マウスのドリコ拡張症を誘発するための視覚的アプローチによる大血管媒介性脳血管機能障害のモデル化
Summary
脳血管機能障害のモデルとして、マウスに大血管拡張を化学的に誘導することを実証し、血管性認知症やアルツハイマー病のモデリングに用いることができます。また、シリコーンゴムコンパウンドを注入して血管系を可視化し、血管サイズの変化を測定するための明確な視覚的ガイダンスを提供する方法も示しています。
Abstract
血液脳(BBB)は、例えば、末梢部で選択的な脳循環を調節する重要なシステムであり、必要な栄養素が脳に過剰なアミノ酸や毒素を流入し、脳から排出することを可能にします。 血管性認知症(VaD)やアルツハイマー病(AD)などの疾患でBBBがどのように損なわれるかをモデル化するために、研究者たちは血管拡張をモデル化する新しい方法を開発しました。これらの疾患状態でBBBが損なわれると、有害であり、BBBの調節不全を引き起こし、脳機能に影響を与える不都合で病理学的な結果につながる可能性があります。私たちは、大槽(CM)に直接注入してエラスターゼを使用して血管の拡張を誘導し、BBBのタイトジャンクション(TJ)を破壊することを可能にする既存の技術を変更することができました。この方法により、一貫した血管拡張、死亡率の低下または回復の改善、シリコーンゴムコンパウンドである充填/混濁剤の改善、拡張分析のための血管標識送達の改善など、以前の技術に対する成功のさまざまな指標を確認することができました。この改良された低侵襲法は有望な結果をもたらしており、注射後2週間から3か月にかけてマウスの大血管の持続的な拡張が19%〜32%増加しました。この改善は、2週間の時点でのみ拡張の増加を示した以前の研究とは対照的です。追加のデータは、9.5か月後も持続的に拡大することを示唆しています。この増加は、エラスターゼとビヒクル注入群の血管の直径を比較することによって確認されました。全体として、この手法は、動物モデルを使用して中枢神経系(CNS)に影響を与える病理学的障害を研究するために価値があります。
Introduction
脳毛細血管の内側を覆う微小血管内皮細胞は、血液脳関門(BBB)1を形成する主要な構成要素であり、末梢の脳循環に出入りするものを調節する重要な役割を果たしています。神経組織に必要な必須栄養素はBBBに入ることが許可されていますが、グルタミン酸などの一部の必須アミノ酸は脳から排出されます。これは、高濃度が脳組織に永続的な神経興奮性損傷を引き起こす可能性があるためです2。通常の生理学的条件下では、BBBはアルブミン3,4やプロトロンビンなどの血漿タンパク質が脳に入るのを制限します5,6,7。最後に、BBBは、食品や環境からの生体異物など、末梢を循環している神経毒から脳を保護します1。全体として、脳組織への損傷は不可逆的であり、低レベルの神経新生と相関する老化8は、神経変性プロセスを加速するあらゆる要因を保護し、防止するBBBの重要性を強調しています。
ドリコエクタ症(または大血管拡張症)では、血管の弾力性の低下が観察され、その結果、血管が形態学的に変化し、その結果、血管が機能不全 に陥り9、脳内の血流が減少する。この血流の減少は、その後、酸素とグルコースの供給を減少させ、最終的には反応性アストロサイトの活性化を通じてBBBに損傷を与える10。ドリコエクスターゼ11により血管の内部エラスチン層が損傷を受けた場合、血管新生には血管内皮増殖因子(VEGF)の刺激を繰り返す必要がある。これは、漏れやすい血管の形成につながり、最終的には、欠陥のある血管の発達を特徴とする病理学的血管新生をもたらす可能性がある12。病的な血管新生では、血管が欠損すると、タイトジャンクションタンパク質をアップレギュレーションすることにより血管の完全性を回復する代償メカニズムが現れます。しかし、このプロセスは、血管の構造的完全性が失われたときに、不注意でBBBを混乱させる可能性がある13。これは、BBBをさらに破壊し、アミロイドプラーク14の産生を促進することによって起こり得る。さらに、末梢からの漏出は神経炎症15を引き起こし、その結果、ニューロンの変性とそれに続く記憶喪失を引き起こす可能性がある。
構造的には、BBBが提供する保護は、生体異物が血液が脳に入るのを防ぐタイトジャンクションを介して行われます。特定の物質が脳に入るのを許すとき、BBBは主に受動的拡散、または特定のチャネル(イオンチャネルやトランスポーターなど)1の2つの主要なプロセスを通じてそれを行います。ADでは、機能不全の血管系が状態の進行に重要な役割を果たしていることが研究で実証されています12,13。アミロイドβ(Aβ)プラークの形成と神経変性は、BBBの破壊12,13と脳血流の乱れ16から生じる可能性がある。脳血流の減少は、血管性認知症と診断された高齢者とAD17,18で見られます。機能不全の脳血流(CBF)とともに血液脳関門(BBB)の損傷は、末梢循環からの異物の浸潤を伴う脳内のAβ濃度の産生の増加に寄与する可能性があります19。
ADや血管性認知症(VaD)などの神経疾患の病因を調査するために、疾患を再現するモデルが開発されています。in vitroモデルは広く使用されていますが、混合細胞集団のような広範な疾患モデリングのための生物学的環境が不足しているため、in vivoモデルの重要性が必要です。マウスは、疾患においてヒトのような特性(例えば、病理学)を生成する際の遺伝子操作の容易さのために一般的に使用されます。これまでの進歩に伴い、大血管拡張などの疾患表現型やADにおけるその役割を模倣するための改良モデルが引き続き必要とされています。この目的のために、私たちは機会を見出し、マウスのCisterna magnaにエラスターゼを注入することを含む技術を変更しました20,21。エラスターゼは、結合組織22および周囲のタイトジャンクション23でエラスチンを分解することが示されている酵素である。大槽は、脳内で最大の血管であるウィリスの円の真上に位置しているため、注射点として選択されました。大槽にエラスターゼを注入することにより、タイトジャンクションを破壊し、血管の拡張を誘発することにより、BBBと血管を損なうことができます(ウィリスの円)24,25。この手法を病理学のADマウスモデルの使用と組み合わせることで、ADの血管成分の病因の理解を深めることで、これら2つの異なる病状間の複雑な相互作用と影響に関する貴重な洞察を得ることができます。
以前の研究では、患者がADとVaDの両方の病理学的特徴を示す例が実証されており、この状態は一般に混合型認知症と呼ばれます26,27。したがって、両方の状態間の相互に関連するメカニズムを理解することは、これらの神経変性疾患の進行と発現についてより包括的な視点を提供し、根本的なメカニズムと潜在的な治療戦略の理解を深めることができます。この目的のために、AD病理マウスモデル(AppNL-F)でのエラスターゼの適用を示し、血管の変化を特定します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、脳血管拡張のための改善されたプロトコルを示し、マウスの槽マグナへのエラスターゼ注射のための正確で簡単なアプローチを提供します。この解剖学的ポイントは、脳脊髄液への直接の入り口として機能し、さまざまな神経疾患の調査に貴重な手段を提供します。この修正された技術の主な利点の1つは、マウスの大槽にエラスターゼを単回投与で注入すると、反復可能な注…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、手術の支援に協力したステファニー・タムの貴重な貢献によって可能になりました。これもひとえに心より感謝申し上げます。この研究を支援してくれた国立衛生研究所(AG066162)。
Materials
| 23 G catheter | University Medstore | 2546-CABD305145 | Needed for perfusion (https://www.uoftmedstore.com/index.sz) |
| Absolute ethanol | University Medstore | https://www.uoftmedstore.com/index.sz | For removing the microfil |
| Betadine scrub | # | https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrub | Sterilization |
| Betadine solution | Amazon | https://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHW | Sterilization |
| Bupivacaine | Provided by animal facility | N/A | Analgesic |
| Clippers | BrainTree Scientific Inc | CLP-41590 | Shave fur |
| Cotton Q-tip | University Medstore | 1962 | For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz) |
| Elastase | Sigma-aldrich | E7885 | Used for the dilatation of blood vessel |
| Ethanol | University Medstore | 39752-P016-EAAN | Sterilization (https://www.uoftmedstore.com/index.sz) |
| Goat anti-mouse 568 | Invitrogen | A11004 | For staining mature neurons |
| Graphpad prism 10 | Graphpad prism 10 | https://www.graphpad.com/ | Statistical analysis software |
| Hamilton syringe | Sigma-aldrich | 28614-U | Injection elastase |
| Heat pad | Amazon | https://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZ | Maintain body temperature |
| ImageJ software | Fiji Imagej software | imagej.net (USA) | Image analysis software |
| Induction chamber | Provided by animal facility | N/A | Anesthesia induction |
| Metacam | Provided by animal facility | N/A | Analgesic |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | For removing the microfil |
| Microfil | Flow Tech, Carver, Massachusetts | https://www.flowtech-inc.com/order/ | Dye (yellow) |
| Mouse monoclonal anti-NeuN | Millipore Sigma | MAB377 | For staining mature neurons |
| Olympus VS200 slide scanner and VSI software. | Olympus Life Science | https://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[downloads][id]=847254104 | Imaging software |
| Paraformaldehyde | University Medstore | PAR070.1 | For protein fixation (https://www.uoftmedstore.com/index.sz) |
| Perfusion pump | VWR International | https://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumps | Needed for perfusion |
| Scalpel | University Medstore | 2580-M90-10 | For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz) |
| Stereotaxic | Provided by animal facility | N/A | So secure the animal for surgery |
| Surgical scissor | University Medstore | 22751-A9-240 | For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz) |
| Surgical tape | University Medstore | https://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2 | Secure the animal on the diaper |
| Sutures | University Medstore | 2297-VS881 | For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz) |
| X2 tweezers | University Medstore | 7731-A10-612 | For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz) |
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