Methoden zur Ermöglichung der räumlichen Transkriptomik von Knochengewebe
Summary
Hier beschreiben wir eine Methode, die die Entkalkung von frisch gewonnenem Knochengewebe und den Erhalt hochwertiger RNA ermöglicht. Es wird auch ein Verfahren zum Schneiden von FFPE-Proben (Formalin Fixed Paraffin Embedded) von nicht demineralisierten Knochen vorgestellt, um qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erhalten, wenn frisches Gewebe nicht verfügbar ist oder nicht entnommen werden kann.
Abstract
Das Verständnis der Beziehung zwischen den Zellen und ihrer Position in jedem Gewebe ist entscheidend, um die biologischen Prozesse aufzudecken, die mit der normalen Entwicklung und der Krankheitspathologie verbunden sind. Die räumliche Transkriptomik ist eine leistungsfähige Methode, die es ermöglicht, das gesamte Transkriptom innerhalb von Gewebeproben zu analysieren und so Informationen über die zelluläre Genexpression und den histologischen Kontext, in dem sich die Zellen befinden, zu liefern. Während diese Methode in großem Umfang für viele Weichgewebe eingesetzt wurde, war ihre Anwendung für die Analyse von Hartgeweben wie Knochen eine Herausforderung. Die größte Herausforderung besteht darin, dass es nicht möglich ist, bei der Verarbeitung der Hartgewebeproben für die Sektion eine qualitativ hochwertige RNA und Gewebemorphologie zu erhalten. Daher wird hier ein Verfahren beschrieben, um frisch gewonnene Knochengewebeproben zu verarbeiten, um effektiv räumliche Transkriptomik-Daten zu generieren. Die Methode ermöglicht die Entkalkung der Proben, wodurch erfolgreiche Gewebeschnitte mit erhaltenen morphologischen Details möglich sind und gleichzeitig ein RNA-Abbau vermieden wird. Darüber hinaus werden detaillierte Richtlinien für Proben bereitgestellt, die zuvor in Paraffin eingebettet waren, ohne Demineralisierung, wie z. B. Proben, die aus Gewebebanken entnommen wurden. Unter Verwendung dieser Leitlinien werden qualitativ hochwertige räumliche Transkriptomik-Daten gezeigt, die aus Gewebebankproben von Primärtumor- und Lungenmetastasen von Knochenosteosarkomen generiert wurden.
Introduction
Knochen ist ein spezialisiertes Bindegewebe, das hauptsächlich aus Fasern des Kollagens Typ 1 und anorganischen Salzen1 besteht. Dadurch ist der Knochen unglaublich stark und steif und gleichzeitig leicht und traumaresistent. Die große Festigkeit des Knochens beruht auf seinem mineralischen Gehalt. Tatsächlich erhöht sich die Steifigkeit bei jeder Erhöhung des prozentualen Anteils an Mineralien um das Fünffache2. Folglich stehen Forscher vor erheblichen Problemen, wenn sie mittels histologischer Schnitte die Biologie einer Knochenprobe analysieren.
Eine nicht entkalkte Knochenhistologie ist machbar und manchmal erforderlich, je nach Art der Untersuchung (z. B. zur Untersuchung der Mikroarchitektur des Knochens); Es ist jedoch eine große Herausforderung, vor allem, wenn die Exemplare groß sind. In diesen Fällen erfordert die Gewebeaufbereitung für histologische Zwecke mehrere Modifikationen der Standardprotokolle und -techniken3. Im Allgemeinen wird das Knochengewebe direkt nach der Fixation entkalkt, um die üblichen histologischen Untersuchungen durchzuführen, ein Prozess, der je nach Größe des Gewebes und verwendetem Entkalkungsmittel einige Tage bis mehrere Wochen dauern kann4. Entkalkte Schnitte werden häufig für die Untersuchung des Knochenmarks, die Diagnose von Tumoren usw. verwendet. Es gibt drei Haupttypen von Entkalkungsmitteln: starke Säuren (z. B. Salpetersäure, Salzsäure), schwache Säuren (z. B. Ameisensäure) und Chelatbildner (z. B. Ethylendiamintetracetinsäure oder EDTA)5. Starke Säuren können den Knochen sehr schnell entkalken, aber sie können das Gewebe schädigen; schwache Säuren sind sehr verbreitet und eignen sich für diagnostische Verfahren; Chelatbildner sind bei weitem die am häufigsten verwendeten und für Forschungsanwendungen geeigneten, da in diesem Fall der Demineralisierungsprozess langsam und schonend ist und die Beibehaltung einer qualitativ hochwertigen Morphologie und die Erhaltung von Gen- und Proteininformationen ermöglicht, wie sie bei vielen Verfahren (z. B. In-situ-Hybridisierung , Immunfärbung) erforderlich sind. Wenn jedoch das gesamte Transkriptom erhalten werden muss, wie z. B. für Genexpressionsanalysen, kann selbst eine langsame und sanfte Demineralisierung nachteilig sein. Daher sind bessere Ansätze und Methoden erforderlich, wenn die morphologische Analyse der Gewebe mit Genexpressionsanalysen der Zellen gekoppelt werden muss.
Dank der jüngsten Verbesserungen in der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) und der räumlichen Transkriptomik ist es nun möglich, die Genexpression einer Gewebeprobe auch dann zu untersuchen, wenn zur Lagerung der Gewebeproben eine Formalinfixierungsparaffineinbettung (FFPE) verwendet wurde 6,7,8. Diese Möglichkeit hat den Zugang zu einer größeren Anzahl von Proben ermöglicht, wie sie beispielsweise in Gewebebanken weltweit gelagert werden. Wenn scRNA-seq eingesetzt werden soll, ist die RNA-Integrität die wichtigste Anforderung; Bei der räumlichen Transkriptomik von FFPE-Proben sind jedoch sowohl hochwertige Gewebeschnitte als auch hochwertige RNA notwendig, um die Genexpression im histologischen Kontext jedes Gewebeschnitts sichtbar zu machen. Während dies mit Weichteilen leicht zu erreichen war, gilt dies nicht für Hartgewebe wie Knochen. Tatsächlich wurde nach unserem besten Wissen noch nie eine Studie mit räumlicher Transkriptomik an FFPE-Knochenproben durchgeführt. Dies liegt daran, dass es an Protokollen mangelt, die FFPE-Knochengewebe effektiv verarbeiten und gleichzeitig ihren RNA-Gehalt erhalten können. Hier wird zunächst eine Methode zur Aufbereitung und Entkalkung frisch gewonnener Knochengewebeproben unter Vermeidung des RNA-Abbaus bereitgestellt. In Anbetracht der Notwendigkeit einer Transkriptomik-Analyse der FFPE-Proben, die in Gewebebanken weltweit gesammelt wurden, werden auch Richtlinien für den korrekten Umgang mit FFPE-Proben von nicht demineralisierten Knochen vorgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird eine detaillierte Methode zur Präparation von FFPE-Blöcken entkalkter Knochen und zur Erhaltung der RNA-Integrität für die Sequenzierung (d. h. Next-Generation-Sequencing (NGS)) oder für andere RNA-bezogene Techniken (z. B. In-situ-Hybridisierung , quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) usw.) bereitgestellt.
Bei der Methode wird EDTA verwendet, um Knochengewebeproben zu entkalken. Die EDTA-Inkubation ermöglicht eine langsame, aber feine …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde mit Mitteln des Pittsburgh Cure Sarcoma (PCS) und des Osteosarcoma Institute (OSI) unterstützt.
Materials
| Advanced orbital shaker | VWR | 76683-470 | Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions. |
| Camel Hair Brushes | Ted Pella | 11859 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Dual Index Kit TS Set A 96 rxns | 10X Genomics | PN-1000251 | Use to perform spatial transcriptomics. |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs Inc | 2701 | Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions. |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | Thermo Fisher Scientific | S312-500 | Use to prepare EDTA 20% pH 8.0. |
| Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Fisherbrand Fine Precision Probe | Fisher Scientific | 12-000-153 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines. |
| High profile diamond microtome blades | CL Sturkey | D554DD | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
| Novaseq 150PE | Novogene | N/A | Sequencer. |
| Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS to perform tissue fixation. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions. |
| Premiere Tissue Floating Bath | Fisher Scientific | A84600061 | Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines. |
| RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Fisher Scientific | 7002 | Use to clean all surfaces as reported in the method instructions. |
| RNeasy DSP FFPE Kit | Qiagen | 73604 | Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines. |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
| Sodium hydroxide | Millipore Sigma | S8045-500 | Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water. |
| Space Ranger | 10X Genomics | 2.0.1 | Use to process sequencing data output . |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions. |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000194 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
| Visium Human Transcriptome Probe Kit Small | 10X Genomics | PN-1000363 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
| Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000188 | Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments. |
| Xylene | Leica Biosystems | 3803665 | Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions. |
References
- Baig, M. A., Bacha, D. . Histology, Bone. , (2024).
- Currey, J. D. The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone. J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).
- Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis. J Vis Exp. 35, 1707 (2010).
- Wallington, E. A. . Histological Methods for Bone. , (1972).
- Callis, G. M., Sterchi, D. L. Decalcification of bone: Literature review and practical study of various decalcifying agents. methods, and their effects on bone histology. J Histotechnol. 21 (1), 49-58 (1998).
- Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The utilization of formalin fixed-paraffin-embedded specimens in high throughput genomic studies. Int J Genomics. 2017, 1926304 (2017).
- Trinks, A., et al. Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) lung cancer tissue. Cell Oncol (Dordr). , (2024).
- Xu, Z., et al. High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq. Nat Commun. 14 (1), 2734 (2023).
- 10X Genomics. . Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE – User Guide., Document Number C CG000407 Rev C, 10x Genomics. , (2021).
- 10X Genomics. . Interpreting Space Ranger Web Summary Files for Visium Spatial Gene Expression for FFPE F FFPEAssay., Document Number CG000499 Rev A, 10x Genomics. , (2022).
- 10X Genomics. . Visium Spatial Gene Expression for FFPE-Tissue Preparation Guide., Document Number C G CG000408 Rev D, 10x Genomics. , (2022).
