球后窦注射对出生后、幼年和发育成年小鼠的全身治疗

该方案和随附的视频适用于通过球后窦注射对出生后、幼年和发育成年小鼠的球后注射间隙;该方案已获得美国国家人类基因组研究所机构动物护理和使用委员会 （ACUC） 的批准，方案编号为 G-03-4。其他机构可能有不同的要求和限制，可能需要修改此方案才能在您的机构获得批准。在执行此程序或任何其他动物程序之前，请获得您所在机构的 ACUC 的批准。 1. 注射前准备 每次注射时，在无菌 1.5 mL 微量离心管中用无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 将 AAV 稀释至所需的注射体积和浓度。每次注射额外增加 50% 的体积，以便准确填充一次性无菌注射器。注意：在这里，我们稀释了 AAV8-CAG-eGFP 报告基因，以在 50 μL 的体积中输送每公斤体重 （vg/kg） 1 ×10 13个病毒基因组的剂量。使用注射时动物的体重计算要注射的 50 μL 中的 AAV 量。在本视频中，通过球后途径注射 AAV，以复制人体全身递送。其他基因治疗载体（即慢病毒、腺病毒）、RNA 疗法和小分子药物可以使用该程序进行全身递送。 确保台式实验动物麻醉系统 （LAAS） 按照制造商的说明正确设置并正常运行。注意：如果使用替代麻醉方法，请确保在开始注射之前准备好麻醉剂。球后注射手术应与大多数麻醉剂兼容（例如，氯胺酮和甲苯噻嗪等可注射化学约束装置）。 在填充一次性无菌注射器（此处为胰岛素注射器，31 G，长 8 mm，容量为 3/10 mL）之前，上下移动柱塞数次，以确保柱塞可以顺利按下。然后，将注射器填充至所需体积，确保没有气泡。注：可进样体积高达 150 μL;我们的实验室通常注射 50 μL 的体积。 2. 通过使用实验动物麻醉系统 （LAAS） 施用异氟醚气体来镇静小鼠 确保气体仅流向感应室。将双向旋塞阀关闭到非再呼吸 （NRB） 回路。 打开流量计前面的绿色氧气流量旋钮，使流速为 1 L/min。 按下蒸发器顶部的控制杆并将刻度盘旋转至所需浓度，将异氟醚调至 ≤4%。 将鼠标放入透明的感应室中。仔细观察动物的呼吸和动作。一旦动物卧着，将蒸发器旋钮调低至异氟醚的 2-2.5%。 打开连接到面罩上的 NRB 电路的双向旋塞阀，并关闭流向感应盒的气流。 取下动物并将其放入 NRB 回路的面罩中。 将异氟醚浓度设置调低至 1.5%-1.75%，由对刺激（例如，脚趾捏或爪子挤压）的反应决定。 始终持续监测小鼠的呼吸和粘膜颜色（如果可能）。如果动物的呼吸变得困难或粘膜颜色不是粉红色，请调低麻醉剂浓度。 在整个过程中保持动物温暖。使用包裹在纸巾中的暖手器，该暖手器放在底垫下方并位于鼠标正下方。 完成程序后关闭氧气和蒸发器。 3. 动物注射 如果是右撇子，则注射鼠标的右眼，并将鼠标放在左侧，鼻子指向右手。如果是左撇子，则注射鼠标的左眼，并将鼠标放在右侧，鼻子指向左手。 将一两滴眼药剂滴在要注射的眼球上。然后，使用无菌吸收纱布垫去除任何多余的眼科麻醉液。用指尖轻轻按压眼睛背侧和腹侧的皮肤，使鼠标的眼球部分从眼窝中伸出（图 2A、B）。注意：突出眼睛时，小心不要对周围的宫颈血管施加过大的压力，因为这会阻碍血液流动和注射。此外，对气管施加压力可能会阻止老鼠呼吸。确保鼠标在整个过程中可以呼吸。 将针头保持在约 30° 的斜向下位置，并放入内眦中（图 2C）。注意：到达球后窦的针头放置深度将根据动物的大小而变化。在注射过程中将针头置于斜向下的位置可降低眼部损伤的风险。小心不要将针头放置得太深，以免刺穿眼窝。注射时间应少于一分钟。 缓慢而平稳地对注射器柱塞施加压力以输送注射液。这将减少外渗的机会。 缓慢而平稳地拔出针头。 从鼠标上取下面罩，以便从麻醉中恢复。 4. 注射后 完成程序后关闭氧气和蒸发器。 如果发生残余出血，请使用无菌纱布去除血液。 确保鼠标处于温暖的区域（约 37 °C），但不要过热，以防止在麻醉恢复期间体温过低。 隔离观察鼠标，直到完全恢复，然后再将鼠标放回笼子和机架。注意：在恢复过程中隔离鼠标可以防止笼子伙伴在恢复过程中伤害镇静的小鼠。