Bu yazıda, hücresel replasman tedavilerini test etmek için ex vivo bir model olarak nöral kök hücrelerle nakledilen uzun süreli omurilik organotipik dilimleri oluşturmak ve sürdürmek için tekrarlanabilir bir yöntem sunuyoruz.
Karmaşık patofizyoloji nedeniyle omurilik yaralanmaları (SCI’ler) için kalıcı tedaviler hala eksiktir. En umut verici rejeneratif yaklaşımlardan biri, kaybedilen dokuyu yerine koymak ve fonksiyonel iyileşmeyi desteklemek için kök hücre transplantasyonuna dayanmaktadır. Bu yaklaşım, daha pahalı ve zaman alıcı hayvan testlerine devam etmeden önce güvenlik ve etkinlik için in vitro ve ex vivo olarak daha iyi araştırılmalıdır. Bu çalışmada, SCI’ler için hücresel replasman tedavilerini test etmek için insan nöral kök hücreleri ile nakledilen fare omuriliği (SC) organotipik dilimlerine dayanan uzun vadeli bir platformun kurulmasını gösteriyoruz.
Standart SC organotipik kültürler in vitro olarak yaklaşık 2 veya 3 hafta korunur. Burada, 90 güne kadar uzun süreli bakım (≥30 gün) için optimize edilmiş bir protokol açıklıyoruz. SC dilimlerinin uzun süreli kültürlenmesi için kullanılan besiyeri, nöral kök hücrelerin organotipik modele nakli için de optimize edilmiştir. Yeşil floresan protein (GFP) raportörü taşıyan insan SC kaynaklı nöroepitelyal kök (h-SC-NES) hücreleri, fare SC dilimlerine nakledildi. Nakilden otuz gün sonra, hücreler hala GFP ekspresyonu ve düşük bir apoptotik oran gösteriyor, bu da optimize edilmiş ortamın hayatta kalmalarını ve doku içindeki entegrasyonlarını sürdürdüğünü gösteriyor. Bu protokol, SC dokusunda hücre replasman tedavilerini verimli bir şekilde test etmek için sağlam bir referansı temsil eder. Bu platform, araştırmacıların farklı hücre nakli tedavilerinin ex vivo ön taramasını yapmalarına olanak tanıyacak ve in vivo deneylere devam etmeden önce en uygun stratejiyi seçmelerine yardımcı olacaktır.
Travmatik omurilik yaralanmasının (SKY) hastalar ve bakıcılar için yıkıcı fiziksel, psikolojik ve ekonomik sonuçları vardır1. Farklı yaklaşımlarla SCI’de aksonal rejenerasyonu teşvik etmek için birçok girişimde bulunulmuştur 2,3,4 ve hücre replasman tedavileri yoluyla yaralanma bölgesindeki proksimal ve distal nöronlar arasında nöronal rölelerin oluşumu ile bazı yararlı etkiler gösterilmiştir. Hücre tedavilerine olan ilgi hala artmaktadır5 çünkü nakledilen hücreler trofik destek sağlama, bağışıklık modülasyonu, plastisite indüksiyonu yoluyla kayıp nöral devrelerin yenilenmesi, hücre replasmanı ve akson remiyelinizasyonu6 dahil olmak üzere birçok rol oynayabilir.
Son zamanlarda, bu alandaki ana çaba insan nöral kök/progenitör hücrelerine (NSC’ler/NPC’ler) odaklanmıştır7. Birkaç çalışma, NSC’lerin/NPC’lerin astrosit yanıtı8’i modüle ettiğini, prorejeneratif faktörlerin9,10 salgılanmasını teşvik ettiğini ve SCI 11,12’deki eksik nöronal hücrelerin yerini aldığını göstermektedir. Bununla birlikte, nakledilen hücrelerin fonksiyonel nöronlara farklılaşmasını destekleyen çalışmalar hala zayıftır. Ayrıca, yaralı omurilikte (SC) nakledilen hücre sağkalımı ve farklılaşması düşüktür13, çünkü muhtemelen nakledilen hücrelerin in vivo olarak farklılaşması birkaç hafta, hatta aylar alır. Ek olarak, mevcut çalışmalar hücre replasman tedavilerinin birçok biyokimyasal, moleküler, hücresel ve fonksiyonel yönünü tam olarak aydınlatmamıştır. Bu bağlamda, hücre aşılama mekanizmalarını, aşılanmış hücrelerin çoğalma, belirli hücre tiplerine veya alt popülasyonlarına farklılaşma ve yerleşik nöronlarla sinapslar oluşturma yeteneklerini incelemek için basit, hızlı ve uygun maliyetli modeller gereklidir.
Histolojik çalışmaların elektrofizyolojik kayıtlara ve transkriptom ve proteom profillemesine entegre edilmesi, hücre transplantasyonundan sonra meydana gelen moleküler kaskadının tam olarak anlaşılması için gereklidir. Bu kesinlikle klinik öncesi modellerde ve klinik çalışmalarda yeni hücre replasman tedavilerinin tasarımını ve doğrulanmasını hızlandıracaktır. Gerçekten de, bugüne kadar, kemirgenlerin, büyük hayvanların ve insan olmayan primatların kullanımı, transplantasyondan sonraki birçok hücresel süreci aydınlatmak için değerli olmuştur14. Bununla birlikte, yüksek maliyet, yüksek etik etki ve organizmanın karmaşıklığı nedeniyle, kullanımları genellikle basit değildir veya biyokimyasal ve moleküler süreçleri çözmek için yeterli değildir. Ek olarak, hem türler arası (metabolizma) hem de tür içi değişkenlik (cinsiyet, yaş) gibi biyolojik farklılıklarla ilişkili birçok dezavantaj sunabilirler. Bu faktörler, stresli durumlar gibi dış faktörlerle birlikte, bir deneyin sonucunu ve insanlara terapötik çeviri açısından öngörülebilirliğini değiştirebilir 15,16,17.
Bu nedenle, birçok grup, hayvan modellerine ek olarak 2D in vitro hücre kültürü ve ex vivo organotipik dilimler (ex vivo kültürler) kullanır. 2D hücre kültürü, tek hücre ve/veya hücre popülasyonu düzeyinde belirli biyolojik süreçleri incelemek için en yaygın kullanılan sistemdir. Bununla birlikte, tek katmanlı hücre kültürleri, bütün bir organizmada bulunan karmaşıklığı yansıtmaz. Doku yapılarının ve fizyolojik ortamın olmaması, 2D kültür sistemlerinin araştırılan dokunun temel yapısal, morfolojik ve fonksiyonel yönlerini tamamen taklit etmesine izin vermez 18,19,20.Organotipik kültürler bu sorunların bazılarının üstesinden gelebilir. Organotipik modeller, bir doku veya organın bir parçasının çıkarılmasına ve sınırlı bir süre için ex vivo olarak korunmasına dayanır21,22. Özellikle, ekilen dokunun dilimleri, besin maddelerinin dilimlerdeki hemen hemen tüm hücrelere kolayca ulaşmasını sağlayan kesin bir kalınlıkta üretilir. Hipokampus, hipotalamus, beyincik, talamus, serebral korteks, substantia nigra ve striatum ve omurilik gibi merkezi sinir sisteminin çeşitli bölgelerinden üretilebilirler23. Organotipik kültürler, doku mimarisini, hücrelerin mekansal dağılımını, hücresel çeşitliliği ve orijin organın çevresini (yani hücre dışı matris bileşimini) korur. Ayrıca, orijinal nöral aktiviteyi, hücreler arasındaki bağlantıları ve özellikle eksplanttan sonra kısa mesafeli devreleri korurlar.
Bu yönler, hem tek katmanlı kültürler hem de hayvan modelleri açısından ex vivo kültürler için bazı avantajlar sağlar. İn vivo bulunan temel doku özelliklerini korurlar, ancak maliyetlerin azaltılması ve kültür çevresel parametrelerinin doğru bir şekilde düzenlenmesi ile farklı türde moleküler, hücresel ve fonksiyonel deneyler gerçekleştirme imkanı ile 24,25,26,27,28,29. Organotipik dilimler, belirli durumların temel histopatolojik özelliklerine benzeyerek farklı nörolojik bozukluklar için modeller geliştirmek için de kullanılabilir30. Ayrıca, orijinal çok hücreli doku ortamının korunması, onları ilaç taraması ve nöroprotektif ve nöro-rejeneratif molekülleri ve materyalleri test etmek için uygun platformlar haline getirir.
Bu çalışmada, NSC nakillerini optimize etmek için SC organotipik kültürlerin bir model olarak kullanılmasını öneriyoruz. Bu önemsiz değildir, çünkü hem konakçının (SC dokusu) hem de naklin (NSC’ler) haftalarca hayatta kalmasını garanti etmek için optimal kültür koşulları gereklidir. Organotipik kültürlerde, beyin kaynaklı ve SC türevli, çeşitli hücre tiplerinde aşılanmış farklı araştırma grupları. Çalışmaların çoğu mezenkimal kök hücrelerin (31,32,33), koku alma kılıf hücrelerinin34 veya NSC’lerin35,36,37,38,39,40 transplantasyonunu gösterdi ve aşılanmış hücrelerin konak hücrelerle etkileşimlerini, tüm sistemin hayatta kalmasını ve nakledilen hücrelerin nöronlara mı yoksa nöron benzeri hücrelere mi farklılaştığını değerlendirdi ex vivo doku ortamı içinde 32,33,41. Bazıları, nakil sonrası hücrelerin rejeneratif potansiyelini değerlendirdi, doku içindeki aksonal büyümelerinigözlemledi 37,40,41, oligodendrositlerin42 aşılanmış öncülerinin miyelinasyon yeteneğini, aşılanmış hücrelerin konakçı dokuya göçünü43 ve nakledilen hücrelerin prorejeneratif bir ortama doğru iten faktörleri serbest bırakıp bırakmadığını31. Mevcut çalışmaların bir sınırlaması, uzun süreli bir süre boyunca aşılamayı araştırmamalarıdır.
NSC’lerin in vivo 44,45 ayırt etmek için birkaç haftaya ihtiyaç duyduğu göz önüne alındığında, bu çalışma uzun süreli (≥30 gün) fare SC dilimlerinin nasıl oluşturulacağına ve 90 güne kadar nasıl sürdürüleceğine odaklanmaktadır. Dilimlerin orijinal anatomik yapılarını korudukları ve zaman içinde düşük ve stabil bir apoptotik oranı ve yüksek hücre canlılığını korudukları bulundu. Nöronal belirteçler RNA bağlayıcı fox-1 homolog 3 (RBFOX3) ve nörofilament hafif zincirin (NFL) yaygın ekspresyonunu gözlemledik, ikincisi zamanla dilimlerin etrafında artan bir aksonal filizlenme eğilimi gösterdi ve sağlıklı durumlarını doğruladı. Ayrıca, nöronal farklılaşmanın ilk aşamalarında SC dilimleri GFP eksprese eden insan SC türevli nöroepitelyal kök (h-SC-NES) hücrelerine başarılı bir şekilde nakledildi. NSC grefti, nakilden sonra 30 gün boyunca korundu ve hücreler kültürdeki tüm süre boyunca GFP ekspresyonu gösterdi. Nakil sonrası gün (DPT) 30’daki hücrelerin apoptotik oranının, aynı hücrelerde40 DPT 7’de gözlenen apoptotik hız değerine göre de uyumlu olduğu bulundu. Hücreler doku ortamına aşılanmış gibi görünüyordu ve birkaç haftaya kadar hayatta kaldı.
Özetle, verilerimiz SK organotipik dilimlerin orijinal sitomimarisinden ve doku ortamından ödün vermeden 3 ay boyunca kültürde tutulmasının mümkün olduğunu göstermektedir. En önemlisi, in vivo bir deneye devam etmeden önce hücre tedavilerini test etmek için kullanılabilirler, böylece maliyetleri ve deney süresini azaltırlar. Burada, fare SC organotipik dilimleri oluşturmak için tüm pasajları ve bunların uzun süreli süreler boyunca (≥30 gün) nasıl korunacağını ayrıntılı olarak gösteriyoruz. Ayrıca, dilimlere NPC naklinin nasıl gerçekleştirileceğini ve bunların aşağı akış analizi için nasıl korunacağını derinlemesine açıklıyoruz.
Farklı yaklaşımlar test edilmiştir ve en umut verici olanlardan biri rejeneratif bir strateji hücre replasmanına dayanmaktadır. Şu anda, rejeneratif tıp alanındaki gelişmeler, hücre nakillerinin etkinliğini ve güvenliğini tek başına veya diğer yaklaşımlarla kombinasyon halinde test etmek için yeni platformlar gerektirmektedir. Klinik öncesi doğrulamaları, daha ileri klinik çalışmalara devam etmek için esastır. SK organotipik kültürler, nörodejenerasyon, nöral rejenerasyon ve nörogelişimin farklı yönlerini incelemek ve yeni terapötik yaklaşımların etkinliğini araştırmak için yararlı bir platformdur23. Özellikle, organotipik kültürlerin orijinal histomimarisinin ve hücre ve mikroçevre bileşiminin korunması gibi spesifik özellikleri, hücre aşılaması, entegrasyon, farklılaşma ve olgunlaşma gibi transplantasyon dinamiklerini çözmek için avantajlıdır.
Yayınlanmış protokollerle tutarlı olarak, SC organotipik dilimler sağlıklı koşullarda yaklaşık 2-3 hafta kültürde tutulabilir, bu da hücre tedavisinin test şemaları için gerekli olan uzun süreli araştırmalar ve fonksiyonel tarama için kullanımlarını sınırlar. SK dokusu içinde nakledilen hücrelerin doğru kaderine doğru farklılaşma ve olgunlaşma gibi önemli süreçleri araştırmak, uzun süreli izleme gerektirir. Bu hücresel süreçler, hayvan modellerinde yaygın nakiller sırasında kritik öneme sahiptir. İn vivo olarak mevcut birçok özelliği taklit eden bir ex vivo sistemin varlığı, klinik öncesi tarama aşamasında yardımcı olacaktır.
Bu nedenle, bu çalışmada, canlı SC dilimlerinin 90 güne kadar korunmasına izin veren ve normal kültür zaman çerçevelerini üç katına çıkaran optimal bir uzun vadeli (≥30 gün) SC organotipik kültür yöntemi öneriyoruz. Ayrıca, SC dilimleri içinde stabil h-SC-NES hücre engraftmanı ve nakil kültürünün 30 güne kadar sürdürüldüğünü gösteriyoruz. DPT 30’a kadar hücre sağkalımını doğrulamak için GFP ekspresyonunu gözlemleyerek zaman içinde hücre aşılamasını izledik. 30 DPT sonrası hücre apoptoz oranını değerlendirdik. Literatürde, nakledilen h-SC-NES hücrelerinin 7 DPT’de SC-kesitlerde apoptozisinin değerlendirilmesi bildirilmiştir40. Burada, apoptotik oranı daha önceki zaman noktasına (DPT 7) göre karşılaştırmak için DPT 30’da hücre apoptoz analizini genişlettik. Verilerimizin literatürle uyumlu olduğunu bulduk, bu da nakledilen h-SC-NES hücrelerinin, çalışmamızda optimize edilmiş kültür koşullarında tutuldukları takdirde daha sonraki bir zaman noktasında da hayatta kaldıklarını gösteriyor. Bu geliştirilmiş uzun vadeli ex vivo platform tek başına ve nakil konfigürasyonunda, araştırmacılara SCI için kök hücre bazlı nakiller için klinik öncesi taramada yardımcı olacaktır. Bu, nakillerin başarısını teşvik eden daha ileri in vivo çalışmalar için en iyi hücre adayını belirlemelerine olanak sağlayacaktır. Ayrıca, ilk taramadan sonra, SC organotipik dilimler, hayvan modellerinde gözlemlenen uzun vadeli hücresel dinamikleri ve davranışları doğrulamak ve desteklemek veya mekanik çalışmaları desteklemek için in vivo çalışmalara paralel olarak da kullanılabilir.
Protokolümüz, bu uzun vadeli organotipik modelin nasıl oluşturulacağını ayrıntılı olarak açıklamaktadır, ancak bazı kritik adımların da tartışılması gerekmektedir. SK organotipik kültürlerin oluşumu ile ilgili olarak, cerrahi ve kültürün ilk aşamaları sırasında bazı zorluklar vardır. Orijinal histomimariyi koruyan dilimler oluşturmak için iyi yapılmış bir cerrahi prosedür şarttır. İzolasyon sırasında SC bozulursa, dilimler tipik anatomik yapılarını kaybedebilir ve doku hasarı, sağlıksız koşullara ve hücre ölümüne yol açan aşırı bir pro-inflamatuar hakarete neden olabilir. Ameliyat sırasında en zorlu aşama omurgadan SK’nin çıkarılması ve izole edilen SK’den meninkslerin çıkarılmasıdır. Bu adımların başarısı operatörün deneyimine bağlıdır; Bu nedenle, deneylere başlamadan önce bir eğitim dönemi önerilir.
SC’nin bir kıyıcı aracılığıyla koronal kesit alınması da zorlu bir aşamadır. İzole edilmiş SC, bıçağa tam olarak dik olarak kesme tablasına yerleştirilmelidir. Operatör ayrıca bıçağı kesme tablasına dik olarak yerleştirmelidir. Bu önlemler, aynı ve farklı deneyler arasında tekrarlanabilir dilimlerin oluşturulmasını sağlamak için gereklidir. Bir diğer önemli konu ise ameliyat için zamanın sınırlı olmasıdır: tüm dilim oluşturma işleminin ~ 30 dakika sürmesi gerekir. Operatör ameliyat ve kesme için daha fazla zaman harcarsa, SC dokusu zarar görür ve bu da kültürün başarısını ve deneyin sonraki adımlarını bozabilir.
Dilimler kültür zarına yerleştirildikten sonra, onları doğru şekilde beslemek önemlidir. GDNF, doku iyileşmesini ve sağkalımını sürdürmek için gereklidir. Bir kıyıcı ile kesmek doku için travmatiktir ve bu nedenle, pro-enflamatuar ve ölümü teşvik eden moleküllerin fazlalığını temizlemek için kesimden kısa bir süre sonra buz gibi soğuk bir diseksiyon ortamına dilimler yerleştirilir. Daha sonra, daha hızlı bir toparlanma ve zara dilim yapışmasını teşvik etmek için GDNF ile modifiye edilmiş taze besiyeri ile kültür zarlarına (hücre kültürü ekleri) dilimler yerleştirilir. GDNF, kısa yarılanma ömrü50,51 nedeniyle kültürdeki ilk hafta boyunca her gün ortama eklenmelidir. Doku iyileşmesini ve canlılığını desteklemek için dilimlerin kültürdeki ilk günlerde sürekli GDNF varlığına ihtiyaç duyduğunu gözlemledik. Her halükarda, GDNF’nin varlığı tüm kültürleme dönemi için önemli olduğundan, GDNF uygulamasının daha sonraki zaman noktalarında kesintiye uğratılması kesinlikle önerilmez.
Kültürdeki ilk hafta boyunca, dilimleri makroskopik olarak gözle ve mikroskopta kontrol etmek de önemlidir. Yarı saydam doku ve sınırların şeffaflığı, dilimlerin zara ve canlı dokuya düzgün bir şekilde yapıştığının işaretleridir. Nekrotik doku ilk makroskopik bakışta son derece beyaz görünecek ve nekrotik alanlar mikroskopta koyu gri görünecektir. Kültürde birkaç hafta sonra, dokunun morfolojisi değişebilir: hücre hareketleri ve zara doku yapışması bu süreci etkileyebilir. Örneğin, hücrelerle dolu bazı dilimlerde merkezi lümen kaybını ve dorsal ve ventral boynuz morfolojisinin kaybını gözlemledik. Bu, esas olarak daha küçük dilimlerde olurken, çoğu orijinaline yakın bir anatomik yapıyı koruyacaktır. Dilimler genellikle lomber veya torasik bölgelerden üretilir, çünkü bu şekilde zaman içinde orijinal histomimarilerini korumak için uygun boyuta sahip olabilirler: çok küçüklerse mimarilerini kaybederler, çok büyüklerse merkezi bölge nekroza girebilir. Bu nedenle, optimum uzun vadeli kültürleme için uygun boyutta dilimler oluşturmak için fare yavrularının bel bölgesini kullandık, ancak prensip olarak diğer segmentler de düşünülebilir. Ayrıca ventral ve dorsal bölgeler birbirinden daha belirgin olduğu için lomber bölgeyi kullanmayı tercih ettik. Ek olarak, bu bölge, SCI’de hücre replasman tedavileri için ilgi alanları olan daha yüksek oranda motor nöronlar ve gri cevher içeren doku alanları sunar. Hücrelerin dilimlere nakli ile ilgili asıl sorun, cam mikroiğne ucunun kırılması ile ilgilidir. Hücrelerin geçişi için delik çok büyükse, mikroenjeksiyon sırasında SC dokusuna zarar verebilir. Çok küçükse, hücre istiflenmesi iğneyi tıkayarak nakil sürecini engelleyebilir. Hücre acısını ve ölümünü en aza indirmek için transplantasyon prosedürü 1 saat içinde tamamlanmalıdır.
Önerilen protokol, farklı araştırma türleri için optimal ve çok yönlü bir araç sağlar. Burada, 30 gün boyunca fare SC dokusu içindeki farklılaşmanın ilk aşamalarında h-SC-NES hücrelerinin transplantasyonunu doğrulamak için uzun vadeli platformumuzu uyguluyoruz. Önerilen yaklaşımın ana yeniliği, ko-kültür protokolünün optimizasyonudur. GM’nin bileşenleri, SC dilimlerinin ve nakledilen h-SC-NES hücrelerinin uzun süreli nöronal sağkalımını sürdürür. Gerçekten de, serum içermeyen bir ortam olan GM, daha önce organotipik dilim kültürü47 için kullanılan ortama göre nakledilen hücrelerin nöronal kadere doğru farklılaşmasını sürdürür.
SCI için önerilen modellerle ilgili olarak, deneyler genellikle yetişkin fareler üzerinde gerçekleştirilir. Şimdiye kadar, yenidoğan ve yetişkin SK arasındaki en önemli farklar, yetişkin farelere göre yenidoğanda bulunan daha yüksek rejeneratif potansiyel ile ilgilidir52. Bununla birlikte, bu tür farklılıkların önerdiğimiz protokol türü üzerinde hiçbir etkisi yoktur, çünkü burada aşılanmış hücrelerin yerleşik nöronların rejenerasyon yeteneklerinden ziyade ev sahibi doku ortamına verdiği tepkiye odaklanıyoruz. SCI’den sonra yenidoğan ve yetişkin fareler arasındaki diğer bir fark, yetişkinlerde ortaya çıkan glial skar oluşumu ile ilgilidir. Bu husus, birincil ve ikincil yaralanmalardan kaynaklanan karmaşık fizyopatolojik süreçleri dikkate almayan önerilen modelde dikkate alınmamaktadır.
Uygulamalarla ilgili olarak, platform, nakledilen hücreler ile SC organotipik modelinde bulunan yerleşik devreler arasındaki entegrasyonu araştırmak için de kullanılabilir. Genetik mühendisliği araçları, sinaptik bağlantıyı değerlendirmek için CNS’de zaten kullanılıyordu ve bu bağlamda kullanılabilirdi 53,54,55. Özellikle, engrafta hücreler ve SC ex vivo doku arasındaki sinaps oluşumu değerlendirilerek entegrasyon araştırılabilir ve doğrulanabilir. Bu uzun süreli organotipik kültürler, nöroprotektif ve nörorejeneratif ajanları veya yeni molekülleri/materyalleri test etmek veya SK’yi içeren nörodejeneratif bozuklukları incelemek için de kullanılabilir. Spesifik nörodejeneratif bozuklukları incelemek için, protokolün, patoloji için ilgili aşamada (yani yenidoğan, genç, yetişkin) spesifik patoloji ile ilişkili mutasyonları taşıyan transgenik fareler gibi ilgili modellerden üretilen SC dilimlerinin kültürlenmesi için uyarlanması gerekir. Sonuç olarak, protokolümüz ve genel olarak organotipik kültürlerimiz, belirli bir organın eksplantları olarak, 2D hücre kültürleri ile in vivo modeller arasındaki boşluğu dolduran özellikler sunar ve bunları hem temel araştırmalar hem de klinik öncesi testler için paha biçilmez bir araç olarak onaylar.
The authors have nothing to disclose.
Çalışma, Wings for Life Vakfı (WFL-IT- 20/21), Avrupa Birliği Yeni Nesil AB-Ulusal Toparlanma ve Dayanıklılık Planı (NRRP)-misyon 4 bileşen 2, yatırım n. 1.4-CUP N. B83C22003930001 (Toskana Sağlık Ekosistemi-THE, Spoke 8) ve Marina Romoli Onlus tarafından desteklenmiştir. Bu yazı sadece yazarların görüş ve düşüncelerini yansıtmaktadır, ne Avrupa Birliği ne de Avrupa Komisyonu bunlardan sorumlu tutulamaz. Veriler ve meta veriler Zenodo 10.5281/zenodo üzerinde mevcuttur.10433147. Görüntüler Biorender https://www.biorender.com/ ile oluşturulmuştur.
anti-cleaved Caspase-3, (Asp175) (5A1E) (Rabbit) | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:400 |
anti-GFP (Mouse) – monoclonal | Sigma/Merck | G6539 | 1:400 |
anti-Human Nuclei (Mouse) – monoclonal, clone 235-1 | Sigma/Merck | MAB1281 | 1:400 |
anti-Human Nuclei (Rabbit) | NeoBiotechnologies | RBM5-346-P1 | 1:400 |
anti-NeuN (RBFOX3) (Rabbit) – polyclonal | Sigma/Merck | ABN78 | 1:400 |
anti-NFL (Mouse) | Sigma/Merck | MAB1615 | 1:400 |
anti-NFL H-Phospho (Rabbit) -polyclonal | Biologend | 840801 | 1:500 |
Aqua Polymount | Poly-sciences | 18606-20 | |
B-27 | Gibco | 17504-044 | |
BDNF | Gibco | PHC7074 | |
Blades | Leica | 118364227 | |
Cell culture graded water | Sigma/Merck | W3500-500ML | |
Collagen from rat tail | Sigma/Merck | C7661 | |
Confocal microscope – A1 Confocal Microscope (Eclipse Ti) | Nikon | ||
D(+)-Glucose | Sigma/Merck | G7021 | |
Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 15915 | |
DMEM/F12 | Gibco | 31330 | |
DPBS | Sigma/Merck | D8537 | |
EGF | Sigma/Merck | gf144 | |
FBS | Gibco | 10270-106 | |
FGF-2 | Stemgent | 03-0002 | |
GDNF | Sigma/Merck | SRP3200 | |
Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11029 | |
Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21236 | 1:500 |
Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11011 | 1:500 |
Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21244 | 1:500 |
Graph Pad-Prism | Dotmatics | Software for Statistical Analysis | |
HBSS | Gibco | 14025-050 | 1:500 |
HEPES | Gibco | 15630-056 | |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
Insulin | Sigma/Merck | I9278 | |
Laminin | Sigma/Merck | L2020 | |
Lentiviral prep | Addgene | 17446-LV | |
L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity assay kit | Thermo Fisher Scientific | L32250 | |
McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
MEM | Gibco | 11090-081 | |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | to load cells in the needle for transplantation |
Microscope slides | VWR | 631-0909 | |
Millicell cell culture membrane | Sigma/Merck | PICM0RG50 | |
Miscroscope cover glasses | VWR | ECN 631-1572 | |
N-2 | Gibco | 17502-048 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Petri dish (35mm) | VWR | 734-2317 | |
PFA | Sigma/Merck | P6148-500G | |
Plastic pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | PV830 | Microinjector for transplantation |
Poly-L-lysine | Sigma/Merck | P4707 | |
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
Spring Scissors | World Precision Instruments | 501235 | |
Stereomicroscope for imaging and acquisition | Nikon | SMZ18 | |
Stereomicroscope for surgery | VWR | ||
Triton X-100 | Merck | T8787 | |
Tweezers-Dumont #5-inox | World Precision Instruments | 501985 | |
Vannas Scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
Vertical micropipette puller | Shutter Instrument | P-30 | |
Y-27632 | R&D Systems | 1254/50 |