Retrobulbar Sinüs Enjeksiyonu ile Doğum Sonrası, Juvenil ve Runted Yetişkin Fareler için Sistemik Tedavi
Summary
Bu makale, doğum sonrası, juvenil ve koşmuş yetişkin fareler için toplam hacmi 150 μL’ye kadar retrobulbar sinüs enjeksiyonu için bir protokol ve eşlik eden bir video sağlar. Bu prosedür, kuyruk damarı enjeksiyonunun mümkün olmadığı durumlarda küçük farelerin (15 g) enjeksiyonu için özellikle uygundur.
Abstract
Kuyruk ven enjeksiyonları erişkin farelerde sistemik bir doğum yolu olarak sıklıkla kullanılırken, retrobulbar enjeksiyonlar daha az sınırlama ile sistemik doğum için alternatif bir yöntemdir. İlk olarak, kuyruk damarı enjeksiyonları (TVI’ler), kuyruk damarının boyutunun erişim için uygun olduğu yetişkin farelerle sınırlıdır. Yetişkin fareleri tedavi etmekle sınırlı olmak, yetişkinliğe kadar hayatta kalamayan fare modelleriyle uğraşırken sorunlu olabilir. İkincisi, TVI’ler, farelerin hiçbir zaman yetişkin vahşi tip farelerin boyutuna ulaşmadığı büyüme geriliği fenotiplerine sahip fare modelleri için uygun değildir. Bu nedenle, retrobulbar enjeksiyonlar hem genç hem de küçük yetişkin fareleri tedavi etmek için başarıyla kullanılabilir. Son olarak, retrobulbar enjeksiyonlar anestezi altında gerçekleştirilir, bu da fareler üzerinde genellikle anestezi olmadan gerçekleştirilen TVI’lere göre daha az streslidir. Bu makale, küçük ve genç farelere sistemik uygulama için kullanılabilecek retrobulbar enjeksiyonlar için bir protokol ve ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.
Introduction
Genetik hastalıkların murin modelleri, küçük moleküllü, genetik ve hücre tedavilerinin etkinliğini göstermek için yaygın olarak kullanılmaktadır1. Farelerde, insanlara sistemik doğumu çoğaltmak için en yaygın kullanılan yöntem, damarın erişebilecek kadar büyük olmasını sağlamak için tipik olarak yetişkin farelerde yaklaşık 6-8 haftalıkken gerçekleştirilen kuyruk damarı enjeksiyonudur (TVI). TVI, gen terapisi için insan klinik denemelerini destekleyen hemofili gibi genetik hastalıkların çok sayıda klinik öncesi prensip kanıtı çalışmasında başarıyla kullanılmıştır2. Bununla birlikte, genetik hastalığın birçok murin modeli, yetişkin bir farenin yaşına veya boyutuna ulaşmalarını engelleyen büyüme ve/veya erken ölümcüllük fenotiplerine sahiptir (Şekil 1). Bu tür fareleri TVI ile tedavi etmek, ölümcüllük yaşına ve / veya hayvanların ulaşabileceği maksimum boyuta bağlı olarak imkansız olmasa da son derece zor olabilir.
Buna karşılık, bir terapötik ajanın retrobulbar (sıklıkla ve yanlış olarak retro-orbital olarak adlandırılır) sinüs enjeksiyonu ile sistemik olarak verilmesi, yaş veya boyut3’ten bağımsız olarak farelerde oldukça kolay bir şekilde yapılabilir. Adeno-ilişkili virüsün (AAV) retrobulbar enjeksiyonları, metilmalonik asidemi (MMA) ve Niemann-Pick tip C hastalığı 4,5,6,7,8 gibi genetik hastalığın genç büyüme geriliği murin modellerinde başarıyla kullanılmıştır. (Bu prosedür aynı zamanda yenidoğanlara 3,4,9,10 enjekte etmek için de kullanılabilir; ancak, bu teknik bu protokolde veya beraberindeki videoda ayrıntılı olarak açıklanmamıştır.) Doksorubisin gibi yüksek derecede toksik maddeler bile retrobulbar enjeksiyonu11,12 ile güvenli bir şekilde verilebilir. TVI’den farklı olarak, retrobulbar sinüs enjeksiyonları sırasında fareler uyuşturulur, bu da prosedürü fare üzerinde daha az stresli hale getirir ve fareyi fiziksel olarak kısıtlamak zorunda olmayan operatör için daha kolay hale getirir13,14. Ek bir endişe, TVI’nin kuyruk damarını genişletmek için sıklıkla bir ısı lambası kullanmasıdır, bu da genç farelerde potansiyel olarak dehidrasyona neden olabilir ve ısıya bağlı strese daha şüpheli olan genetik hastalığın murin modellerinde sorunlu olabilir. TVI kullanırken ortaya çıkabilecek bir diğer sorun, kuyruk damarının yüksek pigmentli farelerde görüntülenmesinin özellikle zor olabilmesidir. Bununla birlikte, TVI gibi, retrobulbar sinüs enjeksiyonları da geniş bir sistemik biyodağılımile sonuçlanır 15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retrobulbar enjeksiyonu, küçük moleküller, proteinler ve genomik tedaviler sağlamak için güvenilir bir yöntem olsa da, güvenilir ve tekrarlanabilir sistemik iletimin elde edilmesini sağlamak için tekniğin bir boya ile uygulanması gereklidir. Deneylerde bu dağıtım yolunu kullanmadan önce farelerde retrobulbar enjeksiyonları uygulamak için bir boya kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Tutarlı sistemik iletimi sağlamak için boyalar fare dokularında görsel olarak kontrol edilebilir.
Retrobulbar enjeksiyon tekniğinin gösteriminde, işlemden önce fareleri uyuşturmak için izofluran gazı kullanıldı. İşlemden önce diğer anestezi formları kullanılabilir, ancak enjeksiyon tamamlanmadan farenin sedasyondan kurtulmamasını sağlamak önemlidir. Neyse ki, gerçek enjeksiyon genellikle bir dakikadan az sürer ve farenin tamamen uyuşturulması gereken süre kısadır. Enjeksiyon sırasında fare tamamen yatıştırılmalı ve enjeksiyondan önce fare bilinçlenirse anestezi yeniden uygulanmalıdır. Anestezi kullanımıyla ilişkili riskler olduğundan, farenin sedasyon altında kalma süresi en aza indirilmelidir. Metilmalonik ve propiyonik asidemiyi olan küçük hasta fareleri yatıştırmak için izofluran kullanırken sorun yaşamadık. Bununla birlikte, bazı fare modelleri sedasyona ve belirli anesteziye karşı daha hassas olabilir. Bu potansiyel sorun, bir çalışmada sedasyon kullanmaya çalışmadan önce göz önünde bulundurulmalıdır. Son olarak, sedasyonun retrobulbar enjeksiyonu ile birlikte kullanılması, sedasyonun yaygın olarak kullanılmadığı TVI’ye kıyasla, farenin enjeksiyon işlemi sırasında sergilediği belirgin sıkıntıyı büyük ölçüde azaltır.
Enjeksiyon sonrası ile ilgili herhangi bir sorun gözlemlemedik, ancak enfeksiyon herhangi bir enjeksiyonda potansiyel bir risktir. Enfeksiyon olasılığını azaltmak için, saflaştırılmış AAV’yi seyreltmek için steril tek kullanımlık tek kullanımlık bir şırınga ve steril PBS kullanılır. Hayvan tesisimizdeki tüm fareler, potansiyel sağlık sorunlarının belirtileri açısından günlük olarak kontrol edilir ve gerektiğinde herhangi bir sağlık sorununu ele almak için veteriner bakımı alır.
Retrobulbar sinüs enjeksiyonunun alternatifi ve genç ve yetişkin farelere daha yaygın olarak kullanılan sistemik uygulama yöntemi TVI’dir. TVI ve retrobulbar sinüs enjeksiyonu, küçük moleküller ve antikorlar durumunda benzer bir biyolojik dağılıma neden olur ve ekstrapolasyon yoluyla, viral vektörler için de aynısı beklenir15,16. Bununla birlikte, literatürde gen tedavisi vektörlerinin TVI ve retrobulbar sinüs enjeksiyonu ile sistemik iletimini karşılaştıran hiçbir örnek bulunamamıştır. Kanımızca, retrobulbar sinüs enjeksiyonlarının büyüme fenotipi azalmış ve/veya erken ölümcüllüğü olan farelerde uygulanması daha kolaydır.
TVI’nin genellikle insanlarda sistemik doğuma daha benzer olduğu düşünülür, ancak insanlarda retrobulbar sinüse sahip olmasına rağmen kuyruğu yoktur. Bir açıdan, retrobulbar sinüs enjeksiyonu, enjekte edilen maddenin üst venöz sisteme, bir enjekte edicinin periferik olarak yerleştirilmiş bir merkezi kateter (PICC Hattı) veya kola yerleştirilen intravenöz bir kateter ile bir insana verilmiş gibi girdiği insan sistemik doğumuna benzer. Tersine, enjekte edici, kuyruk ven enjeksiyonundan sonra bir farenin alt venöz sistemine girer. Ne yazık ki, bu yöntemlerin hiçbiri insanlarda sistemik doğum için kullanılan yöntem(ler)i tam olarak kopyalamaz, ancak her ikisi de farelerde etkili sistemik doğum yöntemleridir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NHGRI fare tesisi personelinin, NCI Moleküler Patoloji Laboratuvarı’nın ve özellikle Andrew Warner’ın yardımını takdir ediyoruz. R.J.C., 1ZIAHG200318-16 aracılığıyla NHGRI’nin Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmektedir ve bu çalışma kısmen Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi (NCATS) tarafından finanse edilmiştir. Şekil 2C , BioRender ile oluşturulmuştur.
Materials
| AAV8-CAG-eGFP | Univ. Penn. Vector Core | Special order | alternative sources of AAV reporters and alternative AAV reporters are available |
| Barrier (Filter) Tips, 20 μL size | ThermoFisher | AM12645 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Barrier (Filter) Tips, 100 μL size (sterile) | ThermoFisher | AM12648 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Dual Prodedure Circuit | VetEquip | 921400 | alternative anesthesia method can be used |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 pipette | Gilson | F123600 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P100 pipette | Gilson | F123615 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Hand warmers (HOTHANDS) | ULINE | S-1497B | to keep mouse warm while anesthesized |
| Insulin syringes, 31 G, 8 mm length, 3/10 mL capacity | Becton Dickson | 328438 | used in video; one syringe per injection |
| Isoflurane (Fluriso) | VETONE | 502017 | alternative anesthesia can be used |
| Medline Protection Plus Disposable Underpads | ThermoFisher | 23-666-062 | to place mouse on durring injection |
| Oak Ridge Phlebotomy Sharps Container With Transparent Lid | ThermoFisher | 22-730-434 | for needle disposal |
| Phosphate buffered saline PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | To dilute AAV to desired concencentration and volume |
| Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes (sterile) | ThermoFisher | 3451 | for diluting AAV to disire injection volume and conentration |
| Sterile gauze sponge 4"x"4 | Covidien | 3033 | |
| Table-Top laboratory animal anesthesia system (LAAS) | VetEquip | 901806 | alternative anesthesia method can be used |
| Trecaine Hydrochloride Ophthalmic (0.5%) | Ocenanside Pharmaceuticals | AK102D5DS | local anesthetic |
| Tuberculin syringe with a 27.0 G (or smaller) | Any | N/A | alternative to insulin syringe used in video |
| VetEquip’s User Guide and Operating Manual for table top and mobile Laboratory Animal Anesthesia System. | VetEquip | chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf | link to users guide and manual |
References
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evol Med Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Samelson-Jones, B. J., George, L. A. Adeno-associated virus gene therapy for hemophilia. Annu Rev Med. 74, 231-247 (2023).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retrobulbar injections in mice. Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Chandler, R. J., et al. Systemic gene therapy for methylmalonic acidemia using the novel adeno-associated viral vector 44.9. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 61-72 (2022).
- Chandler, R. J., et al. Systemic aav9 gene therapy improves the lifespan of mice with niemann-pick disease, type c1. Hum Mol Genet. 26 (1), 52-64 (2017).
- Venturoni, L. E., et al. Growth advantage of corrected hepatocytes in a juvenile model of methylmalonic acidemia following liver directed adeno-associated viral mediated nuclease-free genome editing. Mol Genet Metab. 137 (1-2), 1-8 (2022).
- Ilyinskii, P. O., et al. Immtor nanoparticles enhance aav transgene expression after initial and repeat dosing in a mouse model of methylmalonic acidemia. Mol Ther Methods Clin Dev. 22, 279-292 (2021).
- Davidson, C. D., et al. Improved systemic aav gene therapy with a neurotrophic capsid in niemann-pick disease type c1 mice. Life Sci Alliance. 4 (10), e202101040 (2021).
- Chandler, R. J., et al. Systemic gene therapy using an aav44.9 vector rescues a neonatal lethal mouse model of propionic acidemia. Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 181-190 (2023).
- Rocha-Ferreira, E., et al. A neonatal rodent model of retroorbital vein injection. J Vis Exp. (204), e65386 (2024).
- Bohnert, B. N., Artunc, F. Induction of nephrotic syndrome in mice by retrobulbar injection of doxorubicin and prevention of volume retention by sustained release aprotinin. J Vis Exp. (135), e57642 (2018).
- Bohnert, B. N., et al. Retrobulbar sinus injection of doxorubicin is more efficient than lateral tail vein injection at inducing experimental nephrotic syndrome in mice: A pilot study. Lab Anim. 53 (6), 564-576 (2019).
- Meijer, M. K., Spruijt, B. M., Van Zutphen, L. F., Baumans, V. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 40 (4), 382-391 (2006).
- Nohara, M., Tohei, A., Sato, T., Amao, H. Evaluation of response to restraint stress by salivary corticosterone levels in adult male mice. J Vet Med Sci. 78 (5), 775-780 (2016).
- Schoch, A., Thorey, I. S., Engert, J., Winter, G., Emrich, T. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus routes of antibody administration in pharmacokinetic studies. Lab Anim (NY). 43 (3), 95-99 (2014).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of aav serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
.