Tratamiento sistémico para ratones adultos posnatales, juveniles y revolucionados mediante inyección en el seno retrobulbar
Summary
Este artículo proporciona un protocolo y un video adjunto para la inyección en el seno retrobulbar de hasta un volumen total de 150 μL para ratones postnatales, juveniles y adultos corridos. Este procedimiento es particularmente adecuado para la inyección de ratones pequeños (15 g) cuando la inyección en la vena de la cola no es factible.
Abstract
Si bien las inyecciones en las venas de cola se utilizan con frecuencia como una vía sistémica de administración en ratones adultos, las inyecciones retrobulbares son un método alternativo para la administración sistémica con menos limitaciones. En primer lugar, las inyecciones en las venas de la cola (TVI) se limitan a ratones adultos en los que el tamaño de la vena de la cola es adecuado para el acceso. Limitarse al tratamiento de ratones adultos puede ser problemático cuando se trata de modelos de ratón que no sobreviven hasta la edad adulta. En segundo lugar, los TVI no son factibles para modelos de ratón con fenotipos de retraso del crecimiento en los que los ratones nunca alcanzan el tamaño de los ratones adultos de tipo salvaje. Por lo tanto, las inyecciones retrobulbares se pueden usar con éxito para tratar ratones jóvenes y adultos pequeños. Por último, las inyecciones retrobulbares se realizan bajo anestesia, que es menos estresante para los ratones que las TVI que se realizan comúnmente sin anestesia. Este artículo presenta un protocolo e instrucciones detalladas para las inyecciones retrobulbares que se pueden utilizar para la administración sistémica a ratones pequeños y jóvenes.
Introduction
Los modelos murinos de enfermedades genéticas se utilizan comúnmente para demostrar la eficacia de las terapias de moléculas pequeñas, genéticas y celulares1. En ratones, el método más utilizado para replicar la administración sistémica a los humanos es la inyección de la vena de la cola (TVI), que generalmente se realiza en ratones adultos aproximadamente a las 6-8 semanas de edad para garantizar que la vena sea lo suficientemente grande como para acceder a ella. La TVI se ha utilizado con éxito en numerosos estudios preclínicos de prueba de principio de enfermedades genéticas, como la hemofilia, que han respaldado ensayos clínicos en humanos para la terapia génica2. Sin embargo, muchos modelos murinos de enfermedad genética tienen fenotipos de crecimiento y/o letalidad temprana, que les impiden alcanzar la edad o el tamaño de un ratón adulto (Figura 1). El tratamiento de estos ratones a través de TVI puede ser extremadamente difícil, si no imposible, dependiendo de la edad de letalidad y/o del tamaño máximo que puedan alcanzar los animales.
Por el contrario, la administración sistémica de un agente terapéutico mediante inyección sinusal retrobulbar (frecuente e incorrectamente denominada retroorbital) se puede realizar con bastante facilidad en ratones, independientemente de su edado tamaño. Las inyecciones retrobulbares de virus adenoasociados (AAV) se han utilizado con éxito en modelos murinos jóvenes con retraso del crecimiento de enfermedades genéticas, como la acidemia metilmalónica (MMA) y la enfermedad de Niemann-Pick tipo C 4,5,6,7,8. (Este procedimiento también se puede utilizar para inyectar neonatos 3,4,9,10; sin embargo, esta técnica no se detalla en este protocolo ni en el video que lo acompaña). Incluso sustancias altamente tóxicas como la doxorrubicina pueden administrarse de forma segura mediante inyección retrobulbar11,12. A diferencia de la TVI, los ratones son anestesiados durante las inyecciones en los senos retrobulbares, lo que hace que el procedimiento sea menos estresante para el ratón y más fácil para el operador, que no tiene que sujetar físicamente al ratón13,14. Una preocupación adicional es que TVI usa con frecuencia una lámpara de calor para dilatar la vena de la cola, lo que podría causar deshidratación en ratones jóvenes y podría ser problemático en modelos murinos de enfermedades genéticas que son más sospechosas de estrés relacionado con el calor. Otro problema que puede surgir al usar TVI es que la vena de la cola puede ser particularmente difícil de visualizar en ratones altamente pigmentados. Sin embargo, al igual que la TVI, las inyecciones en los senos retrobulbares dan lugar a una amplia biodistribución sistémica15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Si bien la inyección retrobulbar es un método confiable para administrar moléculas pequeñas, proteínas y terapias genómicas, es necesario practicar la técnica con un tinte para garantizar que se logre una administración sistémica confiable y replicable. Se recomienda encarecidamente el uso de un colorante para practicar inyecciones retrobulbares en ratones antes de utilizar esta vía de administración en experimentos. Los colorantes se pueden comprobar visualmente en los tejidos del ratón para garantizar una administración sistémica constante.
En nuestra demostración de la técnica de inyección retrobulbar, se utilizó gas isoflurano para anestesiar a los ratones antes del procedimiento. Se pueden usar otras formas de anestesia antes del procedimiento, pero es importante asegurarse de que el ratón no se recupere de la sedación antes de que se complete la inyección. Afortunadamente, la inyección real suele tardar menos de un minuto y el tiempo durante el cual el ratón debe estar completamente anestesiado es breve. El ratón debe estar completamente sedado durante la inyección, y se debe volver a administrar la anestesia si el ratón está consciente antes de la inyección. Dado que existen riesgos asociados con el uso de anestesia, se debe minimizar la duración del tiempo que el ratón está sedado. No hemos tenido problemas con el uso de isoflurano para sedar pequeños ratones enfermos con acidemia metilmalónica y propiónica. Sin embargo, algunos modelos de ratón pueden ser más sensibles a la sedación y a cierta anestesia. Este problema potencial debe considerarse antes de intentar utilizar la sedación en un estudio. Por último, el uso de la sedación en combinación con la inyección retrobulbar reduce en gran medida el sufrimiento aparente que presenta el ratón durante el proceso de inyección en comparación con la TVI, donde la sedación no se usa comúnmente.
No hemos observado ningún problema relacionado con la inyección, aunque la infección es un riesgo potencial con cualquier inyección. Para reducir la posibilidad de infección, se utiliza una jeringa desechable estéril de un solo uso y PBS estéril para diluir el AAV purificado. Todos los ratones en nuestras instalaciones para animales son revisados diariamente para detectar signos de posibles problemas de salud y reciben atención veterinaria para abordar cualquier problema de salud cuando se justifica.
La alternativa a la inyección en el seno retrobulbar y el método más utilizado de administración sistémica en ratones jóvenes y adultos es la TVI. La TVI y la inyección en el seno retrobulbar dan lugar a una biodistribución similar en el caso de moléculas pequeñas y anticuerpos, y por extrapolación, se esperaría lo mismo para los vectores virales15,16. Sin embargo, no se han encontrado en la literatura ejemplos que comparen la administración sistémica de vectores de terapia génica por TVI y la inyección en senos retrobulbares. En nuestra opinión, las inyecciones en los senos retrobulbares son más fáciles de realizar en ratones con un fenotipo de crecimiento disminuido y/o letalidad precoz.
A menudo se considera que la TVI es más análoga al parto sistémico en los seres humanos, a pesar de que los humanos tienen un seno retrobulbar pero no tienen cola. En un aspecto, la inyección en el seno retrobulbar es similar a la administración sistémica humana en el sentido de que el inyectante ingresa al sistema venoso superior de la misma manera que si un inyectante se administrara a un ser humano mediante un catéter central insertado periféricamente (línea PICC) o un catéter intravenoso colocado en el brazo. Por el contrario, el inyector ingresa al sistema venoso inferior de un ratón después de la inyección en la vena de la cola. Desafortunadamente, ninguno de estos métodos replica exactamente los métodos utilizados para la administración sistémica en humanos, pero ambos son métodos efectivos de administración sistémica en ratones.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos la ayuda del personal del Centro de Ratones del NHGRI, del Laboratorio de Patología Molecular del NCI y, especialmente, de Andrew Warner. R.J.C. cuenta con el apoyo del Programa de Investigación Intramuros del NHGRI hasta 1ZIAHG200318-16 y este trabajo fue parcialmente financiado por el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (NCATS). La Figura 2C se creó con BioRender.
Materials
| AAV8-CAG-eGFP | Univ. Penn. Vector Core | Special order | alternative sources of AAV reporters and alternative AAV reporters are available |
| Barrier (Filter) Tips, 20 μL size | ThermoFisher | AM12645 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Barrier (Filter) Tips, 100 μL size (sterile) | ThermoFisher | AM12648 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Dual Prodedure Circuit | VetEquip | 921400 | alternative anesthesia method can be used |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 pipette | Gilson | F123600 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P100 pipette | Gilson | F123615 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Hand warmers (HOTHANDS) | ULINE | S-1497B | to keep mouse warm while anesthesized |
| Insulin syringes, 31 G, 8 mm length, 3/10 mL capacity | Becton Dickson | 328438 | used in video; one syringe per injection |
| Isoflurane (Fluriso) | VETONE | 502017 | alternative anesthesia can be used |
| Medline Protection Plus Disposable Underpads | ThermoFisher | 23-666-062 | to place mouse on durring injection |
| Oak Ridge Phlebotomy Sharps Container With Transparent Lid | ThermoFisher | 22-730-434 | for needle disposal |
| Phosphate buffered saline PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | To dilute AAV to desired concencentration and volume |
| Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes (sterile) | ThermoFisher | 3451 | for diluting AAV to disire injection volume and conentration |
| Sterile gauze sponge 4"x"4 | Covidien | 3033 | |
| Table-Top laboratory animal anesthesia system (LAAS) | VetEquip | 901806 | alternative anesthesia method can be used |
| Trecaine Hydrochloride Ophthalmic (0.5%) | Ocenanside Pharmaceuticals | AK102D5DS | local anesthetic |
| Tuberculin syringe with a 27.0 G (or smaller) | Any | N/A | alternative to insulin syringe used in video |
| VetEquip’s User Guide and Operating Manual for table top and mobile Laboratory Animal Anesthesia System. | VetEquip | chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf | link to users guide and manual |
References
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