العلاج الجهازي للفئران البالغة بعد الولادة والأحداث والجريان عن طريق حقن الجيوب الأنفية خلف القضيب
Summary
توفر هذه المقالة بروتوكولا ومقطع فيديو مصاحبا لحقن الجيوب الأنفية خلف القضيب يصل إلى حجم إجمالي يبلغ 150 ميكرولتر للفئران البالغة بعد الولادة والأحداث والجري. هذا الإجراء مناسب بشكل خاص لحقن الفئران الصغيرة (15 جم) عندما يكون حقن الوريد الذيل غير ممكن.
Abstract
في حين أن حقن الوريد الذيل تستخدم بشكل متكرر كطريق نظامي للتسليم في الفئران البالغة ، فإن الحقن خلف القضيب هي طريقة بديلة للتسليم الجهازي مع قيود أقل. أولا ، تقتصر حقن الوريد الذيل (TVIs) على الفئران البالغة حيث يكون حجم الوريد الذيل مناسبا للوصول. يمكن أن يكون الاقتصار على علاج الفئران البالغة مشكلة عند التعامل مع نماذج الفئران التي لا تنجو حتى مرحلة البلوغ. ثانيا ، TVIs غير مجدية لنماذج الفئران ذات الأنماط الظاهرية لتأخر النمو حيث لا تحقق الفئران أبدا حجم الفئران البرية البالغة. لذلك ، يمكن استخدام الحقن خلف القضيب بنجاح لعلاج كل من الفئران الصغيرة والصغيرة. أخيرا ، يتم إجراء الحقن خلف القضيب تحت التخدير ، وهو أقل إرهاقا على الفئران من TVIs التي يتم إجراؤها عادة بدون تخدير. تقدم هذه المقالة بروتوكولا وتعليمات مفصلة للحقن خلف القضيب التي يمكن استخدامها للتسليم الجهازي للفئران الصغيرة والصغيرة.
Introduction
تستخدم نماذج الفئران للأمراض الوراثية بشكل شائع لإثبات فعالية العلاجات الجزيئية والجينية والخلويةالصغيرة 1. في الفئران ، الطريقة الأكثر استخداما لتكرار التسليم الجهازي للبشر هي حقن الوريد الذيل (TVI) ، والذي يتم إجراؤه عادة في الفئران البالغة في حوالي 6-8 أسابيع من العمر للتأكد من أن الوريد كبير بما يكفي للوصول إليه. تم استخدام TVI بنجاح في العديد من دراسات إثبات المبدأ قبل السريرية للأمراض الوراثية ، مثل الهيموفيليا ، والتي دعمت التجارب السريرية البشرية للعلاج الجيني2. ومع ذلك ، فإن العديد من نماذج الفئران للأمراض الوراثية لها أنماط ظاهرية للنمو و / أو الفتك المبكر ، مما يمنعها من الوصول إلى عمر أو حجم الفأر البالغ (الشكل 1). قد يكون علاج مثل هذه الفئران عبر TVI أمرا صعبا للغاية ، إن لم يكن مستحيلا ، اعتمادا على عمر الفتك و / أو الحد الأقصى للحجم الذي يمكن أن تحققه.
في المقابل ، يمكن إجراء التوصيل الجهازي للعامل العلاجي عن طريق حقن الجيوب الأنفية خلف القضيب (يشار إليه بشكل متكرر وغير صحيح باسم الحجاج الخلفي) بسهولة تامة في الفئران بغض النظر عن العمر أو الحجم3. تم استخدام الحقن خلف القضيب للفيروس المرتبط بالغدي (AAV) بنجاح في نماذج الفئران الشابة المتأخرة النمو للأمراض الوراثية ، مثل حمض الدم الميثيل مالونيك (MMA) ومرض نيمان بيك من النوعC 4،5،6،7،8. (يمكن أيضا استخدام هذا الإجراء لحقن حديثي الولادة3،4،9،10 ؛ ومع ذلك ، لم يتم تفصيل هذه التقنية في هذا البروتوكول أو الفيديو المصاحب.) حتى المواد شديدة السمية مثل دوكسوروبيسين يمكن توصيلها بأمان عن طريق الحقن خلف القضيب11,12. على عكس TVI ، يتم تخدير الفئران أثناء حقن الجيوب الأنفية خلف القضيب ، مما يجعل الإجراء أقل إرهاقا على الماوس وأسهل على المشغل الذي لا يضطر إلى تقييد الماوسجسديا 13,14. مصدر قلق إضافي هو أن TVI يستخدم بشكل متكرر مصباحا حراريا لتوسيع الوريد الخلفي ، مما قد يسبب الجفاف في الفئران الصغيرة ويمكن أن يكون مشكلة في نماذج الفئران من الأمراض الوراثية التي يشتبه في أنها أكثر عرضة للإجهاد المرتبط بالحرارة. هناك مشكلة أخرى يمكن أن تنشأ عند استخدام TVI وهي أن الوريد الذيل يمكن أن يكون صعبا بشكل خاص لتصوره على الفئران شديدة التصبغ. ومع ذلك ، مثل TVI ، تؤدي حقن الجيوب الأنفية خلف القضيب إلى توزيع حيوي جهازي واسعالنطاق 15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين أن الحقن خلف القضيب هو طريقة موثوقة لتقديم جزيئات صغيرة وبروتينات وعلاجات جينومية ، فإن ممارسة التقنية باستخدام صبغة أمر ضروري لضمان تحقيق توصيل نظامي موثوق وقابل للتكرار. يوصى بشدة باستخدام صبغة لممارسة الحقن خلف القضيب في الفئران قبل استخدام طريق التسليم هذا في التجارب. يمكن فحص الأصباغ بصريا في أنسجة الفئران لضمان التسليم الجهازي المتسق.
في عرضنا لتقنية الحقن خلف القضيب ، تم استخدام غاز الأيزوفلوران لتخدير الفئران قبل الإجراء. يمكن استخدام أشكال أخرى من التخدير قبل الإجراء ، ولكن من المهم التأكد من أن الماوس لا يتعافى من التخدير قبل اكتمال الحقن. لحسن الحظ ، عادة ما يستغرق الحقن الفعلي أقل من دقيقة والوقت الذي يحتاج فيه الفأر إلى التخدير الكامل قصير. يجب تخدير الفأر تماما أثناء الحقن ، ويجب إعادة التخدير إذا أصبح الفأر واعيا قبل الحقن. نظرا لوجود مخاطر مرتبطة باستخدام التخدير ، يجب تقليل المدة الزمنية التي يتم فيها تخدير الماوس. لم نواجه مشاكل في استخدام الأيزوفلوران لتخدير الفئران المريضة الصغيرة باستخدام حمض الميثيل مالونيك والبروبيونيك. ومع ذلك ، قد تكون بعض نماذج الفئران أكثر حساسية للتخدير وبعض التخدير. يجب مراعاة هذه المشكلة المحتملة قبل محاولة استخدام التخدير في الدراسة. أخيرا ، يقلل استخدام التخدير مع الحقن الخلفي بشكل كبير من الضائقة الواضحة التي يظهرها الفأر أثناء عملية الحقن مقارنة ب TVI حيث لا يتم استخدام التخدير بشكل شائع.
لم نلاحظ أي مشاكل متعلقة بمرحلة ما بعد الحقن ، على الرغم من أن العدوى تشكل خطرا محتملا مع أي حقنة. لتقليل فرصة الإصابة ، يتم استخدام حقنة معقمة يمكن التخلص منها للاستخدام مرة واحدة و PBS معقمة لتخفيف AAV المنقى. يتم فحص جميع الفئران في منشأتنا الحيوانية يوميا بحثا عن علامات على وجود مشكلات صحية محتملة وتلقي الرعاية البيطرية لمعالجة أي مشاكل صحية عند الاقتضاء.
البديل لحقن الجيوب الأنفية خلف القضيب والطريقة الأكثر استخداما للتسليم الجهازي للفئران اليافعة والبالغة هو TVI. يؤدي TVI وحقن الجيوب الأنفية خلف القضيب إلى توزيع حيوي مماثل في حالة الجزيئات الصغيرة والأجسام المضادة ، ومن خلال الاستقراء ، من المتوقع حدوث نفس الشيء بالنسبة للناقلات الفيروسية15,16. ومع ذلك ، لا يمكن العثور على أمثلة تقارن التسليم الجهازي لنواقل العلاج الجيني بواسطة TVI وحقن الجيوب الأنفية خلف القضيب في الأدبيات. في رأينا ، من الأسهل إجراء حقن الجيوب الأنفية خلف القضيب في الفئران ذات النمط الظاهري المنخفض للنمو و / أو الفتك المبكر.
غالبا ما يعتبر TVI أكثر تشابها مع التسليم الجهازي في البشر ، على الرغم من أن البشر لديهم جيب خلف القضيب ولكن ليس لديهم ذيل. في أحد الجوانب ، يشبه حقن الجيوب الأنفية خلف القضيب التسليم الجهازي البشري من حيث أن الحاقن يدخل الجهاز الوريدي العلوي كما لو تم توصيل حاقن إلى الإنسان عن طريق قسطرة مركزية يتم إدخالها محيطيا (PICC Line) أو قسطرة وريدية موضوعة في الذراع. على العكس من ذلك ، يدخل الحقن في الجهاز الوريدي السفلي للفأر بعد حقن الوريد الذيل. لسوء الحظ ، لا تكرر أي من هذه الطرق بالضبط الطريقة (الطرق) المستخدمة للتسليم الجهازي في البشر ، ولكن كلاهما طرق فعالة للتسليم الجهازي في الفئران.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر مساعدة موظفي مرفق الماوس NHGRI ، ومختبر علم الأمراض الجزيئي NCI ، وخاصة أندرو وارنر. يتم دعم RJC من قبل برنامج البحوث الداخلية التابع ل NHGRI من خلال 1ZIAHG200318-16 وتم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل المركز الوطني لتطوير العلوم الانتقالية (NCATS). تم إنشاء الشكل 2C باستخدام BioRender.
Materials
| AAV8-CAG-eGFP | Univ. Penn. Vector Core | Special order | alternative sources of AAV reporters and alternative AAV reporters are available |
| Barrier (Filter) Tips, 20 μL size | ThermoFisher | AM12645 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Barrier (Filter) Tips, 100 μL size (sterile) | ThermoFisher | AM12648 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Dual Prodedure Circuit | VetEquip | 921400 | alternative anesthesia method can be used |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 pipette | Gilson | F123600 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P100 pipette | Gilson | F123615 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Hand warmers (HOTHANDS) | ULINE | S-1497B | to keep mouse warm while anesthesized |
| Insulin syringes, 31 G, 8 mm length, 3/10 mL capacity | Becton Dickson | 328438 | used in video; one syringe per injection |
| Isoflurane (Fluriso) | VETONE | 502017 | alternative anesthesia can be used |
| Medline Protection Plus Disposable Underpads | ThermoFisher | 23-666-062 | to place mouse on durring injection |
| Oak Ridge Phlebotomy Sharps Container With Transparent Lid | ThermoFisher | 22-730-434 | for needle disposal |
| Phosphate buffered saline PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | To dilute AAV to desired concencentration and volume |
| Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes (sterile) | ThermoFisher | 3451 | for diluting AAV to disire injection volume and conentration |
| Sterile gauze sponge 4"x"4 | Covidien | 3033 | |
| Table-Top laboratory animal anesthesia system (LAAS) | VetEquip | 901806 | alternative anesthesia method can be used |
| Trecaine Hydrochloride Ophthalmic (0.5%) | Ocenanside Pharmaceuticals | AK102D5DS | local anesthetic |
| Tuberculin syringe with a 27.0 G (or smaller) | Any | N/A | alternative to insulin syringe used in video |
| VetEquip’s User Guide and Operating Manual for table top and mobile Laboratory Animal Anesthesia System. | VetEquip | chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf | link to users guide and manual |
References
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evol Med Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Samelson-Jones, B. J., George, L. A. Adeno-associated virus gene therapy for hemophilia. Annu Rev Med. 74, 231-247 (2023).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retrobulbar injections in mice. Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Chandler, R. J., et al. Systemic gene therapy for methylmalonic acidemia using the novel adeno-associated viral vector 44.9. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 61-72 (2022).
- Chandler, R. J., et al. Systemic aav9 gene therapy improves the lifespan of mice with niemann-pick disease, type c1. Hum Mol Genet. 26 (1), 52-64 (2017).
- Venturoni, L. E., et al. Growth advantage of corrected hepatocytes in a juvenile model of methylmalonic acidemia following liver directed adeno-associated viral mediated nuclease-free genome editing. Mol Genet Metab. 137 (1-2), 1-8 (2022).
- Ilyinskii, P. O., et al. Immtor nanoparticles enhance aav transgene expression after initial and repeat dosing in a mouse model of methylmalonic acidemia. Mol Ther Methods Clin Dev. 22, 279-292 (2021).
- Davidson, C. D., et al. Improved systemic aav gene therapy with a neurotrophic capsid in niemann-pick disease type c1 mice. Life Sci Alliance. 4 (10), e202101040 (2021).
- Chandler, R. J., et al. Systemic gene therapy using an aav44.9 vector rescues a neonatal lethal mouse model of propionic acidemia. Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 181-190 (2023).
- Rocha-Ferreira, E., et al. A neonatal rodent model of retroorbital vein injection. J Vis Exp. (204), e65386 (2024).
- Bohnert, B. N., Artunc, F. Induction of nephrotic syndrome in mice by retrobulbar injection of doxorubicin and prevention of volume retention by sustained release aprotinin. J Vis Exp. (135), e57642 (2018).
- Bohnert, B. N., et al. Retrobulbar sinus injection of doxorubicin is more efficient than lateral tail vein injection at inducing experimental nephrotic syndrome in mice: A pilot study. Lab Anim. 53 (6), 564-576 (2019).
- Meijer, M. K., Spruijt, B. M., Van Zutphen, L. F., Baumans, V. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 40 (4), 382-391 (2006).
- Nohara, M., Tohei, A., Sato, T., Amao, H. Evaluation of response to restraint stress by salivary corticosterone levels in adult male mice. J Vet Med Sci. 78 (5), 775-780 (2016).
- Schoch, A., Thorey, I. S., Engert, J., Winter, G., Emrich, T. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus routes of antibody administration in pharmacokinetic studies. Lab Anim (NY). 43 (3), 95-99 (2014).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of aav serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
.