Métodos para Habilitar a Transcriptômica Espacial de Tecidos Ósseos

O osso é um tecido conjuntivo especializado composto principalmente por fibras de colágeno tipo 1 e sais inorgânicos¹. Como resultado, o osso é incrivelmente forte e rígido, ao mesmo tempo em que é leve e resistente a traumas. A grande força do osso deriva de seu conteúdo mineral. De fato, para qualquer aumento na porcentagem de conteúdo mineral, a rigidez aumenta em cinco vezes². Consequentemente, os investigadores enfrentam problemas significativos quando analisam, por meio de secção histológica, a biologia de uma amostra óssea.

A histologia óssea não descalcificada é viável e, às vezes, necessária, dependendo do tipo de investigação (por exemplo, para estudar a microarquitetura do osso); É, no entanto, muito desafiador, especialmente se os espécimes forem grandes. Nesses casos, o processamento de tecidos para fins histológicos requer várias modificações nos protocolos e técnicas padrão³. Em geral, para realizar avaliações histológicas comuns, os tecidos ósseos são descalcificados logo após a fixação, processo que pode levar de alguns dias a várias semanas, dependendo do tamanho do tecido e do agente descalcificante utilizado⁴. As seções descalcificadas são frequentemente usadas para o exame da medula óssea, o diagnóstico de tumores, etc. Existem três tipos principais de agentes descalcificantes: ácidos fortes (por exemplo, ácido nítrico, ácido clorídrico), ácidos fracos (por exemplo, ácido fórmico) e agentes quelantes (por exemplo, ácido etilenodiaminotetrético ou EDTA)⁵. Ácidos fortes podem descalcificar o osso muito rapidamente, mas podem danificar os tecidos; ácidos fracos são muito comuns e adequados para procedimentos diagnósticos; Os agentes quelantes são de longe os mais usados e apropriados para aplicação em pesquisa, pois, neste caso, o processo de desmineralização é lento e suave, permitindo a retenção de morfologia de alta qualidade e a preservação de informações de genes e proteínas, conforme exigido por muitos procedimentos (por exemplo, hibridização in situ , imunocoloração). No entanto, quando todo o transcriptoma precisa ser preservado, como para análises de expressão gênica, mesmo uma desmineralização lenta e suave pode ser prejudicial. Portanto, melhores abordagens e métodos são necessários quando a análise morfológica dos tecidos precisa ser combinada com análises de expressão gênica das células.

Graças às recentes melhorias no sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) e transcriptômica espacial, agora é possível estudar a expressão gênica de uma amostra de tecido, mesmo quando a inclusão de parafina de fixação em formalina (FFPE) foi usada para armazenar as amostras de tecido ^6,7,8. Essa oportunidade desbloqueou o acesso a um número maior de amostras, como as armazenadas em bancos de tecidos em todo o mundo. Se o scRNA-seq for empregado, a integridade do RNA é o requisito mais importante; no entanto, no caso da transcriptômica espacial de amostras FFPE, tanto os cortes de tecido de alta qualidade quanto o RNA de alta qualidade são necessários para visualizar a expressão gênica dentro do contexto histológico de cada corte de tecido. Embora isso tenha sido facilmente alcançado com tecidos moles, o mesmo não pode ser dito para tecidos duros como ossos. De fato, até onde sabemos, nenhum estudo usando transcriptômica espacial foi realizado em amostras ósseas FFPE. Isso se deve à falta de protocolos que possam processar efetivamente os tecidos ósseos FFPE, preservando seu conteúdo de RNA. Aqui, um método para processar e descalcificar amostras de tecido ósseo recém-obtidas, evitando a degradação do RNA, é fornecido primeiro. Em seguida, reconhecendo a necessidade de análise transcriptômica das amostras de FFPE coletadas em bancos de tecidos em todo o mundo, também são apresentadas diretrizes desenvolvidas para lidar adequadamente com amostras de FFPE de ossos não desmineralizados.