Het DREAM-implantaat: een lichtgewicht, modulair en kosteneffectief implantaatsysteem voor chronische elektrofysiologie bij muizen die zich op het hoofd fixeren en zich vrij gedragen

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen van de Max Planck Society en goedgekeurd door de ethische commissie van de lokale overheid (Beratende Ethikkommission nach §15 Tierschutzgesetz, Regierungspräsidium Hessen, Projectgoedkeuringscode: F149-2000). Figuur 1: Implantaatontwerp. (A) 3D-weergave van het implantaat dat op een muizenschedel is geplaatst met een siliciumsonde die is aangesloten op een sondeconnector. De centrale opening van de kopplaat is ongeveer 10 mm voor schaal. De hoogte van de aandrijving is ongeveer 17 mm. Het koperen gaas dat de buitenkant van de Faraday-kroon vormt, evenals de aarde/ref-draden, wordt niet getoond. (B) Hetzelfde als (A) met een aansluiting op een versterkerkaart in plaats van een sondeconnector. (C) Geëxplodeerde technische tekening van het implantaat, met de componenten ervan. (D) Weergave van een schuine afstandhouder die onder een microdrive kan worden geïmplanteerd, waardoor de microdrive consistent onder een vooraf bepaalde hoek kan worden geïmplanteerd (hier: 20°). (E) Weergave van een geïntegreerd kopfixatiemechanisme, met de geïmplanteerde kopplaat met Faraday-kroon met de omringende kopfixatieklem en de zwaluwstaartverbinding met de opstelling. (F) Afbeelding van het hoofd van de muis dat op een loopband is bevestigd met behulp van het geïntegreerde hoofdfixatiemechanisme van het implantaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. OPMERKING: In de hoofdstukken 1 en 2 worden de preoperatieve voorbereidingen besproken 1. Voorbereiding van de siliciumsonde In geval van hergebruik van de sonde, reinigt u de siliconensonde volgens de aanbevelingen van de sondeleverancier. Week de sonde 5-10 minuten in enzymatische reiniger (zie Materiaaltabel) en spoel hem vervolgens af in gedemineraliseerd water. Doe dit zo snel mogelijk na explantatie. Week de sonde een dag voor de (her)implantatie minimaal 30 minuten in 70% ethanol voor desinfectie. Meet de kanaalimpedanties om er zeker van te zijn dat ze binnen de specificaties van het opgenomen signaal vallen. Volg het protocol voor het testen van ruisniveaus uit de gebruikershandleiding van Neuropixels22, meet de impedantie via de gewenste opnamesoftware (bijv. https://open-ephys.github.io/gui-docs/User-Manual/Plugins/Acquisition-Board.html#impedance-testing) en volg de impedanties van het doelkanaal van de fabrikant van de siliciumsonde of het gegevensblad. Als de impedanties te hoog zijn, overweeg dan om de elektrodeplaatsen opnieuw te coaten23. Soldeer een 0.05″ soldeerstaartbus (zie Tabel met materialen) aan de massa (GND) draad van de sonde. Sluit de aansluiting aan op de GND-pin (volgende stap) tijdens de operatie.OPMERKING: In dit protocol wordt geen aparte referentie (REF) pin gebruikt, aangezien GND en REF worden kortgesloten op de gebruikte headstage. Daarom zal in de rest van het protocol alleen de GND-pin worden vermeld. Als er een aparte REF wordt gebruikt, herhaalt u de volgende stap voor de REF-pin. Om de GND-pin voor te bereiden, steekt u herhaaldelijk de penzijde van een 0.05″ soldeerstaartdop (zie Materiaaltabel) in de GND 0.05″ soldeerstaartmop totdat het inbrengen grotendeels moeiteloos is. Het gebruik van vergulde pinnen kan de noodzaak van deze gladstrijkstap verminderen. Dit zorgt ervoor dat de GND-pen en -mof tijdens de operatie gemakkelijk kunnen worden aangesloten zonder dat er overmatige druk hoeft te worden uitgeoefend, waardoor het risico op verwondingen bij het dier en sondeschade wordt verkleind. Als een implanteerbare voorversterker voor de siliciumsonde wordt gebruikt, bereid deze dan voor op chronische implantatie volgens de procedures van de leverancier. Bevestig vervolgens de versterker/connector aan de ring van de Faraday-kooi door deze met siliconenpleister vast te lijmen aan het gebied van de Faraday-ring dat is ontworpen om de versterker vast te houden (zie afbeelding 1).OPMERKING: Het voorbereiden van de implanteerbare voorversterker voor de siliciumsonde voor chronische implantatie volgens de procedures van de leverancier kan inhouden dat ze worden bedekt met silicium of epoxy om te voorkomen dat vocht de elektronica beschadigt, evenals het herhaaldelijk koppelen van de versterkerconnector om de koppelingskracht te verminderen bij het aansluiten van de versterker op het opnamesysteem tijdens opnames. Dit is vooral handig voor gebruikers van Omnetics. 2. Voorbereiding van de microdrive en de hoofdband Draai de schroef op de behuizing van de microdrive zodat de microdrive-shuttle bijna volledig naar boven is ingetrokken. Bevestig eventueel een schuine afstandhouder (zie afbeelding 1D) aan de onderkant van de microdrive met cyanoacrylaatlijm of tandheelkundig cement, die kan worden gebruikt om een specifieke mate van kanteling mogelijk te maken, bijvoorbeeld bij opname door corticale lagen in een gebied binnen de centrale sulcus, of binnen diepe structuren die een niet-loodrechte benadering vereisen (voor schuine afstandhouder, zie Tabel met materialen). Leg de microdrive horizontaal op de microdrive-houder (aanvullende afbeelding 1). Plaats een klein stukje zelfklevende stopverf (zie Materiaaltabel) op de microdrive-houder op een afstand boven de microdrive waarop de hoofdstageconnector wordt geplaatst. Deze afstand is afhankelijk van de lengte van de flexkabel die de silicium sonde verbindt met de headstage connector. Plaats een klein druppeltje siliconenpleister (zie Tabel met materialen) op de shuttle. Haal de siliconensonde uit de verpakking met behulp van een botte pincet met zachte punt. Maak deze door een standaard pincet met naaldneus te coaten met krimpkous met een diameter van 3 mm (zie Materiaaltabel). Plaats de sonde met de flexkabel eerst op de shuttle van de microdrive zodat de onderkant van de flexkabel iets over de onderkant van de microdrive shuttle hangt. Trek de flexkabel voorzichtig naar de bovenkant van de microdrive totdat de onderkant van de flexkabel de onderkant van de microdrive-shuttle raakt. Zorg ervoor dat u tijdens deze stap de flexkabel tegen de linkerrand van de microdrive-shuttle duwt, zodat deze aan het uiteinde precies verticaal op de microdrive wordt geplaatst. Zorg er op dit punt voor dat de schachten van de siliconensonde niet (of slechts minimaal) voorbij de onderkant van de microdrive uitsteken (afhankelijk van de exacte lengte van de sondeschachten en de diepte van het beoogde hersengebied). Plaats de hoofdfaseconnector van de sonde op de zelfklevende stopverf aan de bovenkant van de houder om te voorkomen dat de sonde eraf valt. Gebruik een injectienaald van 27 G om een klein druppeltje cyanoacrylaatlijm (zie Materiaaltabel) tussen de flexkabel en de shuttle aan te brengen om de sonde op zijn plaats te houden. Zorg ervoor dat de lijm niet op de microdrive of langs de flexkabel voorbij de shuttle loopt (dit is erg belangrijk) Zodra de flexkabel op zijn plaats is gelijmd, bevestigt u de amplifier aan de kroonring (zie Tabel met materialen) met behulp van siliconenpleister. Bevestig vervolgens de flexkabel aan de amplifier en bedek de aansluiting en kabel met een dunne laag siliconenpleister. Na 5 minuten, wanneer de pleister is uitgehard, bergt u de microdrive en sonde veilig op tot verder gebruik. Snijd stukjes koperen gaas (zie Tabel met materialen) in een open donutvorm (zie snijpatroon in aanvullende figuur 2) om de kooi van Faraday te bedekken. Bevestig de uitsparing van het koperen gaas op de kooi van Faraday met kleine druppels epoxyhars (zie Tabel met materialen). Voor deze stap kan men ook epoxy vervangen door tandheelkundig cement.OPMERKING: De kooi van Faraday bevat een ruimte om een sondeconnector of versterker te huisvesten. Deze ruimte is gemarkeerd met een X in het ontwerpbestand en bevat een ondersteunende basis voor de versterker/connector, evenals een grotere afstand tussen de twee aangrenzende spaken van de kooi. Om voldoende ruimte rond de versterker/connector te creëren, bevestigt u een kleine hoeveelheid extra gaas tussen de twee aangrenzende spaken, zodat er een uitsteeksel ontstaat. Dit zorgt ervoor dat de versterker/connector later in deze ‘pocket’ kan worden geplaatst zonder de kooi van Faraday aan te raken. Om een veilige hechting met minimale vervorming te garanderen, gebruikt u de kroonring die direct op de kroon is geplaatst om de vorm te behouden en de dunne spaken van de kroon te ondersteunen. Gebruik bovendien soldeerhelpende handen om de kroon en het gaas vast te zetten tijdens het drogen. Als men moeite heeft om de vorm van de kroon te behouden tijdens het ondergaan van de procedure, probeer dan slechts twee van de kroonarmen tegelijk te epoxy om kromtrekken te voorkomen. Als afzonderlijke aarding van de kooi van Faraday gewenst is, soldeer dan een kleine koppen op een aardingsdraad van 30 mm (zie Materiaaltabel) en gebruik vervolgens geleidende epoxy om de draad aan de uitsparing van het koperen gaas te bevestigen.OPMERKING: Deze stap wordt in het lab niet gevolgd. Bewaar op dit punt de voorbereide onderdelen veilig en voer in een later stadium een operatie uit.OPMERKING: In de hoofdstukken 3-6 wordt de implantatie van de microdrive en het hoofddeksel besproken. 3. Chirurgie: voorbereiding van sonde en werkruimte Steriliseer chirurgische instrumenten en plaats ze in de chirurgische werkruimte volgens een goedgekeurde procedure.OPMERKING: Dit kan het gebruik van een kralensterilisator, autoclaafinstrumenten of spoelen met 30% peroxide of 90% ethanol omvatten, afhankelijk van het goedgekeurde experimentele protocol. Plaats de keramische schaal die wordt gebruikt om het tandcement te bereiden in een koelbox, koelkast of vriezer volgens de instructies in de tandheelkundig cementkit (zie Materiaaltabel). Gebruik de gekoelde keramische schaal tijdens het mengen van cement om de tijd dat het cement kneedbaar is te verlengen. Gebruik een afgekoelde schaal wanneer langere cementeerstappen nodig zijn. Als histologische verificatie van de plaatsing van de sonde aan het einde van het experiment gewenst is, verleng dan de siliconensonde vlak voor de operatie door de schroef op de microdrive tegen de klok in te draaien en breng een lipofiele kleurstof (zie Materiaaltabel) aan op de sonde door deze in een kleine druppel van de kleurstof te dopen. Bereid de lipofiele kleurstof voor uit een in de handel gekochte verdunde dimethylsulfoxide (DMSO) of ethanol (EtOH) verdunde stockoplossing (zie materiaaltabel) door deze te verdunnen in een geschikte buffer zoals PBS met een concentratie van 1-5 μM. 4. Chirurgie: Voorbereiding van het dier Volg een goedgekeurd anesthesieprotocol voor een 2-4 uur durende knaagdierchirurgie onder aseptische omstandigheden. Dit kan algemene en lokale anesthesie, analgesie, toepassing van oogzalven en injecties met zoutoplossing omvatten. Gebruik hier injecteerbare anesthesie (ketamine 100 [mg/kg]/medetomidine 0,5 [mg/kg]) samen met lokale analgesiecrème en oogzalf (zie materiaaltabel) en plaats het dier op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur te reguleren. Wanneer het dier volledig verdoofd is, verplaats het dan naar een aparte, niet-steriele scheerruimte.Zorg ervoor dat het dier voldoende wordt opgewarmd; Plaats hem bijvoorbeeld op een verwarmingskussen. Verwijder haar op de bovenkant van de schedel. Doe dit met een elektrisch scheerapparaat of ontharingscrème (zie Materiaaltabel) of door de bovenkant van het hoofd herhaaldelijk te scheren met een scalpel bedekt met 70% ethanol. Verwijder losse haren voorzichtig om ervoor te zorgen dat ze later niet in contact komen met blootliggend weefsel. Gebruik voor het verwijderen van haren bijvoorbeeld tissues die bevochtigd zijn met 70% ethanol en/of een knijpbalpomp. Als u ontharingscrème gebruikt, zorg er dan voor dat deze grondig wordt verwijderd met wattenstaafjes en zoutoplossing. Desinfecteer het geschoren gebied meerdere keren met een ontsmettingsmiddel op basis van jodium (zie Materiaaltabel) en alcohol met behulp van wattenstaafjes, beweeg van het midden van het hoofd naar de zijkanten om eventuele resterende losse haren weg te borstelen van de incisieplaats. Ontsmet de vacht op en rond het hoofd met betadine. Dit zorgt voor een steriel werkgebied en beschermt chirurgische instrumenten en materialen tegen contact met niet-steriele vacht. Plaats het dier in een stereotactisch kader met behulp van oorstangen en neushouder (zie Materiaaltabel). Knip met een kleine chirurgische schaar (zie Materiaaltabel) een amandelvormige opening in de huid bovenop de schedel af, die zich uitstrekt van alleen de achterkant van de lambdahechting tot tussen de ogen. Verwijder het onderhuidse membraan en het periosteum door weg te snijden terwijl het nog nat is, en krab vervolgens de schedel met een scalpelmesje om zacht membraanweefsel op het schedeloppervlak te verwijderen dat de hechting van tandheelkundig cement kan belemmeren. Optioneel: Zodra de schedel is ontdaan van membraanweefsel, brengt u kort een dunne laag 0,5% peroxide aan en wast u deze af met een jodiumdesinfectiemiddel op waterbasis (bijv. Betadine) voordat u het oppervlak van de schedel opruwt om de hechting van de primer aan de schedel te verbeteren. Ruw het oppervlak van de schedel voorzichtig op door een kriskras patroon te krassen met de punt van het scalpel ondersteboven. Dit helpt tandheelkundig cement om later aan de schedel te hechten.OPMERKING: Krab niet te krachtig op de hechtingen, omdat hierdoor de hechtingen kunnen scheuren en intracraniale vloeistof kunnen lekken, wat de hechting van het tandcement schaadt. Wissel af tussen een scalpelmesje en steriele wattenstaafjes om de nekspieren die aan de zijkanten van de lambdahechting zijn bevestigd voorzichtig weg te krabben/weg te duwen totdat de spieren zijn teruggeduwd naar de ‘rand’ van de schedel bovenop het cerebellum. Dit helpt om spierruis bij neuronale opnames te minimaliseren. Vul een spuit van 1 ml met een naald van 27 G (zie Materiaaltabel) met kleine hoeveelheden chirurgische cyanoacrylaatlijm (zie Materiaaltabel). Lijm vervolgens de huid met de spuit aan de randen van de schedel om er kleine druppeltjes superlijm overheen te smeren. Lijm weefsel zo plat mogelijk op de schedel om ruimte te laten voor implantaten. Deze procedure zorgt ervoor dat huid en spieren niet in direct contact komen met delen van het implantaat, waardoor spierruis bij opnames wordt vermeden en de hechting van het tandcement wordt verbeterd. Breng tandcementprimer aan over de schedel voor extra hechting en hard uit met UV-licht (zie Materiaaltabel). Dit verbetert de hechting van tandheelkundig cement en voorkomt dat schedelhechtingen gaan lekken en de craniaal-cementverbinding na verloop van tijd verzwakken. Zoek de doellocatie voor de sonde-implantatie ten opzichte van bregma of lambda en schets de craniotomie eromheen met een chirurgische marker. Plaats de hoofdplaat op de schedel zodat de craniotomie erin ligt, met ruimte voor de microdrive aan één kant van de craniotomie, evenals voor 1-2 aardingspennen. Implanteer de kopplaat met tandheelkundig cement. Meng tandheelkundig cement in de daarvoor bestemde gekoelde keramische schaal (zie stap 3.2). Zorg ervoor dat de hoofdplaat aan alle kanten aan de schedel hecht en een waterdichte ‘put’ vormt. Boor met een tandboor (maat US 1/2 HP) een klein braamgat ter breedte van de in stap 1.4 voorbereide koppennen over het (de) hersengebied(en) die als GND/REF moeten worden gebruikt. Als het aarden van de kooi van Faraday gewenst is, boor dan nog een klein braamgat dicht bij de rand van de kooi van Faraday voor de pin van de Faraday-GND-header.OPMERKING: Plaats voor de GND/REF-headerpen(en) de craniotomie op voldoende afstand van de rand van de kooi, zodat de headerpen zelf er later in kan worden geplaatst zonder de kooi van Faraday aan te raken. Reinig de craniotomie door er voorzichtig steriele zoutoplossing op te druppelen met een spuit en deze te verwijderen met niet-vervellende doekjes (zie Materiaaltabel). Herhaal dit totdat al het bloed en losse weefsel is verwijderd. Bereid een 0,7% agar-oplossing (zie Materiaaltabel) in zoutoplossing, koel deze iets af en breng deze in de craniotomie met behulp van een naald van 27 G op een spuit van 1 ml. Steek voorzichtig een GND-pen (zie stap 1.3) in elke craniotomie die in de vorige stap is geboord. De pin(s) worden aan alle kanten omgeven door agar (zie stap 4.17). Breng cement aan rond de koppennen om ze vast te zetten en elektrische isolatie te bieden. Maak de keramische schaal schoon en plaats deze terug in de koelkast/vriezer. Boor met een tandartsboor de omtrek van een grotere craniotomie (rond of vierkant) door in gestage bewegingen langs de rand te bewegen. Zorg ervoor dat de craniotomie 1 mm x 1 mm tot 2 mm x 2 mm is om kleine aanpassingen aan de plaatsing van de sonde mogelijk te maken om bloedvaten te vermijden zonder te veel van de cortex bloot te leggen. Vermijd indien mogelijk het plaatsen van craniotomieën over hechtingen. Boor in rondes van 20-30 s en koel de schedel af met zoutoplossing tussen de boorrondes door.OPMERKING: Wanneer u begint met boren, is het handig om de voorrand van de microdrive af te tekenen met een stift, zodat er bij het boren een rechte rand kan worden gevormd die parallel loopt aan de voorrand van de microdrive. Dit vergroot de kans om cement in de craniotomie te vermijden bij het bevestigen van de microdrive op zijn plaats, evenals het verbeteren van de hechting, het voorkomen van overhang van de microdrive over de craniotomie en het mogelijk maken van een grotere zijdelingse manoeuvreerbaarheid bij het plaatsen van de microdrive ten opzichte van de uiteindelijke positie van de opnameplaats. Test na een paar eerste boorrondes de weerstand van het uitgeboorde deel van het bot door er voorzichtig op te drukken met een fijne pincet (maat 5 of fijner; zie Materiaaltabel).Blijf tussen de boorrondes door testen totdat het bot onder de tang begint te ‘stuiteren’ wanneer het wordt geduwd. Als dit het geval is, voeg dan een druppel zoutoplossing toe aan de craniotomie om het bot zachter te maken en gebruik vervolgens de tang om het uitgeboorde stuk bot voorzichtig te verwijderen. Als het bot niet voorzichtig kan worden verwijderd, doe dan nog een ronde boren, waarbij u zich concentreert op de punten waar het bot nog sterker vastzit. Probeer in het algemeen de schedel met lichte druk van de tang te verwijderen voordat deze volledig is doorboord, omdat dit doorgaans weefselbeschadiging minimaliseert.NOTITIE: Zorg ervoor dat het oppervlak van de dura regelmatig wordt bevochtigd, zowel tijdens het boren om de temperatuur te verlagen als na het verwijderen van de botflap. Dit vergroot de kans op het gemakkelijk inbrengen van de sonde door te voorkomen dat de dura uitdroogt en moeilijker te penetreren wordt. Als de dura te taai blijkt te zijn om door te dringen, of als er stompe sondes of sondes met meerdere schachten worden gebruikt, wordt een durotomie uitgevoerd door de dura op te tillen met een naald van 27 G en een kleine incisie uit te voeren onder onderdompeling in zoutoplossing om te voorkomen dat de dura aan het hersenoppervlak blijft plakken. Bedek de craniotomie met een hemostatische spons (zie Materiaaltabel) gedrenkt in koele, steriele zoutoplossing om de dura en de hersenen te beschermen. 5. Chirurgie: Sonde-implantatie Bevestig de op maat gemaakte microdrive-houder (zie Materiaaltabel) aan de arm van het stereotactische apparaat. Als de microdrive na de voorbereiding van de microdrive uit de microdrive-houder is verwijderd, plaatst u de microdrive met de aangesloten siliconen sonde in de microdrive-houder. Kantel de stereotaxi-arm naar wens om het gewenste doelhersengebied te bereiken. Plaats de kroonring met de aangesloten amplifier op de drie verticale pinnen aan de achterkant van de microdrive-houder (zie aanvullende afbeelding 1). Laat de microdrive zakken tot op ~0.5 mm van de craniotomie en gebruik vervolgens een pincet om de GND/REF-headerpen(en) die aan de sonde zijn bevestigd aan te sluiten op de overeenkomstige GND/REF-pen(en) die op de schedel zijn geïmplanteerd (zie stappen 4.14-4.15). Zie aanvullende afbeelding 3 en aanvullende afbeelding 4 voor voorbeelden van aandrijving, craniotomie en plaatsing van GND/REF-pen. Eenmaal op hun plaats, zet je de pen(s) optioneel vast met een druppel geleidende zilverepoxy (zie Materiaaltabel) voor een robuustere verbinding. Zodra zilverepoxy is uitgehard, bedek u de verbonden pinnen met een kleine hoeveelheid tandheelkundig cement (zie Materiaaltabel) om ervoor te zorgen dat de verbinding gedurende lange perioden stabiel blijft en dat er geen elektrische verbinding is met de omliggende weefsels en/of implantaatelementen. Verwijder de hemostatische spons van de craniotomie (zie stap 4.22). Plaats de stereotactische arm met de microdrive over de craniotomie.OPMERKING: Als de sonde is ingetrokken, zorg er dan voor dat de microdrive zo wordt geplaatst dat de sonde een deel van de craniotomie raakt dat geen grote bloedvaten bevat. Laat de microdrive indien nodig zakken door de locatie en hoek aan te passen totdat de sondeschacht de dura of het hersenoppervlak raakt (zie stap 4.21) in het doelgebied. Meng tandheelkundig cement in de daarvoor bestemde keramische schaal (zie stap 3.2) en cementeer de basis van de microdrive op zijn plaats, waarbij u zich concentreert op de drie zijden van de microdrive-basis die niet naar de elektrode zijn gericht. Zorg ervoor dat het cement de microdrive boven de verwijderbare ‘basis’ niet raakt (zie afbeelding 1D).Zorg ervoor dat alle ruimte tussen de basis en de schedel volledig bedekt is met tandheelkundig cement. Maak de keramische schaal schoon en zet deze terug in de koelkast/vriezer. Wacht tot het cement is uitgehard, ongeveer 10-15 minuten.OPMERKING: Er wordt een kleine opening gelaten tussen de basis van de microdrive en de schedel en het cement wordt in de meest vloeibare vorm gebruikt om het te vullen. Zodra het cement iets is ingedikt, wordt het cement tussen de wanden van de microdrive-basis en de schedel opgebouwd. Er worden altijd zeer kleine hoeveelheden cement gebruikt, omdat de stroom van de stof onvoorspelbaar kan zijn en grotere volumes naar ongewenste regio’s kunnen stromen. Kleine hoeveelheden hemostatische spons gedrenkt in zoutoplossing kunnen worden gebruikt om delen van de craniotomie te bedekken. Als cement per ongeluk op de craniotomie stroomt, verwijder het cement dan met een tang zodra het een filmachtige consistentie krijgt. Laat de siliciumsonde op de hersenen zakken en houd de positie van de sonde zorgvuldig in de gaten door een microscoop. Wanneer de sondeschachten de hersenen raken, laat u de sonde snel met ~250 μm zakken (één volledige omwenteling van de schroef is 282 μm) om ervoor te zorgen dat de sonde de weerstand van het dura/corticale oppervlak doorbreekt.Controleer dit visueel. Als de sonde niet in de cortex is doorgebroken, wacht dan 5 minuten en probeer dan met de schachtpunt door de dura te etsen door de sonde herhaaldelijk enkele tientallen micrometers omhoog en omlaag te brengen terwijl de dura/cortex onder spanning staat van de sondepunt. Zodra de sonde door het oppervlak van de cortex is gebroken, laat u deze geleidelijk in een langzamer tempo (100-200 μm /min) zakken totdat de doelcoördinaten zijn bereikt of de sonde meer dan 1000 μm heeft bewogen. Als het doel vereist dat de sonde meer dan 1000 μm beweegt, beweegt u de sonde in stappen van maximaal 1000 μm/sessie over de volgende opnamesessies totdat de doelcoördinaten zijn bereikt.OPMERKING: Sla deze stap over als het monitoren van neuronale signalen tijdens het laten zakken van de siliciumsonde de voorkeur heeft. De stappen hiervoor worden beschreven in hoofdstuk 7. Bereid siliconenelastomeer volgens de instructies (zie Materiaaltabel) en doseer een kleine druppel in de craniotomie met behulp van een spuit van 1 ml (zie Materiaaltabel). Eenmaal droog, bedek je het siliconenelastomeer met een 50/50 mix van botwas en minerale olie. Deze stap beschermt de sonde verder en voorkomt de ophoping van vuil en droog plasma over de craniotomie, waardoor extractie eenvoudiger en veiliger wordt. Wees voorzichtig, want werken rond de sonde terwijl deze is neergelaten, kan leiden tot breuk. 6. Chirurgie: implantatie van de kooi van Faraday Wanneer het tandcement volledig is gestold, maakt u de houder van de microdrive los door de zijdelingse schroef los te draaien waarmee de drive is bevestigd met een inbussleutel (zie aanvullende afbeelding 1). Trek de houder voorzichtig ~1 cm in zodat de microdrive vrijstaand is, maar de sonde amplifier/connector blijft bevestigd aan de implantaathouder zonder de flexkabel uit te rekken. Plaats de kant-en-klare kroon en het Faraday-gaas rond de kopplaat door de kooi bij de opening uit te rekken en horizontaal over de microdrive en Flex-kabel te schuiven, en bevestig deze vervolgens met tandheelkundig cement op de kopplaat.OPMERKING: Zorg ervoor dat u alle ruimtes tussen de kooi van Faraday en de schedel afsluit met tandheelkundig cement om het implantaat te beschermen tegen besmetting. Plaats de Faraday-kroonring (zie Materiaaltabel) met sondeconnector/hoofdtrap over de kroon en lijn de geïntegreerde houder voor de sonde uit amplifier/connector met het gebied gemarkeerd door een ingesprongen ‘X’ op de Faraday-kroon (zie stap 2.13). Bevestig de ring aan de kooi van Faraday met een klein druppeltje cyanoacrylaatlijm of tandcement bij elke spaak-ringovergang. Zodra de Faraday-ring met geïntegreerde sonde amplifier/connector op zijn plaats is bevestigd, trekt u de stereotactische arm volledig in met de microdrive-houder. Zie aanvullende afbeelding 3 voor een stapsgewijze handleiding voor de montage van deze componenten. 7. Testopname na de operatie Sluit de sonde aan amplifier/connector op de opnamehardware en start een opname. Als de sonde zijn doellocatie nog niet heeft bereikt tijdens de eerste inbrenging (zie stap 5.9), draai dan de microdrive-schroef langzaam tegen de klok in om de sonde te laten zakken terwijl u neuronale signalen bewaakt.OPMERKING: Signalen moeten veranderen a) wanneer de elektroden de laag siliconenelastomeer boven de craniotomie raken, en b) wanneer de elektroden in de hersenen beginnen te bewegen (zie stap 7.2). Hoogfrequente neuronale activiteit wordt geregistreerd door elektroden die volledig in de hersenen zijn ingebracht, terwijl elektroden die in contact komen met de CSF op het hersenoppervlak doorgaans een low-pass-gefilterd neuronaal populatiesignaal vertonen zonder spiking-activiteit (vergelijkbaar met een EEG-spoor), en opnameplaatsen in de lucht zullen verhoogde elektrische ruis registreren. Het is mogelijk om de insteekdiepte van de sonde extra te verifiëren door de impedantie van afzonderlijke kanalen na de testopname te meten. Kanalen die in contact komen met lucht moeten een hoge impedantie vertonen (wat wijst op een open circuit) en impedanties zoals die vóór de operatie zijn gemeten voor de kanalen die CSF raken of al in de hersenen zijn. Schuif de siliciumsonde vooruit met een maximale totale afstand van ongeveer 1000 μm per sessie, met een maximale snelheid van ongeveer 75 μm/min (zie stap 5.5). Wanneer neurale lokale veldpotentialen zichtbaar zijn over de sonde en/of de sonde maximaal 1000 μm is vervroegd, beëindigt u de testopname en koppelt u de hoofdfaseconnector los. 8. Herstel Bedek de kooi van Faraday met zelfklevende veterinaire folie (zie Materiaaltabel). Beëindig de anesthesie en laat het dier een paar dagen herstellen volgens goedgekeurde experimentele richtlijnen. Als de elektroden op de siliciumsonde zich nog niet op de gewenste doellocatie bevinden, draai dan de schroef van de microdrive in kleine stappen met maximaal vier volledige omwentelingen (of ~1000 μm) per sessie. Herhaal deze procedure indien nodig gedurende meerdere dagen totdat het doel is bereikt. Het wordt aanbevolen om de sondebeweging te combineren met gelijktijdige opnames om de elektrofysiologische activiteit in dwarsdoorde gebieden te evalueren. 9. Gedragsexperimenten en chronische opnames Voor chronische opnames van het hoofd tijdens het uitvoeren van taken, bevestigt u de kopplaat aan de onderkant van de kooi van Faraday aan de hoofdfixatieklem door de klem handmatig te openen en de geïmplanteerde kopplaat vast te klemmen (zie afbeelding 1C, E, F).OPMERKING: Als hoofdfixatie niet nodig is, kan dit implantaatsysteem ook worden gebruikt voor vrij bewegende opnames. Sla stap 9.1 en 9.7 over voor vrij bewegende opnamen. Verwijder de zelfklevende veterinaire wikkel van het implantaat.OPMERKING: Om het ongemak voor het dier tot een minimum te beperken, wordt voorgesteld om vóór deze stap een eenvoudige, lonende gedragstaak te starten als afleiding terwijl de onderzoeker met het implantaat werkt. Sluit de versterker/connector aan op de opnameapparatuur. Voer neuronale opnames uit terwijl het dier de taak uitvoert.OPMERKING: Als het doel is om het aantal geregistreerde extracellulaire eenheden te maximaliseren, verplaats de shuttle dan met enkele tientallen micrometers wanneer de neurale opbrengst op een locatie afneemt. Houd er rekening mee dat het na het verplaatsen van de sonde minuten tot uren kan duren voordat het signaal is gestabiliseerd. Daarom kan het nuttig zijn om de sonde aan het einde van een sessie te verplaatsen, zodat het signaal kan herstellen tot het begin van de volgende sessie. Koppel de opnameapparatuur los en bedek het implantaat aan het einde van de gedragsopname in een nieuwe veterinaire wikkel. Open de kopfixatieklem om het dier los te maken van de kopfixatie. 10. Herstel van de sonde Aan het einde van de eindopname trekt u de siliconensonde zo ver mogelijk terug op de microdrive door de schroef met de klok mee te draaien. Doe dit terwijl het dier met het hoofd vast zit en zich gedraagt of terwijl het dier verdoofd is in de chirurgische opstelling. Breng de uitgang van de sonde uit de hersenen in kaart door tegelijkertijd neuronale signalen te monitoren en te controleren op de signatuur van elektroden die in de hersenen worden ondergedompeld, het hersenoppervlak raken of in contact komen met lucht (zie stap 7.3).OPMERKING: Afhankelijk van het histologieprotocol en de sonde worden elektrolytische laesies uitgevoerd voordat de sonde wordt ingetrokken om de exacte locatie van sommige elektroden op de sonde te bepalen. Als het niet nodig is om de uitgang van de sonde via neuronale registratie te controleren, is het ook mogelijk om de sonde in te trekken nadat het dier is beëindigd. Beëindig het dier volgens goedgekeurde richtlijnen (dit omvat het perferen van het dier als het fixeren van de hersenen voor de daaropvolgende histologie is gepland). Wacht ~ 10 minuten nadat het dier is gestorven. Bevestig het dier vervolgens met het hoofd in de stereotaxis en zorg ervoor dat het hoofd van het dier niet kan bewegen tijdens het explanteren om breuk van de sonde te voorkomen. Breng een druppel zoutoplossing aan op de craniotomie en laat deze een paar minuten weken om opgedroogd biologisch weefsel op de sondeschacht te verzachten en de kans op breuk van de schacht te verkleinen. Plaats de stereotactische houder ongeveer 0,5 cm boven de microdrive. Knip vervolgens het bovenste uiteinde van de spaken van de Faraday-kooi af met een kleine chirurgische schaar (zie Materiaaltabel) om de Faraday-ring los te maken die de versterker/connector vasthoudt en breng de ring terug op de verticale pinnen aan de bovenkant van de stereotactische houder (zie stap 5.1 en aanvullende afbeelding 1). Knip het koperen gaas voorzichtig weg met dezelfde chirurgische schaar door u-vormige delen van het gaas tussen de spaken van de Faraday-kroon uit te knippen. Knip vervolgens de plastic spaken van de kroon aan de basis af.NOTITIE: Buig de bedrukte plastic spaken niet terwijl ze worden doorgesneden, omdat ze kunnen breken en plastic vuil in de richting van de sonde kunnen vliegen. Laat de stereotactische houder zakken totdat de microdrive in de houder kan worden bevestigd met behulp van de zijdelingse schroef van de houder, bevestig de microdrive en draai vervolgens de T1-schroef los die de microdrive-behuizing met de microdrive-basis verbindt. Trek de stereotactische arm met de implantaathouder langzaam in om de microdrive van de basis te tillen. Zorg ervoor dat de microdrive onder een loodrechte hoek (d.w.z. ‘verticaal’ van de basis) loskomt van de basis.OPMERKING: Als de behuizing en de basis van de microdrive niet gemakkelijk van elkaar kunnen worden gescheiden, controleer dan of de beweging van de stereotactische arm niet onder een hoek staat ten opzichte van de oriëntatie van de microdrive. Indien nodig worden de houder en de microdrive opnieuw uitgelijnd ten opzichte van elkaar door de fixatie van de kop van het dier iets los te maken en dienovereenkomstig te herpositioneren. De juiste uitlijning is een van de cruciale aspecten voor een eenvoudig herstel van de microdrive. Controleer ook of er tandheelkundig cement achterblijft dat de microdrive en de microdrive-basis verbindt (zie stap 5.5). Als dat het geval is, wordt het cement voorzichtig afgeschraapt met een scalpel en/of tandartsboor, afhankelijk van de hoeveelheid cement die wordt gebruikt. Til de stereotactische arm op met de bevestigde sonde om voldoende ruimte eronder te creëren. Verwijder het dier uit de stereotaxis en bereid de hersenen voor door desgewenst een goedgekeurd histologieprotocol te volgen. Herstel de geïmplanteerde microdrive-basis en reinig deze door deze enkele uren in aceton te laten weken voor later hergebruik. Plaats een schone microdrive-basis op zelfklevende stopverf (zie Materiaaltabel), laat de microdrive vervolgens op de basis zakken en draai de schroef vast. Om breuk te voorkomen, moet u de positie van de sonde gedurende het hele proces onder een microscoop controleren. Deze stap kan op een later tijdstip worden voltooid als de geïmplanteerde microdrive-basis eerst moet worden gereinigd voor hergebruik.OPMERKING: Dit protocol vereist het gebruik van zelfklevende stopverf als platform voor de basis, wat van vitaal belang is omdat het zowel de basis vastzet als een zekere mate van meegeven heeft, zodat de basis niet wegglijdt en tegen de sonde botst. De stopverf moet worden gevormd tot een verticale ‘rotswand’ aan de kant van de microdrive-basis waar de sonde zal worden neergelaten. Dit zorgt ervoor dat als de sonde voorbij de basis wordt neergelaten, deze geen contact maakt met de stopverf eronder. De ‘toren’ van de stopverf moet ook hoog genoeg zijn zodat als deze voorbij de basis van de microdrive wordt neergelaten, de sonde geen contact maakt met het tafeloppervlak waarop de stopverf wordt geplaatst. Bevestig ten slotte de stopverf goed aan het oppervlak om te voorkomen dat deze wegglijdt of valt. Wanneer u de microdrive op de basis van de microdrive laat zakken die door de stopverf wordt vastgehouden, moet u ervoor zorgen dat het zijprofiel van de microscoop de voortgang controleert, zodat de sonde bij het neerlaten niet in botsing komt met de basis of de stopverf. Reinig en steriliseer de sonde volgens de instructies van de fabrikant. Voor de meest algemeen verkrijgbare sondes, week ze gedurende 12 uur in een enzymatische reiniger (zie Materiaaltabel), spoel ze vervolgens af in gedemineraliseerd water en ontsmet ze in alcohol. Doe dit door de sonde in een groot bekerglas met de enzymatische reiniger te laten zakken terwijl deze nog steeds is bevestigd aan de microdrive-houder op de stereotactische arm.NOTITIE: Meet desgewenst de impedanties van de elektroden op de sonde na het reinigen om de mogelijke degradatie van individuele elektroden te controleren. Bewaar de microdrive met de gereinigde sonde veilig tot het volgende experiment.