Méthodes pour permettre la transcriptomique spatiale des tissus osseux
Summary
Nous décrivons ici une méthode qui permet de décalcifier les tissus osseux fraîchement obtenus et de préserver l’ARN de haute qualité. Une méthode est également illustrée pour sectionner des échantillons d’os non déminéralisés contenant de la paraffine fixe au formol (FFPE) afin d’obtenir des résultats de bonne qualité si les tissus frais ne sont pas disponibles ou ne peuvent pas être recueillis.
Abstract
Comprendre la relation entre les cellules et leur emplacement dans chaque tissu est essentiel pour découvrir les processus biologiques associés au développement normal et à la pathologie de la maladie. La transcriptomique spatiale est une méthode puissante qui permet d’analyser l’ensemble du transcriptome dans des échantillons de tissus, fournissant ainsi des informations sur l’expression des gènes cellulaires et le contexte histologique dans lequel les cellules résident. Bien que cette méthode ait été largement utilisée pour de nombreux tissus mous, son application pour l’analyse des tissus durs tels que les os a été difficile. Le principal défi réside dans l’incapacité à préserver une bonne qualité de l’ARN et la morphologie des tissus lors du traitement des échantillons de tissus durs pour la section. Par conséquent, une méthode est décrite ici pour traiter des échantillons de tissu osseux fraîchement obtenus afin de générer efficacement des données transcriptomiques spatiales. La méthode permet de décalcifier les échantillons, ce qui permet d’obtenir des coupes de tissus avec des détails morphologiques préservés tout en évitant la dégradation de l’ARN. De plus, des lignes directrices détaillées sont fournies pour les échantillons qui étaient auparavant intégrés à la paraffine, sans déminéralisation, tels que les échantillons prélevés dans des banques de tissus. À l’aide de ces directives, des données transcriptomiques spatiales de haute qualité générées à partir d’échantillons de banques de tissus de tumeurs primaires et de métastases pulmonaires d’ostéosarcome osseux sont présentées.
Introduction
L’os est un tissu conjonctif spécialisé composé principalement de fibres de collagène de type 1 et de sels inorganiques1. En conséquence, l’os est incroyablement solide et rigide tout en étant léger et résistant aux traumatismes. La grande force de l’os provient de sa teneur en minéraux. En fait, pour une augmentation donnée du pourcentage de teneur en minéraux, la rigidité est multipliéepar cinq 2. Par conséquent, les chercheurs sont confrontés à des problèmes importants lorsqu’ils analysent, au moyen d’une coupe histologique, la biologie d’un échantillon osseux.
L’histologie osseuse non décalcifiée est réalisable et parfois nécessaire, selon le type d’investigation (par exemple, pour étudier la micro-architecture de l’os) ; C’est cependant très difficile, surtout si les spécimens sont grands. Dans ces cas, le traitement des tissus à des fins histologiques nécessite plusieurs modifications des protocoles et techniques standard3. En général, pour effectuer des évaluations histologiques courantes, les tissus osseux sont décalcifiés juste après la fixation, un processus qui peut prendre de quelques jours à plusieurs semaines, selon la taille du tissu et l’agent décalcifiant utilisé4. Les coupes décalcifiées sont souvent utilisées pour l’examen de la moelle osseuse, le diagnostic des tumeurs, etc. Il existe trois principaux types d’agents décalcifiants : les acides forts (par exemple, l’acide nitrique, l’acide chlorhydrique), les acides faibles (par exemple, l’acide formique) et les agents chélateurs (par exemple, l’acide éthylènediaminetétracetique ou EDTA)5. Les acides forts peuvent décalcifier les os très rapidement, mais ils peuvent endommager les tissus ; les acides faibles sont très courants et conviennent aux procédures de diagnostic ; Les agents chélateurs sont de loin les plus utilisés et les plus appropriés pour la recherche car, dans ce cas, le processus de déminéralisation est lent et doux, ce qui permet de conserver une morphologie de haute qualité et de préserver l’information sur les gènes et les protéines, comme l’exigent de nombreuses procédures (par exemple, hybridation in situ , immunomarquage). Cependant, lorsque l’ensemble du transcriptome doit être préservé, comme pour les analyses d’expression génique, même une déminéralisation lente et douce peut être préjudiciable. Par conséquent, de meilleures approches et méthodes sont nécessaires lorsque l’analyse morphologique des tissus doit être associée à des analyses de l’expression génique des cellules.
Grâce aux récentes améliorations du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) et de la transcriptomique spatiale, il est désormais possible d’étudier l’expression génique d’un échantillon de tissu, même lorsque l’enrobage de paraffine de fixation au formol (FFPE) a été utilisé pour stockerles échantillons de tissus. Cette opportunité a permis d’accéder à un plus grand nombre d’échantillons, tels que ceux stockés dans des banques de tissus du monde entier. Si le scRNA-seq doit être utilisé, l’intégrité de l’ARN est l’exigence la plus importante ; cependant, dans le cas de la transcriptomique spatiale des échantillons FFPE, des coupes de tissus de haute qualité et de l’ARN de haute qualité sont nécessaires pour visualiser l’expression génique dans le contexte histologique de chaque section de tissu. Bien que cela ait été facilement réalisé avec les tissus mous, on ne peut pas en dire autant des tissus durs comme les os. En effet, à notre connaissance, aucune étude utilisant la transcriptomique spatiale n’a jamais été réalisée sur des échantillons osseux FFPE. Cela est dû à l’absence de protocoles capables de traiter efficacement les tissus osseux FFPE tout en préservant leur contenu en ARN. Ici, une méthode pour traiter et décalcifier des échantillons de tissu osseux fraîchement obtenus tout en évitant la dégradation de l’ARN est d’abord fournie. Ensuite, reconnaissant la nécessité d’une analyse transcriptomique des échantillons FFPE collectés dans les banques de tissus du monde entier, des directives élaborées pour manipuler correctement les échantillons FFPE d’os non déminéralisés sont également présentées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, une méthode détaillée est fournie pour préparer des blocs FFPE d’os décalcifiés et préserver l’intégrité de l’ARN pour le séquençage (c’est-à-dire le séquençage de nouvelle génération (NGS)) ou pour d’autres techniques liées à l’ARN (c’est-à-dire l’hybridation in situ , la réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse quantitative (qRT-PCR), etc.).
La méthode utilise l’EDTA pour décalcifier les échantillons de tissu osseux ;…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds du Pittsburgh Cure Sarcoma (PCS) et de l’Institut de l’ostéosarcome (OSI).
Materials
| Advanced orbital shaker | VWR | 76683-470 | Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions. |
| Camel Hair Brushes | Ted Pella | 11859 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Dual Index Kit TS Set A 96 rxns | 10X Genomics | PN-1000251 | Use to perform spatial transcriptomics. |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs Inc | 2701 | Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions. |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | Thermo Fisher Scientific | S312-500 | Use to prepare EDTA 20% pH 8.0. |
| Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Fisherbrand Fine Precision Probe | Fisher Scientific | 12-000-153 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines. |
| High profile diamond microtome blades | CL Sturkey | D554DD | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
| Novaseq 150PE | Novogene | N/A | Sequencer. |
| Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS to perform tissue fixation. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions. |
| Premiere Tissue Floating Bath | Fisher Scientific | A84600061 | Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines. |
| RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Fisher Scientific | 7002 | Use to clean all surfaces as reported in the method instructions. |
| RNeasy DSP FFPE Kit | Qiagen | 73604 | Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines. |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
| Sodium hydroxide | Millipore Sigma | S8045-500 | Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water. |
| Space Ranger | 10X Genomics | 2.0.1 | Use to process sequencing data output . |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions. |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000194 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
| Visium Human Transcriptome Probe Kit Small | 10X Genomics | PN-1000363 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
| Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000188 | Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments. |
| Xylene | Leica Biosystems | 3803665 | Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions. |
References
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- Currey, J. D. The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone. J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).
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