إجراء مبسط وموحد لتوليد ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدينو عالية الجودة باستخدام منصة مصنع الخلايا
Summary
مع استمرار تطور مجال العلاج الجيني ، هناك حاجة متزايدة لطرق مبتكرة يمكنها مواجهة هذه التحديات. هنا ، يتم تقديم طريقة فريدة من نوعها ، والتي تبسط عملية توليد ناقلات AAV عالية الغلة وعالية النقاء باستخدام منصة مصنع الخلايا ، وتلبية معايير الجودة للدراسات في الجسم الحي .
Abstract
تتطلب أبحاث العلاج الجيني قبل السريرية ، لا سيما في القوارض والنماذج الحيوانية الكبيرة ، إنتاج ناقلات AAV ذات إنتاجية عالية ونقاوة. غالبا ما تتضمن الأساليب التقليدية في مختبرات الأبحاث استخداما مكثفا لأطباق زراعة الخلايا لزراعة الخلايا HEK293T ، وهي عملية يمكن أن تكون شاقة وإشكالية. هنا ، يتم تقديم طريقة داخلية فريدة ، والتي تبسط هذه العملية باستخدام منصة مصنع خلايا معينة (أو مداخن الخلايا ، CF10). يؤدي تكامل التقسيم ثنائي الطور من البولي إيثيلين جلايكول / المائي مع الطرد المركزي الفائق المتدرج لليوديكسانول إلى تحسين كل من إنتاجية ونقاء ناقلات AAV المتولدة. يتم التحقق من نقاء ناقلات AAV من خلال SDS-PAGE وتلطيخ الفضة ، في حين يتم تحديد نسبة الجسيمات الكاملة إلى الفارغة باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). يوفر هذا النهج منصة فعالة لمصنع الخلايا لإنتاج ناقلات AAV بإنتاجية عالية ، إلى جانب طريقة تنقية محسنة لتلبية متطلبات الجودة للدراسات في الجسم الحي .
Introduction
أصبحت ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAV) أداة لا غنى عنها في أبحاث العلاج الجيني ، حيث تقدم مزيجا فريدا من الفعالية والسلامة لتوصيل الجينات1. كانت الطرق التقليدية لتوليد AAVs في الإعدادات المختبرية محورية في تعزيز فهمنا وتطبيقنا للعلاج الجيني2. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب ، على الرغم من أنها أساسية ، تظهر بعض القيود والتحديات ، لا سيما من حيث العائد وكفاءة الوقت وجودة النواقل المنتجة ، ولا سيما نسبة الجسيمات الكاملة إلى الجسيماتالفارغة 3.
يتضمن الإجراء التقليدي لإنتاج AAV في المقام الأول نقل خلايا HEK2934. تتطلب هذه العملية ، التي تتم عادة في أطباق زراعة الخلايا ، نقل الخلايا ببلازميد يحتوي على الجين محل الاهتمام جنبا إلى جنب مع البلازميد المساعد وبلازميد القفيصة AAV 5,6. بعد النقل ، تنتج الخلايا جزيئات AAV ، والتي يتم حصادها وتنقيتهابعد ذلك 5,6. غالبا ما تتضمن عملية التنقية الطرد المركزي الفائق ، وهي خطوة حاسمة في الحصول على ناقلات AAV عالية النقاء7. يعد الطرد المركزي الفائق ، خاصة باستخدام كلوريد السيزيوم (CsCl) أو تدرج اليوديكسانول ، طريقة قياسية لفصل جزيئات AAV عن الحطام الخلوي والشوائب الأخرى8. هذه الخطوة ضرورية لتحقيق النقاء والتركيز المطلوبين لنواقل AAV ، مما يؤثر بشكل مباشر على فعاليتها في توصيل الجينات8. على الرغم من استخدامه على نطاق واسع ، فإن أجهزة الطرد المركزي الفائقة التقليدية لها عيوبها. على سبيل المثال ، يمكن أن تكون إنتاجية ناقلات AAV من هذه الطريقة متغيرة وغالبا ما تكون منخفضة ، مما يشكل تحديات كبيرة عندما تكون هناك حاجة إلى كميات كبيرة من ناقلات العيار العالي ، خاصة للدراسات في الجسم الحي أو النماذج الحيوانية الكبيرة9.
جانب آخر مهم لجودة ناقل AAV هو نسبة الجسيمات الكاملة إلى الجسيماتالفارغة 10. غالبا ما تحتوي مستحضرات AAV على مزيج من هذه الجسيمات ؛ ومع ذلك ، تحتوي الجسيمات الكاملة فقط على المادة الوراثية العلاجية. يمكن أن يؤدي وجود نسبة عالية من الجسيمات الفارغة إلى تقليل كفاءة توصيل الجينات بشكل كبير10. وبالتالي فإن تقييم وتحسين نسبة الجسيمات الكاملة إلى الجسيمات الفارغة هو معلمة رئيسية في تقييم فعالية ناقلات AAV. الطرق التقليدية ، على الرغم من قدرتها على إنتاج ناقلات AAV ، غالبا ما تكافح للسيطرة على هذه النسبة باستمرار ، مما يؤدي إلى اختلافات في قوة المتجهات10.
هنا ، يتم تقديم طريقة فريدة من نوعها ، والتي تبسط عملية توليد ناقلات AAV عالية الغلة وعالية النقاء باستخدام منصة مصنع الخلايا الخالية من استخدام مزارع الخلايا HEK293T كثيفة العمالة في أطباق الخلايا ، ودمج التقسيم ثنائي الطور من البولي إيثيلين جلايكول / المائي مع الطرد المركزي الفائق التدرج اليوديكسانول. يتم تأكيد نقاء ناقل AAV عبر SDS-PAGE وتلطيخ الفضة ، ويتم تحديد نسبة الجسيمات الكاملة إلى الفارغة باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) ، مما يلبي معايير الجودة للدراسات في الجسم الحي 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، يتم تقديم بروتوكول متقدم تقنيا للإنتاج على نطاق واسع لنواقل AAV عالية العيار وعالية الجودة باستخدام منصة مصنع الخلايا (CF10) ، مما يمثل تحسنا كبيرا مقارنة بطرق طبق زراعة الخلايا التقليدية. يبسط استخدام مصانع الخلايا عملية زراعة كميات كبيرة من الخلايا ، مما يسهل إنتاج فيروسات AAV بشكل أكثر كفاءة1. أيضا ، من خلال تحسين ظروف الاستزراع ، لا سيما مع انخفاض الجلوكوز DMEM المكمل ب 10 mM HEPES و 2٪ FBS ، تم تأكيد إنتاج فيروسي محسن بشكل كبير ، مما يشير إلى الدور الحاسم للبيئة الخلوية في إنتاج الفيروس.
يعالج بروتوكول التنقية المنقح ، الذي يجمع بين AAV من كل من كريات الخلايا ووسائط الاستزراع ، القضية الشائعة المتمثلة في انخفاض غلة الفيروس والشوائب التي شوهدت في العديد من البروتوكولات الحالية. خطوات استخراج الكلوروفورم والتقسيم المائي على مرحلتين تزيل بشكل فعال معظم ملوثات البروتين ، مع بقاء AAV قابلة للذوبان في مرحلة كبريتات الأمونيوم. يمكن أن يعزى التحسن في كل من إنتاجية ونقاء ناقلات AAV باستخدام التقسيم ثنائي الطور PG / المائي جنبا إلى جنب مع الطرد المركزي الفائق للتدرج اليوديكسانول ، على عكس طرق الطرد المركزي الفائق المتدرجة التقليدية ، إلى الفصل الأولي المعزز باستخدام PEG / التقسيم المائي على مرحلتين ، والنقاء المكرر باستخدام الطرد المركزي الفائق التدرج اليوديكسانول وتقليل التنقية المشتركة للملوثات12. أولا ، إدخال PEG / التقسيم المائي على مرحلتين قبل الطرد المركزي الفائق يحسن بشكل كبير الفصل الأولي لجزيئات AAV من الحطام الخلوي والملوثات الأخرى. PEG ، بوليمر عالي الوزن الجزيئي ، عند مزجه بمحلول مائي ، يخلق مرحلتين متميزتين13. تميل ناقلات AAV إلى التقسيم بشكل تفضيلي إلى إحدى هذه المراحل (عادة المرحلة الغنية ب PEG) ، بينما يتم تقسيم العديد من الملوثات والشوائب إلى13 مرحلة أخرى. يركز هذا التقسيم الانتقائي بشكل فعال جزيئات AAV ويزيل جزءا كبيرا من الشوائب حتى قبل الطرد المركزي الفائق ، وبالتالي زيادة العائد وتقليل حمل الملوثات الذي يدخل خطوةالطرد المركزي الفائق 13. ثانيا ، يعمل الطرد المركزي الفائق التدرج اليوديكسانول على تحسين نقاء ناقلات AAV. يسمح Iodixanol ، وهو وسيط تدرج غير أيوني ، متساوي الأسمولية ، بفصل أكثر لطفا وتحكما مقارنة بتدرجات CsCl التقليدية14. في هذا التدرج ، تهاجر جزيئات AAV إلى موضع في التدرج يتوافق مع كثافة الطفو14. والأهم من ذلك ، أن هذه العملية فعالة في فصل قفيصات AAV الكاملة (التي تحتوي على الحمولة الجينية) عن القفيصات الفارغة (التي تفتقر إلى المادة الوراثية) ، وهو محدد حاسم لجودة النواقل. تحافظ طبيعة الأيزو أسمولار في يوديكسانول أيضا على سلامة قفيصات AAV بشكل أفضل من العوامل المفرطة الأسمولية مثل CsCl ، مما قد يؤدي إلى زيادة غلة النواقل الوظيفيةالسليمة 14. أخيرا ، يمكن لطرق الطرد المركزي الفائقة التقليدية ، خاصة تلك التي تستخدم تدرجات CsCl ، في بعض الأحيان أن تشارك في تنقية الملوثات التي لها كثافات طفو مماثلة لناقلات AAV15. باستخدام تقسيم PEG كخطوة أولية ، يتم تقليل حمل هذه الملوثات بشكل كبير قبل الطرد المركزيالفائق 13. هذا الانخفاض في حمل الملوثات يعني أن تدرج اليوديكسانول يمكن أن يعمل بشكل أكثر فعالية وانتقائية في تنقية ناقلات AAV ، مما يؤدي إلى نقاء أعلى15.
يتم تقييم نقاء وجودة ناقلات AAV بدقة من خلال تلطيخ الفضة و TEM11. تشير ملاحظة ثلاثة نطاقات رئيسية تتوافق مع بروتينات قفيصة AAV VP1 و VP2 و VP3 ، بنقاوة تتجاوز 90٪ ، إلى مدى ملاءمة ناقلات AAV هذه للاستخدام في الجسم الحي . يعد تحليل TEM لتحديد نسبة القفيصة الكاملة إلى الفارغة أمرا بالغ الأهمية بشكل خاص ، حيث يمكن أن تؤدي نسبة عالية من القفيصات الفارغة إلى انخفاض كفاءة توصيل الجينات والاستجابات المناعية المحتملة11. وعلى الرغم من أن فحص الجودة هذا ضروري، إلا أنه يزيد من التعقيد الإجرائي وقد يتطلب خبرة تقنية إضافية.
في الختام ، يقدم البروتوكول تطورات تقنية كبيرة في إنتاج ناقلات AAV ، لا سيما من حيث قابلية التوسع والنقاء. ومع ذلك ، فإن التعقيدات المرتبطة بعملية التنقية والحاجة إلى المعدات والخبرات المتخصصة قد لا تزال تشكل قيدا بسيطا على تطبيقها في بعض إعدادات البحث. ومن شأن المزيد من الصقل والتبسيط لهذه التقنيات أن يجعل هذا النهج أكثر سهولة وقابلية للتطبيق على نطاق واسع في مجال أبحاث العلاج الجيني.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
صمم TZ التجارب. أجرى TZ و VD و SB و JP التجارب. تولت TZ و VD البيانات وحللت البيانات. كتب TZ و YX المخطوطة. قام TZ و GG بمراجعة المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل مستشفى UPMC للأطفال في بيتسبرغ.
Materials
| 293T/17 cells | ATTC | CRL-11268 | |
| (NH4)2SO4 | Millipore Sigma | 1.01217.1000 | |
| 0.5 M EDTA | MilliporeSigma | 324506-100ml | |
| 1 mL Henke-Ject syringe | Fisher Scientific | 14-817-211 | |
| 10% pluronic F68 solution | Fisher Scientific | 24-040-032 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Biorad | 1610732 | |
| 1M HEPES | Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| 2% Uranyl Acetate Solution | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4%–20% Precast Protein Gels | biorad | 4561094 | |
| 40% PEG solution | Sigma | P1458-50ML | |
| AAV6 reference full capsids | Charles River Laboratories | RS-AAV6-FL | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Fisher Scientific | A6964-100ML | |
| Benzonase | Sigma | E1014-25KU | |
| BioLite Cell Culture Treated Dishes 150 mm | Fisher Scientific | 12-556-003 | |
| Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC905024 | |
| Corning PES Syringe Filters | Fisher Scientific | 09-754-29 | |
| Dialysis Cassettes, 10 K MWCO | Fisher Scientific | PI66810 | |
| Disposable PES Filter Units 1 L 0.2 µm | Fisher Scientific | FB12566506 | |
| Disposable PES Filter Units 1 L 0.45 µm | Fisher Scientific | FB12566507 | |
| Disposable PES Filter Units 500 mL 0.2 µm | Fisher Scientific | FB12566504 | |
| DMEM high glucose | Fisher Scientific | 10-569-044 | |
| DMEM low glucose | Fisher Scientific | 10567022 | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS 1x | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| Fetal Bovin Serum (FBS) | Biowest | S1620 | |
| Formvar/Carbon 300 Mesh, Cu | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu-50 | |
| glycerol | Sigma | G5516-1L | |
| KCl | Sigma | P9541-500G | |
| LB agar | Sigma | L2897-250G | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP9732-500 | |
| MgCL2·6H2O | Sigma | M9272-100G | |
| NEB stable competent cells | NEB | C3040H | |
| Nest Biofactory 10 chamber | MidSci | 771302 | |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | 740424 | |
| Opti-MEM | Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Millipore Sigma | D1556-250ml | |
| pAAV-CMV-GFP | Addgene | 105530 | |
| pAAV-DJ | Cell BioLab | VPK-420-DJ | |
| pAAV-RC6 | Cell BioLab | VPK-426 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Promega | V3011 | |
| PEI Max | Polysciences, Inc | 49553-93-7 | |
| Pen-Strep | Fisher Scientific | 15-140-163 | |
| Phenol red | Millipore Sigma | 1.07242.0100 | |
| Pierce Silver Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | 24612 | |
| QuickSeal tube | Fisher Scientific | NC9144589 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 1162245000 | |
| sodium deoxycholate | Millipore Sigma | D6750-100G | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32209 |
References
- Arjomandnejad, M., Dasgupta, I., Flotte, T. R., Keeler, A. M. Immunogenicity of recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer. BioDrugs. 37 (3), 311-329 (2023).
- Liu, Y., Siriwon, N., A Rohrs, J., Wang, P. Generation of targeted adeno-associated virus (AAV) vectors for human gene therapy. Curr Pharm Des. 21 (22), 3248-3256 (2015).
- Bilal, A. S., et al. Optimization of large-scale Adeno-Associated Virus (AAV) production. Curr Protoc. 3 (5), e757 (2023).
- Rashnonejad, A., Chermahini, G. A., Li, S., Ozkinay, F., Gao, G. Large-scale production of adeno-associated viral vector serotype-9 carrying the human survival motor neuron gene. Mol Biotechnol. 58, 30-36 (2016).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
- Challis, R. C., et al. Publisher Correction: Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (8), 2597-2597 (2019).
- Mueller, C., Ratner, D., Zhong, L., Esteves-Sena, M., Gao, G. Production and discovery of novel recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Microbiol. 26 (1), 14 (2012).
- Guo, P., Wiersch, J., Xiao, X., Gittes, G. Simplified purification of AAV and delivery to the pancreas by intraductal administration. Methods Mol Biol. 1950, 373-387 (2019).
- Berns, K. I., Srivastava, A. Next generation of adeno-associated virus vectors for gene therapy for human liver diseases. Gastroenterol Clin North Am. 48 (2), 319-330 (2019).
- Khasa, H., Kilby, G., Chen, X., Wang, C. Analytical band centrifugation for the separation and quantification of empty and full AAV particles. Mol Ther Methods Clin Dev. 21, 585-591 (2021).
- Chen, H. Comparative observation of the recombinant adeno-associated virus 2 using transmission electron microscopy and atomic force microscopy. Microsc Microanal. 13 (5), 384-389 (2007).
- Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
- Kato, M., et al. In situ-formable, dynamic crosslinked poly (ethylene glycol) carrier for localized adeno-associated virus infection and reduced off-target effects. Commun Biol. 6 (1), 508 (2023).
- Sena-Esteves, M., Gao, G. Enrichment of fully packaged virions in column-purified recombinant adeno-associated virus (rAAV) preparations by iodixanol gradient centrifugation followed by anion-exchange column chromatography. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 095638 (2020).
- Matsumoto, M., Wangelin, J. R., Murphy, M. L. Purification of avian encephalomyelitis virus by ultracentrifugation in a nonlinear cesium chloride gradient. Avian Dis. 22 (3), 496-502 (1978).
