craneotomía, lo que hace que la extracción sea más sencilla y segura. Tenga cuidado, ya que trabajar alrededor de la sonda mientras está bajada puede provocar roturas. 6. Cirugía: Implantación de la jaula de Faraday Cuando el cemento dental se haya solidificado por completo, afloje el soporte del microaccionamiento aflojando el tornillo lateral que fija el accionamiento con una llave Allen (consulte la figura complementaria 1). Retraiga suavemente el soporte ~1 cm para que el microdrive quede independiente, pero el amplificador/conector de la sonda permanezca fijo al soporte del implante sin estirar el cable flexible. Coloque la corona prefabricada y la malla de Faraday alrededor de la placa principal estirando la jaula en la abertura y colocándola horizontalmente sobre el microdrive y el cable flexible, luego fíjela a la placa principal con cemento dental.NOTA: Asegúrese de cerrar todos los espacios entre la jaula de Faraday y el cráneo con cemento dental para proteger el implante de la contaminación. Coloque el anillo de la corona de Faraday (consulte la tabla de materiales) con el conector de la sonda/cabezal sobre la corona, alineando el soporte integrado para el amplificador/conector de la sonda con el área marcada con una ‘X’ sangrada en la corona de Faraday (consulte el paso 2.13). Asegure el anillo a la jaula de Faraday con una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato o cemento dental en cada unión del anillo de radios. Una vez que el anillo de Faraday con amplificador/conector de sonda integrado esté asegurado en su lugar, retraiga completamente el brazo estereotáctico con el soporte de microdrive. Consulte la Figura complementaria 3 para obtener una guía paso a paso sobre el ensamblaje de estos componentes. 7. Registro de pruebas postoperatorias Conecte el amplificador/conector de la sonda al hardware de grabación e inicie una grabación. Si la sonda aún no ha alcanzado su ubicación objetivo durante la inserción inicial (consulte el paso 5.9), gire lentamente el tornillo del microaccionamiento en sentido contrario a las agujas del reloj para bajar la sonda mientras monitorea las señales neuronales.NOTA: Las señales deben cambiar a) cuando los electrodos tocan la capa de elastómero de silicona por encima de la craneotomía, y b) cuando los electrodos comienzan a moverse hacia el cerebro (ver paso 7.2). La actividad neuronal de alta frecuencia será registrada por electrodos que están completamente insertados en el cerebro, mientras que los electrodos que están en contacto con el LCR en la superficie del cerebro generalmente mostrarán una señal de población neuronal filtrada de paso bajo sin actividad de pico (similar a un rastro de EEG), y los sitios de registro en el aire registrarán un aumento del ruido eléctrico. Es posible verificar adicionalmente la profundidad de inserción de la sonda midiendo la impedancia de los canales individuales después de la grabación de la prueba. Los canales en contacto con el aire deben mostrar alta impedancia (lo que indica un circuito abierto) e impedancias similares a las medidas antes de la cirugía para los canales que tocan el líquido cefalorraquídeo o que ya están en el cerebro. Avance la sonda de silicio una distancia total máxima de aproximadamente 1000 μm por sesión, con una velocidad máxima de aproximadamente 75 μm/min (consulte el paso 5.5). Cuando los potenciales de campo local neuronal sean visibles a través de la sonda y/o la sonda avance un máximo de 1000 μm, finalice la grabación de la prueba y desconecte el conector de la etapa principal. 8. Recuperación Cubra la jaula de Faraday con una envoltura veterinaria autoadhesiva (consulte la tabla de materiales). Finalice la anestesia y deje que el animal se recupere durante unos días siguiendo las pautas experimentales aprobadas. Si los electrodos de la sonda de silicona aún no están en la ubicación objetivo deseada, gire el tornillo del micromotor en pequeños pasos con un máximo de cuatro vueltas completas (o ~1000 μm) por sesión. Si es necesario, repita este procedimiento durante varios días hasta alcanzar el objetivo. Se recomienda combinar el movimiento de la sonda con registros simultáneos para evaluar la actividad electrofisiológica en las áreas atravesadas. 9. Experimentos conductuales y registros crónicos Para registros crónicos de la cabeza fijada durante la realización de la tarea, fije la placa de cabeza en la base de la jaula de Faraday a la abrazadera de fijación de la cabeza abriendo manualmente la abrazadera y sujetando la placa de cabeza implantada (consulte la Figura 1C, E, F).NOTA: Si no es necesaria la fijación de la cabeza, este sistema de implante también se puede utilizar para grabaciones de movimiento libre. Para las grabaciones que se mueven libremente, omita los pasos 9.1 y 9.7. Retire la envoltura veterinaria autoadhesiva del implante.NOTA: Para minimizar la incomodidad para el animal, se sugiere que se inicie una tarea conductual simple y gratificante antes de este paso como distracción mientras el experimentador trabaja con el implante. Conecte el amplificador/conector al equipo de grabación. Realizar grabaciones neuronales a medida que el animal realiza la tarea.NOTA: Si el objetivo es maximizar el número de unidades extracelulares registradas, mueva la lanzadera unas pocas decenas de micrómetros cada vez que disminuya el rendimiento neuronal en un lugar. Tenga en cuenta que después de mover la sonda, la señal puede tardar minutos u horas en estabilizarse. Por lo tanto, podría ser beneficioso mover la sonda al final de una sesión para que la señal pueda recuperarse hasta el inicio de la siguiente sesión. Desconecte el equipo de registro y cubra el implante con una nueva envoltura veterinaria al final del registro de comportamiento. Abra la abrazadera de fijación de la cabeza para separar al animal de la fijación de la cabeza. 10. Recuperación de la sonda Al final de la grabación final, retraiga la sonda de silicona tanto como sea posible en el microdrive girando el tornillo en el sentido de las agujas del reloj. Haga esto mientras el animal está fijo en la cabeza y se comporta bien o con el animal anestesiado en la configuración quirúrgica. Trace la salida de la sonda del cerebro monitoreando las señales neuronales simultáneamente y verificando la firma de los electrodos que están sumergidos en el cerebro, tocando la superficie del cerebro o en contacto con el aire (ver paso 7.3).NOTA: Dependiendo del protocolo histológico y de la sonda, se realizan lesiones electrolíticas antes de retraer la sonda para determinar la ubicación exacta de algunos electrodos en la sonda. Si no es necesario controlar la salida de la sonda a través del registro neuronal, también es posible retraer la sonda una vez que el animal ha sido terminado. Terminar con el animal siguiendo las pautas aprobadas (esto incluye la perfusión del animal si se planea fijar el cerebro para la histología posterior). Espere ~ 10 minutos después de que el animal haya muerto. A continuación, fije la cabeza del animal en la estereotaxia, asegurándose de que la cabeza del animal no pueda moverse durante el explante para evitar la rotura de la sonda. Aplique una gota de solución salina sobre la craneotomía y déjela en remojo durante unos minutos para ablandar el tejido biológico seco en el vástago de la sonda y reducir la posibilidad de rotura del vástago. Coloque el soporte estereotáctico aproximadamente 0,5 cm por encima del microdrive. A continuación, corte el extremo superior de los radios de la jaula de Faraday con unas tijeras quirúrgicas pequeñas (véase la Tabla de materiales) para liberar el anillo de Faraday que sujeta el amplificador/conector y transfiera el anillo de nuevo a las clavijas verticales en la parte superior del soporte estereotáctico (véase el paso 5.1 y la Figura complementaria 1). Corta con cuidado la malla de cobre con las mismas tijeras quirúrgicas cortando áreas de malla en forma de U entre los radios de la corona de Faraday. Luego, corta los radios de plástico de la corona en la base.NOTA: Evite doblar los radios de plástico impresos mientras se cortan, ya que pueden romperse y enviar residuos de plástico volando hacia la sonda. Baje el soporte estereotáctico hasta que el microdrive pueda fijarse en el soporte con el tornillo lateral del soporte, fije el microdrive y, a continuación, afloje el tornillo T1 que conecta el cuerpo del microdrive a la base del microdrive. Retraiga lentamente el brazo estereotáctico con el soporte del implante para levantar el micromotor de su base. Asegúrese de que el microdrive se separe de la base en un ángulo perpendicular (es decir, “verticalmente” desde la base).NOTA: Si el cuerpo y la base del microaccionamiento no se separan fácilmente, verifique que el movimiento del brazo estereotáctico no esté en ángulo con respecto a la orientación del microaccionamiento. Si es necesario, el soporte y el micromotor se vuelven a alinear entre sí aflojando ligeramente la fijación de la cabeza del animal y reposicionándola en consecuencia. La alineación correcta es uno de los aspectos cruciales para una fácil recuperación del microdrive. Además, compruebe si hay algún residuo de cemento dental que conecte el microdrive y la base del microdrive (consulte el paso 5.5). Si es así, el cemento se raspa cuidadosamente con un bisturí y/o un taladro dental, dependiendo de la cantidad de cemento utilizado. Levante el brazo estereotáctico con la sonda adjunta para crear suficiente espacio debajo de él. Retire al animal de la estereotasa y prepare el cerebro siguiendo un protocolo de histología aprobado si lo desea. Recuperar la base de microdrive implantada y limpiarla sumergiéndola en acetona durante varias horas para su posterior reutilización. Coloque una base de microdrive limpia sobre masilla adhesiva (consulte la tabla de materiales), luego baje el microdrive sobre la base y apriete el tornillo. Para evitar roturas, controle la posición de la sonda bajo un microscopio durante todo el proceso. Este paso se puede completar en un momento posterior si primero es necesario limpiar la base de microdrive implantada para su reutilización.NOTA: Este protocolo requiere el uso de masilla adhesiva como plataforma para la base, lo cual es vital ya que asegura la base y al mismo tiempo tiene un grado de elasticidad, asegurando que la base no se deslice y choque con la sonda. La masilla debe tener la forma de una “cara de acantilado” vertical en el lado de la base del micromotor donde se bajará la sonda. Esto asegura que si la sonda se baja más allá de la base, no haga contacto con la masilla que se encuentra debajo. La “torre” de masilla también debe ser lo suficientemente alta como para que, si se baja más allá de la base del microaccionamiento, la sonda no haga contacto con la superficie de la mesa en la que se coloca la masilla. Por último, asegura bien la masilla a la superficie para evitar que resbale o se caiga. Al bajar el microdrive sobre la base del microdrive sostenido por la masilla, asegúrese de tener una vista lateral del perfil desde el microscopio para monitorear el progreso de modo que, a medida que se baja la sonda, no choque con la base ni con la masilla. Limpie y esterilice la sonda siguiendo las instrucciones del fabricante. En el caso de las sondas más comúnmente disponibles, sumérjalas en un limpiador enzimático (consulte la tabla de materiales) durante 12 h, luego enjuague con agua desmineralizada y desinfecte con alcohol. Para ello, coloque la sonda en un vaso de precipitados grande que contenga el limpiador enzimático mientras sigue conectado al soporte del microaccionamiento en el brazo estereotáctico.NOTA: Si lo desea, mida las impedancias de los electrodos en la sonda después de la limpieza para monitorear la degradación potencial de los electrodos individuales. Guarde el microdrive con la sonda limpia de forma segura hasta el próximo experimento.