Métodos para permitir la transcriptómica espacial de los tejidos óseos
Summary
En este trabajo describimos un método que permite la descalcificación de los tejidos óseos recién obtenidos y la conservación de ARN de alta calidad. También se ilustra un método para seccionar muestras de huesos no desmineralizados con formalina fija (FFPE) para obtener resultados de buena calidad si no se dispone de tejidos frescos o no se pueden recolectar.
Abstract
Comprender la relación entre las células y su ubicación dentro de cada tejido es fundamental para descubrir los procesos biológicos asociados con el desarrollo normal y la patología de la enfermedad. La transcriptómica espacial es un método potente que permite el análisis de todo el transcriptoma dentro de muestras de tejido, proporcionando así información sobre la expresión génica celular y el contexto histológico en el que residen las células. Si bien este método se ha utilizado ampliamente para muchos tejidos blandos, su aplicación para los análisis de tejidos duros como el hueso ha sido un desafío. El principal desafío reside en la incapacidad de preservar el ARN de buena calidad y la morfología del tejido mientras se procesan las muestras de tejido duro para el corte. Por lo tanto, aquí se describe un método para procesar muestras de tejido óseo recién obtenidas para generar de manera efectiva datos transcriptómicos espaciales. El método permite la descalcificación de las muestras, otorgando secciones de tejido exitosas con detalles morfológicos preservados y evitando la degradación del ARN. Además, se proporcionan directrices detalladas para las muestras que anteriormente estaban incrustadas en parafina, sin desmineralización, como las muestras recogidas de los bancos de tejidos. Con estas directrices, se muestran datos transcriptómicos espaciales de alta calidad generados a partir de muestras de bancos de tejidos de tumor primario y metástasis pulmonares de osteosarcoma óseo.
Introduction
El hueso es un tejido conectivo especializado compuesto principalmente por fibras de colágeno tipo 1 y sales inorgánicas1. Como resultado, el hueso es increíblemente fuerte y rígido y, al mismo tiempo, ligero y resistente a los traumatismos. La gran resistencia del hueso deriva de su contenido mineral. De hecho, para cualquier aumento dado en el porcentaje de contenido de minerales, la rigidez aumenta cinco veces2. En consecuencia, los investigadores se enfrentan a importantes problemas cuando analizan, mediante cortes histológicos, la biología de un espécimen óseo.
La histología ósea no descalcificada es factible y, a veces, necesaria, dependiendo del tipo de investigación (p. ej., para estudiar la microarquitectura del hueso); Sin embargo, es muy desafiante, especialmente si los especímenes son grandes. En estos casos, el procesamiento de tejidos con fines histológicos requiere varias modificaciones de los protocolos y técnicas estándar3. En general, para realizar evaluaciones histológicas comunes, los tejidos óseos se descalcifican inmediatamente después de la fijación, un proceso que puede requerir de unos pocos días a varias semanas, dependiendo del tamaño del tejido y del agente descalcificante utilizado4. Las secciones descalcificadas se utilizan a menudo para el examen de la médula ósea, el diagnóstico de tumores, etcétera. Existen tres tipos principales de agentes descalcificantes: ácidos fuertes (por ejemplo, ácido nítrico, ácido clorhídrico), ácidos débiles (por ejemplo, ácido fórmico) y agentes quelantes (por ejemplo, ácido etilendiaminotrazético o EDTA)5. Los ácidos fuertes pueden descalcificar el hueso muy rápidamente, pero pueden dañar los tejidos; Los ácidos débiles son muy comunes y adecuados para los procedimientos de diagnóstico; Los agentes quelantes son, con mucho, los más utilizados y apropiados para la aplicación en investigación, ya que, en este caso, el proceso de desmineralización es lento y suave, lo que permite la retención de una morfología de alta calidad y la preservación de la información de genes y proteínas, como lo requieren muchos procedimientos (por ejemplo, hibridación in situ , inmunotinción). Sin embargo, cuando es necesario preservar todo el transcriptoma, como en el caso de los análisis de expresión génica, incluso una desmineralización lenta y suave puede ser perjudicial. Por lo tanto, se necesitan mejores enfoques y métodos cuando el análisis morfológico de los tejidos debe combinarse con análisis de expresión génica de las células.
Gracias a las recientes mejoras en la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) y la transcriptómica espacial, ahora es posible estudiar la expresión génica de una muestra de tejido incluso cuando se utilizó la inclusión de parafina de fijación de formalina (FFPE) para almacenar las muestras de tejido 6,7,8. Esta oportunidad ha desbloqueado el acceso a un mayor número de muestras, como las almacenadas en los bancos de tejidos de todo el mundo. Si se va a emplear scRNA-seq, la integridad del ARN es el requisito más importante; sin embargo, en el caso de la transcriptómica espacial de muestras FFPE, tanto las secciones de tejido de alta calidad como el ARN de alta calidad son necesarias para visualizar la expresión génica dentro del contexto histológico de cada sección de tejido. Si bien esto se ha logrado fácilmente con los tejidos blandos, no se puede decir lo mismo de los tejidos duros como el hueso. De hecho, hasta donde sabemos, nunca se ha realizado ningún estudio utilizando transcriptómica espacial en muestras óseas de FFPE. Esto se debe a la falta de protocolos que puedan procesar eficazmente los tejidos óseos FFPE preservando su contenido de ARN. Aquí, primero se proporciona un método para procesar y descalcificar muestras de tejido óseo recién obtenidas evitando la degradación del ARN. Luego, reconociendo la necesidad de un análisis transcriptómico de las muestras de FFPE recolectadas en bancos de tejidos de todo el mundo, también se presentan pautas desarrolladas para manejar adecuadamente las muestras de FFPE de huesos no desmineralizados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, se proporciona un método detallado para preparar bloques de FFPE de huesos descalcificados y preservar la integridad del ARN para la secuenciación (es decir, secuenciación de próxima generación (NGS)) o para otras técnicas relacionadas con el ARN (es decir, hibridación in situ , reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR), etcétera).
El método utiliza EDTA para descalcificar muestras de tejido óseo; la incubación con EDTA per…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por fondos de Pittsburgh Cure Sarcoma (PCS) y el Osteosarcoma Institute (OSI).
Materials
| Advanced orbital shaker | VWR | 76683-470 | Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions. |
| Camel Hair Brushes | Ted Pella | 11859 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Dual Index Kit TS Set A 96 rxns | 10X Genomics | PN-1000251 | Use to perform spatial transcriptomics. |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs Inc | 2701 | Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions. |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | Thermo Fisher Scientific | S312-500 | Use to prepare EDTA 20% pH 8.0. |
| Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Fisherbrand Fine Precision Probe | Fisher Scientific | 12-000-153 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines. |
| High profile diamond microtome blades | CL Sturkey | D554DD | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
| Novaseq 150PE | Novogene | N/A | Sequencer. |
| Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS to perform tissue fixation. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions. |
| Premiere Tissue Floating Bath | Fisher Scientific | A84600061 | Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines. |
| RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Fisher Scientific | 7002 | Use to clean all surfaces as reported in the method instructions. |
| RNeasy DSP FFPE Kit | Qiagen | 73604 | Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines. |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
| Sodium hydroxide | Millipore Sigma | S8045-500 | Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water. |
| Space Ranger | 10X Genomics | 2.0.1 | Use to process sequencing data output . |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions. |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000194 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
| Visium Human Transcriptome Probe Kit Small | 10X Genomics | PN-1000363 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
| Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000188 | Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments. |
| Xylene | Leica Biosystems | 3803665 | Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions. |
References
- Baig, M. A., Bacha, D. . Histology. Bone. , (2024).
- Currey, J. D. The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone. J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).
- Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis. J Vis Exp. (35), e1707 (2010).
- Wallington, E. A. . Histological Methods for Bone. , (1972).
- Callis, G. M., Sterchi, D. L. Decalcification of bone: Literature review and practical study of various decalcifying agents. methods, and their effects on bone histology. J Histotechnol. 21 (1), 49-58 (1998).
- Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The utilization of formalin fixed-paraffin-embedded specimens in high throughput genomic studies. Int J Genomics. 2017, 1926304 (2017).
- Trinks, A., et al. Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) lung cancer tissue. Cell Oncol (Dordr). , (2024).
- Xu, Z., et al. High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq. Nat Commun. 14 (1), 2734 (2023).
- 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE – User Guide., Document Number C CG000407 Rev C. 10x Genomics. , (2021).
- 10x Genomics. Interpreting Space Ranger Web Summary Files for Visium Spatial Gene Expression for FFPE F FFPEAssay., Document Number CG000499 Rev A. 10x Genomics. , (2022).
- 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression for FFPE-Tissue Preparation Guide., Document Number C G CG000408 Rev D. 10x Genomics. , (2022).
