הליך יעיל וסטנדרטי ליצירת וקטורי וירוסים הקשורים באדנו באיכות גבוהה ובאיכות גבוהה תוך שימוש בפלטפורמת מפעל תאים

פרטי הריאגנטים, הפלסמידים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים. הרכב המאגרים בהם נעשה שימוש מופיע בקובץ משלים 1. 1. הכנת פלסמיד התמירו פלסמידים (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) ב-E. coli.הערה: ניתן להשתמש בכל זן E.coli להגברת פלסמיד. עבור פלסמידים מסוימים, תאים מוכשרים מיוחדים כגון יציב NEB יכולים לשפר את תשואת הפלסמיד. שלושת הפלסמידים המשמשים בפרוטוקול זה הם pAAV-GOI: pAAV-CMV-GFP, pHelper: pAdDeltaF6 ו-pAAV-Cap: pAAV-RC6. לגדל חיידקים במדיה LB המכילה את האנטיביוטיקות הסלקטיביות המתאימות בנפח אופטימלי של 37 ° C למשך 16-18 שעות.הערה: בעת שימוש בתאים יציבים NEB, תרבית ב 30 ° C במשך 18-20 שעות. קצרו DNA פלסמיד על ידי צנטריפוגה של E. coli. תרבית בינונית ב 4000 x גרם, 4 ° C, במשך 15 דקות. שפכו בזהירות את נוזל העל מבקבוק הצנטריפוגה למיכל פסולת וטיהרו את הדנ”א של הפלסמיד מהגלולה בעזרת ערכת טיהור פלסמיד בקנה מידה גדול ללא אנדוטוקסין.הערה: הקפידו לשפוך אותו לאט ולהימנע מהתזה. למדוד את ריכוז הדנ”א ואת טוהר באמצעות ספקטרופוטומטר.הערה: בדוק את טוהר ה- DNA על-ידי בדיקת יחס OD260/OD280 . היחס לדנ”א טהור הוא כ-1.8. ריכוז ה- DNA צריך להיות מעל 1 מיקרוגרם / μL עבור שלב מאוחר יותר co-transfection. צור מלאי גליצרול חיידקי על ידי הוספת 500 μL של תרבית לילה ל 500 μL של 50% גליצרול ב cryovial ולאחסן ב -80 ° C. 2. הכנת תאי HEK293T זרעו HEK293T תאים עם מדיה גבוהה של גלוקוז DMEM המכילה 10% FBS למפעל תאים בן 10 שכבות (CF10) ותנו לתאים לגדול באינקובטור בן לילה.הערה: המעברים של תאי 293T צריכים להיות פחות מ-10 כדי לקבל את המצב האופטימלי לייצור AAV חזק. במידת האפשר, אל תוסיפו אנטיביוטיקה לאמצעי התרבות בשלב זה. שטח הפנים של CF10 גדול בערך פי 42 מזה של צלחת תרבית תאים בקוטר 150 מ”מ. זרעו את אותה צפיפות תאים בצלחת תרבית תאים בקוטר 150 מ”מ כדי לאפשר בדיקת גדילת התאים תחת מיקרוסקופ. הכינו תרחיף תאים של 1075 מ”ל, הוסיפו תרחיף תאים של 25 מ”ל לצלחת של 150 מ”מ והוסיפו את הנותרים ל-CF10. בדוק את מפגש התאים למחרת לפני הטרנספקציה.הערה: תאים צריכים להגיע למפגש של 80%-90% בזמן הטרנספקציה על ידי התבוננות תחת מיקרוסקופ. 3. טרנספקציה משולשת של פלסמידים AAV חשב את כמות כל פלסמיד הדרוש (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-סרוטיפ) כדי לקבל יחס מולארי של 1.2: 1: 1 עם 2.5-5 מ”ג של DNA כולל לכל CF10.הערה: היחס המולרי של שלושת הפלסמידים עשוי להיות משתנה לקבלת יעילות הטרנספקציה האופטימלית. עדיף לבדוק אותו בקנה מידה קטן לפני המעבר להגדרה זו של CF10. pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 ו- pAAV-RC6 משמשים לייצור וירוס AAV6-CMV-GFP כדוגמה. נוסחת מחשבון PEI מופיעה בטבלה 1. Aliquot 350 מ”ל של OptiMEM לתוך בקבוק סטרילי 500 מ”ל. הוסף את כל שלושת הדנ”א של פלסמיד לבקבוק המכיל את Opti-MEM. מערבבים היטב. הוסף 15 מ”ל של תמיסת פוליאתילנימין (PEI) 1 מ”ג/מ”ל (יחס DNA למיקרוגרם PEI) 1:3 מיקרוגרם). נערו את תערובת OptiMEM/DNA/PEI מעלה ומטה במרץ במשך 30 שניות.הערה: זה בסדר לעשות בועות. דוגרים על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות.הערה: דגירה ארוכה יותר עלולה להפחית את יעילות הטרנספקציה. הוסף את תמיסת OptiMEM/DNA/PEI לבקבוק 1 ליטר המכיל 700 מ”ל של גלוקוז נמוך DMEM עם 10 mM HEPES ו-2% FBS. מערבבים היטב.הערה: במחקר זה, גלוקוז נמוך ב- DMEM הראה ייצור וקטורי AAV טוב יותר לאחר טרנספקציה משותפת. תוספת של HEPES מסייעת לשמור על התאים במצב טוב יותר. מערבבים על ידי סיבוב הבקבוק באיטיות. הימנעו מיצירת יותר מדי בועות. הוציאו את CF10 מהאינקובטור ושאבו את המדיה החוצה לתוך מיכל פסולת.הערה: הניחו את CF10 על המשטח בתוך מכסה המנוע והרימו בהדרגה צד אחד למעלה, שאבו באיטיות את המדיה החוצה מבלי לנתק את התאים. הוסיפו בזהירות את תערובת המשקפים ל-CF10. ודא שכל עשר השכבות מכוסות במדיה.הערה: יש להוסיף 25 מ”ל של תערובת מדבקת לצלחת בקוטר 150 מ”מ. עקוב אחר התאים מדי יום עד הקציר. הוסיפו את שארית תערובת הזיהומים ל-CF10 על ידי מזיגה איטית. סובבו את CF10 בזהירות רבה והבטיחו נפח שווה לכל שכבה. להחזיר את CF10 לאינקובטור למשך 72-96 שעות.הערה: בדוק את צלחת הצג בקוטר 150 מ”מ כדי להחליט מתי לקצור את וקטורי ה-AAV. כאשר התאים מתנתקים בקלות רבה עם עומס מלא של AAV, הגיע הזמן לקצור. 4. קצירת וקטורי AAV קצרו את הנגיף 3-4 ימים לאחר ההדבקה על ידי ניעור נמרץ של CF10. יוצקים את התקשורת לתוך צינורות חרוטי 250 מ”ל ולסובב את הנגיף ב 4000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C.הערה: עבור סרוטיפ AAV6 המשמש בפרוטוקול זה, 80% AAV יישאר קשור ברובו לחומר תאי בכדורית. ו-20% AAV הופרשו לתקשורת. פרופורציות אלה עשויות להיות שונות עבור סרוטיפים אחרים AAV. סנן סופרנאטנט מובהר עם יחידת סינון של 0.45 מיקרומטר ושמור אותו למשקעים. שטוף את CF10 עם 500 מ”ל של DPBS, חיץ אחד וצנטריפוגה במהירות 4000 x גרם למשך 20 דקות ב-4°C. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות מערכת ואקום ופיפטה שואפת. הוסף 20 מ”ל של חיץ ליזיס AAV לכל CF10 ב -80 ° C עד לטיהור.הערה: העבר ליזט AAV לצינור חרוטי של 50 מ”ל למיצוי AAV מאוחר יותר. הוציאו את הסופרנאטנט המסונן, הוסיפו 40% תמיסת PEG-2.5M NaCl לריכוז סופי של 8% PEG, ודגרו בחדר קר על מסובב אורביטלי למשך 3 שעות או לילה לפחות.הערה: עבור 100 מ”ל supernatant, להוסיף 25 מ”ל 40% PEG-2.5 M NaCl פתרון. לזרז את הנגיף על ידי צנטריפוגה ב 4000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.הערה: מעבירים את התערובת לצינורות חרוטיים בנפח 250 מ”ל לצנטריפוגה. שואפים להסיר supernatant ולהוסיף 5-10 מ”ל של חיץ מתלה AAV HEPES כדי להשהות את הכדורים. מעבירים לתוך צינור חרוטי 50 מ”ל כדי להמשיך את הטיהור במורד הזרם, או לאחסן אותו ב -80 ° C. 5. מיצוי AAV הפשיר את גלולת הנגיף באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות עם שייקר.הערה: מערבלים את הליזט AAV כדי להמיס לחלוטין. מקפיאים באמבט 100% אתנול בטמפרטורה של -80°C למשך 20-30 דקות.הערה: לחלופין, מחזור ההקפאה יכול להיעשות עם אתנול 100% קרה מוקפת קרח יבש. יש להקפיא/להפשיר 3-4 פעמים, ולערבל בין לבין במידת הצורך.הערה: ניתן להשהות מחזור זה בשלב ההקפאה. אחסן את הליזט AAV ב -80 ° C עד לעבודה במורד הזרם. הפשירו ליזה AAV (משלב 5.3) והשעו מחדש AAV (משלב 4.7)” באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות עם שייקר, ומערבולת.הערה: הקפידו להמיס לחלוטין ולערבב. הוסף נוקלאז בנזונאז (250 יחידות/μL) ל-AAV ליזט ו-AAV מושעה מחדש לקבלת ריכוז סופי של 50 יחידות/מ”ל. מערבולת את הפתרון. יש לדגור באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות למשך 30 דקות.הערה: הוציאו 10% נתרן deoxycholate aliquots באמבט מים כדי לאפשר זמן להתמוסס, להתחמם ולערבב היטב. הוסיפו 10% נתרן דאוקסיכולאט לקבלת ריכוז סופי של 0.5% ודגרו בטמפרטורה של 37°C עם שייקר למשך 30 דקות.הערה: נתרן deoxycholate שימש כדי לשפר את שחרור AAV מהתאים. הפץ את תמיסת ה- AAV הגולמית בצינורות צנטריפוגה של 2 מ”ל ובצנטריפוגות ב- 14,000 x גרם למשך 10 דקות ב- 4 ° C. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חרוטי בנפח 50 מ”ל.הערה: השתמש פיפטה 1 מ”ל כדי להעביר את supernatant. השליכו את הכדורים. מוסיפים כמות שווה של כלורופורם וממצים AAV על ידי ערבול במשך 1-2 דקות.הערה: התמיסה צריכה להיות אטומה, לבנה, דמוית חלב. מעבירים את התמיסה החלבית לצינורות צנטריפוגות בנפח 2 מ”ל ומפזרים באופן שווה. צנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. בזהירות פיפטה החוצה את השכבה הוורודה העליונה ולהעביר אותו צינור חרוטי חדש 50 מ”ל.הערה: אין להפריע לשכבות הכלורופורם/החלבון. מדדו את עוצמת הקול הסופית באמצעות פיפטה. על פי תרשים הנפח הגולמי AAV-PEG-סולפט (טבלה 2), ערבבו נפחים מתאימים של 50% (NH4)2SO4 ו-40% תמיסת PEG. מערבולת במשך 2 דקות. מעבירים את התערובת לצינורות צנטריפוגות של 2 מ”ל לפיזור שווה. צנטריפוגה ב-14,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C לאסוף את השכבה התחתונה באמצעות מחט 22 G מזרק 3 מ”ל. לאסוף את AAV בצינור חרוטי 50 מ”ל ולאחסן אותו ב 4 ° C עבור יודיקסנול הדרגתי מאוחר יותר ultracentrifugation. 6. טיהור AAV על ידי אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול הכינו את שיפועי היודיקסנול טריים לפני טעינת ה-AAV בהתאם למספר צינורות האולטרה-צנטריפוגה שבהם נעשה שימוש (טבלה 3).הערה: פנול אדום שימש כדי לצפות בשכבות. שכבו כל תמיסה לתוך צינור פוליפרופילן אולטרה-צנטריפוגה עגול ואטימה מהירה באיטיות באמצעות מזרק 10 מ”ל המחובר עם מחט ארוכה מנוקבת 16 גרם. הימנעו מבועות. הוסף בזהירות עד 17 מ”ל של תמיסת AAV על גבי שיפוע עם מזרק 22 G. השתמש במאגר דיאליזה AAV כדי לקלף את הצינור.הערה: הוסף את תמיסת ה- AAV על-ידי טעינת טיפות על הקיר בצינור האולטרה-צנטריפוגה. אין להפריע לשכבות מעבר הצבע. אטמו את צינורות האולטרה-צנטריפוגות באמצעות אוטם חשמלי.הערה: אזנו את הצינורות לפני שליחתם לאולטרצנטריפוגה בהפרש של 0.2 גרם ±. צנטריפוגה ב 350,000 x גרם במשך 2 שעות ברוטור Ti70 ב 4 ° C. בזהירות להסיר את צינורות מן הרוטור ומניחים אותם במתלה צינורות ultracentrifuge.הערה: ודא שהמעברים ההדרגתיים אינם מופרעים. אסוף שברי AAV לפי השלבים הבאים:ייצבו את הצינור על מחזיק מעמד. נקב את צינורות אולטרה צנטריפוגה מעט מתחת לממשק 40%-60% עם מחט 19 G המחוברת מזרק 10 מ”ל.הערה: פתח המחט צריך להיות כלפי מעלה, מול שיפוע של 40%. ניקוב חור בחלק העליון של הצינור עם מחט 16 גרם. לאסוף עד 5 מ”ל לכל צינור. הימנעו מאיסוף זיהום החלבון בממשק של 25%-40%. חזור על הפעולה עבור כל צינור אולטרה-צנטריפוגה.הערה: העבר את שברי AAV לצינור חרוטי של 50 מ”ל. 7. סיבוב שני יודיקסנול הדרגתי אולטרה-צנטריפוגה הערה: שלב זה הוא אופציונלי. שלב זה הוא להפחית את יחס AAV הריק לקבלת קפסיד AAV מלא באיכות גבוהה יותר. דילול AAV >1:1 עם חיץ דיאליזה AAV.הערה: AAV שנאסף מהסבב הראשון של אולטרה-צנטריפוגה היה בשכבת יודיקסנול של 40%. זה צריך להיות מדולל על ידי לפחות 50% כדי להיות מסוגל להיות טעון על גבי שכבת 30% יודיקסנול. הניחו כל תמיסה (טבלה 4) לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה באמצעות מחט מנוקבת של 16 G וחברו באיטיות מזרק בנפח 10 מ”ל. הימנעו מבועות. בזהירות להוסיף 20 מ”ל של פתרון AAV מדולל על גבי שיפוע עם מזרק 22 גרם. השתמש במאגר דיאליזה AAV כדי לקלף את הצינור. חזור על השלבים 6.4 עד 6.7. 8. דיאליזה AAV וריכוז להעביר את וירוס AAV לתוך קלטת דיאליזה באמצעות מחט חדשה 18 G מזרק 10 מ”ל. לאט לאט להזריק את הנגיף לתוך קלטת ולהוציא אוויר ממנו. הוסיפו לכוס ערבוב המכילה חיץ דיאליזה AAV והניחו על צלחת ערבוב. הכניסו את קלטת הדיאליזה למאגר הדיאליזה בעזרת מצוף ציפה. יש לערבב ב-4°C. שנה פי 2-3 את מאגר הדיאליזה AAV.הערה: השתמש במאגר מספיק כדי לאפשר לקלטת לצוף ולבצע את החלפת המאגר. מכסים את הכד ברדיד אלומיניום. באמצעות מזרק 10 מ”ל מחובר עם מחט 18 גרם, לאסוף את הנגיף מן הקלטת לתוך יחידת מסנן צנטריפוגלי. צנטריפוגה ב 4,000 x גרם במשך 15-30 דקות ב 4 ° C.הערה: יש לשטוף את ה-AAV עם חיץ דיאליזה AAV 2-3 פעמים. רכז את ה- AAV עד ~ 200 μL של הנותר על גבי המסנן. אסוף את ה- AAV המרוכז מיחידת הסינון. שטפו את המסנן עם עוד 300 μL של מאגר דיאליזה AAV והעבירו אותו ל-AAV המרוכז. סנן את הנגיף דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר באמצעות מזרק 1 מ”ל שחפת להחליק. כדי להבטיח אובדן נפח מינימלי, השתמש במזרק 10 מ”ל כדי לדחוף אוויר דרך המסנן 2-3 פעמים. אחסן את נגיף AAV מטוהר ב 4 ° C באופן זמני לטיטרציה.הערה: טיטרט את הנגיף, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C בתוך שבוע אחד. 9. טיטרציה של נגיף AAV הערה: תגובת שרשרת פולימראז כמותית TaqMan (qPCR) שימשה לטיטרציה של AAV מטוהר. יש לטפל בווקטורים AAV עם DNase I ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות, ולאחר מכן לדגור בטמפרטורה של 95°C למשך 10 דקות.הערה: כדוגמה לתגובה של 10 μL, נעשה שימוש בדגימת וירוס AAV של 2 μL, 1 μL DNase, מאגר DNase של 1 μL ו- 6 μL H2O. זה יכול להתבצע thermocycler עם צינורות PCR. הכינו את ערכות הפריימר המתמקדות באזור הוספת AAV.הערה: המטרות יכולות להיות המקדם, הטרנסגן והכתב במבנה AAV. הפריימרים מפורטים בטבלה 5. הכינו תקני פלסמיד DNA (10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 ו- 0.0001 pg/μL) ובקרה שלילית (H2O). הכינו את תערובת האב qPCR, כולל פריימרים, בהתאם להוראות היצרן. הניחו את התקנים והדגימות בשילוש על לוחית PCR. הוסף את תערובת qPCR לתקנים ולדגימות. אטמו את הצלחת ובצעו את תגובת ה-qPCR בהתאם להוראות היצרן.הערה: תנאי התגובה תלויים בחומרים/ריאגנטים ובמכשיר. מחזורי PCR מהירים וקונבנציונליים ישימים. חישוב טיטר וירוס AAV.הערה: ריכוז הדגימה בפרוטוקול זה הוא דילול של 1/10 מהדגימות המקוריות. Aliquot וירוס AAV בצינורות 1.5 מ”ל ולאחסן ב 4 ° C עד חודש אחד לאחסן ב -80 ° C לטווח הארוך.הערה: הימנע ממחזורי הקפאה/הפשרה עבור האחסון. כאשר משתמשים בניסויי in vivo , אין להשתמש בהפשרה מעל פעמיים aliquots. 10. בקרת איכות של AAV הערה: נגיפי AAV אופיינו לטוהר על ידי כתם כסף SDS-PAGE באמצעות ג’ל SDS-PAGE והוכתמו באמצעות ערכת צביעה מסחרית. Denature 3 x 109 vg של דגימת וירוס AAV עם מאגר Laemmli.הערה: השתמש בווירוס AAV הפניה כפקד. נעשה שימוש בקפסיד מלא לייחוס AAV6-CMV-GFP. טען את ה-AAV המפורק על ג’ל SDS-PAGE הדרגתי של 4%-20% והפעל במתח של 180 וולט למשך 50 דקות. מוציאים את הג’ל מצלחת האלקטרופורזה. מכתימים את הג’ל בערכת צביעה כסופה בהתאם להוראות היצרן. בדוק את חלבוני הקפסיד AAV VP1, VP2 ו- VP3.הערה: וירוס AAV טהור מכיל רק VP1, VP2 וחלבון קפסיד VP3. אם לא טהור, רצועות חלבון אחרות ייראו על הג’ל.הערה: מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) של נגיפים רקומביננטיים רקומביננטיים מוכתמים שליליים בוצע כדי להעריך שלמות מורפולוגית ויחס מלא/ריק. הרימו רשת EM עם פינצטה והניחו על הספסל כשהצד המבריק של הרשת פונה כלפי מעלה. פיפט 5 μL של דגימת AAV על הרשת ולאפשר לה להתייבש על ידי אידוי.הערה: יש לדלל את ה-AAV במידת הצורך. 1012 vg / mL הוא titer ממוצע. זה עלול לקחת 30-60 דקות כדי לייבש את הרשת. לשטוף את הרשת על ידי pipetting, טיפה אחר טיפה, עם כ 200 μL של H2O על הרשת. הסר את עודפי המים על-ידי הנחת נייר כרומטוגרפיה אנכית ליד הרשת. Pipet 5 μL של 2% תמיסת אצטט Uranyl על הרשת. דוגרים במשך 5 דקות ומנדפים כאמור. הניחו לרשת להתייבש. דמיינו את חלקיקי ה-AAV תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (בהגדלה של פי 50,000). קפסידים נגיפיים בעלי גנום ויראלי יופיעו כמשושים לבנים הומוגניים, בעוד שקפסידים ריקים יופיעו כמשושים בעלי שפה לבנה אך מרכז כהה. ספור באופן אקראי לפחות 100 חלקיקים כדי לקבוע את האחוז המשוער של מלא לעומת . חלקיקי AAV ריקים.