JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Organotypische plakcultuur van het ruggenmerg van muizen als platform voor het valideren van celtransplantatie bij ruggenmergletsel

Published: April 12, 2024
doi:
10.3791/66704
, , ,
1Department of Biology,University of Pisa

Summary

In dit artikel bieden we een reproduceerbare methode om organotypische plakjes ruggenmerg te genereren en te onderhouden die zijn getransplanteerd met neurale stamcellen als een ex vivo-model voor het testen van cellulaire vervangingstherapieën.

Abstract

Definitieve behandelingen voor ruggenmergletsels (SCI’s) ontbreken nog steeds, vanwege de complexe pathofysiologie. Een van de meest veelbelovende regeneratieve benaderingen is gebaseerd op stamceltransplantatie om verloren weefsel te vervangen en functioneel herstel te bevorderen. Deze aanpak moet in vitro en ex vivo verder worden onderzocht op veiligheid en werkzaamheid alvorens over te gaan tot duurdere en tijdrovendere dierproeven. In dit werk tonen we de oprichting van een langetermijnplatform op basis van organotypische plakjes ruggenmerg (SC) van muizen die zijn getransplanteerd met menselijke neurale stamcellen om cellulaire vervangingstherapieën voor dwarslaesies te testen.

Standaard SC organotypische culturen worden in vitro ongeveer 2 of 3 weken bewaard. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor langdurig onderhoud (≥30 dagen) tot 90 dagen. Het medium dat wordt gebruikt voor het langdurig kweken van SC-plakjes werd ook geoptimaliseerd voor het transplanteren van neurale stamcellen in het organotypische model. Menselijke SC-afgeleide neuro-epitheliale stamcellen (h-SC-NES) die een groen fluorescerend eiwit (GFP) -reporter droegen, werden getransplanteerd in SC-plakjes van muizen. Dertig dagen na de transplantatie vertonen cellen nog steeds GFP-expressie en een lage apoptotische snelheid, wat suggereert dat de geoptimaliseerde omgeving hun overleving en integratie in het weefsel ondersteunde. Dit protocol vertegenwoordigt een robuuste referentie voor het efficiënt testen van celvervangende therapieën in het SC-weefsel. Dit platform stelt onderzoekers in staat om een ex vivo pre-screening van verschillende celtransplantatietherapieën uit te voeren, waardoor ze de meest geschikte strategie kunnen kiezen voordat ze doorgaan met in vivo experimenten.

Introduction

Traumatisch ruggenmergletsel (SCI) heeft verwoestende fysieke, psychologische en economische gevolgen voor patiënten en zorgverleners1. Er zijn veel pogingen gedaan om axonale regeneratie bij dwarslaesie te bevorderen met verschillende benaderingen 2,3,4 en enkele gunstige effecten werden aangetoond door de vorming van neuronale relais tussen proximale en distale neuronen op de plaats van de verwonding door middel van celvervangingstherapieën. De belangstelling voor celtherapieën groeit nog steeds5 aangezien getransplanteerde cellen vele rollen kunnen spelen, waaronder het bieden van trofische ondersteuning, immuunmodulatie, het regenereren van verloren neurale circuits door inductie van plasticiteit, celvervanging en axonremyelinisatie6.

Onlangs was de belangrijkste inspanning in het veld gericht op menselijke neurale stam-/voorlopercellen (NSC’s/NPC’s)7. Verschillende studies suggereren dat NSC’s/NPC’s de astrocytenrespons moduleren8, de afscheiding van proregeneratieve factoren 9,10 bevorderen en ontbrekende neuronale cellen vervangen in SCI11,12. Studies die de differentiatie van getransplanteerde cellen in functionele neuronen ondersteunen, zijn echter nog steeds slecht. Bovendien zijn de overleving en differentiatie van getransplanteerde cellen in het beschadigde ruggenmerg (SC) laag13, mogelijk omdat getransplanteerde cellen enkele weken, zelfs maanden, nodig hebben om in vivo te differentiëren. Bovendien hebben de huidige studies veel biochemische, moleculaire, cellulaire en functionele aspecten van celvervangende therapieën niet volledig opgehelderd. In deze context zijn eenvoudige, snelle en kosteneffectieve modellen nodig om de mechanismen van celimplantatie te bestuderen, het vermogen van getransplanteerde cellen om zich te vermenigvuldigen, te differentiëren in specifieke typen of subpopulaties van cellen en synapsen te vormen met residente neuronen.

Integratie van histologische studies in elektrofysiologische registratie en transcriptoom- en proteoomprofilering is noodzakelijk voor een volledig begrip van de moleculaire cascade die optreedt na celtransplantatie. Dit zal zeker het ontwerp en de validatie van nieuwe celvervangende therapieën in preklinische modellen en klinische studies versnellen. Tot op heden is het gebruik van knaagdieren, grote dieren en niet-menselijke primaten inderdaad de moeite waard geweest voor het ophelderen van veel cellulaire processen na transplantatie14. Vanwege de hoge kosten, de hoge ethische impact en de complexiteit van het organisme is het gebruik ervan echter vaak niet eenvoudig of niet geschikt om biochemische en moleculaire processen te ontrafelen. Bovendien kunnen ze veel nadelen vertonen die verband houden met biologische verschillen, zowel tussen soorten (metabolisme) als variabiliteit binnen soorten (geslacht, leeftijd).  Deze factoren, samen met externe factoren zoals stressvolle situaties, kunnen de uitkomst van een experiment en hun voorspelbaarheid in termen van therapeutische vertaling naar mensen veranderen 15,16,17.

Daarom maken veel groepen naast diermodellen ook gebruik van 2D in vitro celcultuur en ex vivo organotypische plakjes (ex vivo culturen). 2D-celcultuur is het meest gebruikte systeem voor het bestuderen van specifieke biologische processen op het niveau van een enkele cel en/of celpopulatie. Monolayer celculturen weerspiegelen echter niet de complexiteit die in een heel organisme wordt aangetroffen. Het gebrek aan weefselstructuren en fysiologische omgeving stelt de 2D-kweeksystemen niet in staat om de belangrijkste structurele, morfologische en functionele aspecten van het onderzochte weefsel volledig na te bootsen 18,19,20.Organotypische culturen kunnen een aantal van deze problemen oplossen. Organotypische modellen zijn gebaseerd op het explanten van een fragment van een weefsel of orgaan en het ex vivo bewaren ervan gedurende een beperkte periode21,22. In het bijzonder worden plakjes van het geëxplanteerde weefsel gegenereerd met een precieze dikte waardoor voedingsstoffen gemakkelijk bijna alle cellen in de plakjes kunnen bereiken. Ze kunnen worden gegenereerd vanuit verschillende regio’s van het centrale zenuwstelsel, zoals de hippocampus, hypothalamus, cerebellum, thalamus, cerebrale cortex, substantia nigra en striatum, en ruggenmerg23. Organotypische culturen behouden de weefselarchitectuur, de ruimtelijke verdeling van cellen, de cellulaire diversiteit en de omgeving (d.w.z. de samenstelling van de extracellulaire matrix) van het orgaan van oorsprong. Bovendien behouden ze de oorspronkelijke neurale activiteit, verbindingen tussen cellen, en in het bijzonder korteafstandscircuits na de explantatie.

Deze aspecten bieden enkele voordelen voor ex vivo culturen met betrekking tot zowel monolaagculturen als diermodellen. Ze behouden de belangrijkste weefselkenmerken die in vivo worden gevonden, maar met de verlaging van de kosten en de mogelijkheid om verschillende soorten moleculaire, cellulaire en functionele experimenten uit te voeren met een nauwkeurige regeling van de omgevingsparameters van de kweek 24,25,26,27,28,29. Organotypische plakjes kunnen ook worden gebruikt om modellen te ontwikkelen voor verschillende neurologische aandoeningen door te lijken op de belangrijkste histopathologische kenmerken van specifieke aandoeningen30. Bovendien maakt het behoud van de oorspronkelijke meercellige weefselomgeving ze tot geschikte platforms voor het screenen van geneesmiddelen en voor het testen van neuroprotectieve en neuroregeneratieve moleculen en materialen.

In dit werk stellen we het gebruik van SC-organotypische culturen voor als model om NSC-transplantaties te optimaliseren. Dit is niet triviaal, aangezien optimale kweekomstandigheden nodig zijn om de overleving van zowel de gastheer (SC-weefsel) als de transplantatie (NSC’s) wekenlang te garanderen. Verschillende onderzoeksgroepen geënt in organotypische culturen, van de hersenen afgeleid en van SC afgeleid, verschillende soorten cellen. De meeste werken toonden de transplantatie van mesenchymale stamcellen 31,32,33, olfactorische omhullende cellen34 of NSC’s 35,36,37,38,39,40 en evalueerden de interacties van getransplanteerde cellen met de gastheercellen, de overleving van het hele systeem en of de getransplanteerde cellen differentieerden in neuronen of neuronachtige cellen in de ex vivo weefselomgeving 32,33,41. Sommigen van hen evalueerden het regeneratieve potentieel van cellen na transplantatie, observeerden hun axonale groei in het weefsel 37,40,41, het myeliniserende vermogen van getransplanteerde voorlopers van oligodendrocyten42, de migratie van getransplanteerde cellen in het gastheerweefsel43, en of de getransplanteerde cellen factoren vrijgaven die in de richting van een proregeneratieve omgeving duwden31. Een beperking van de huidige studies is dat ze de implantatie niet voor een lange periode onderzoeken.

Gezien het feit dat NSC’s enkele weken nodig lijken te hebben om in vivo44,45 te differentiëren, richt deze studie zich op het genereren en behouden van SC-plakjes van muizen op lange termijn (≥30 dagen) tot 90 dagen. Plakjes bleken hun oorspronkelijke anatomische structuur te behouden en in de loop van de tijd een lage en stabiele apoptotische snelheid en een hoge cellevensvatbaarheid te behouden. We observeerden diffuse expressie van neuronale markers RNA-bindende fox-1 homoloog 3 (RBFOX3) en neurofilament lichte keten (NFL), waarbij de laatste in de loop van de tijd een toenemende trend van axonale ontkieming rond de plakjes vertoonde, wat getuigt van hun gezonde toestand. Bovendien hebben we met succes GFP-expressieve menselijke SC-afgeleide neuro-epitheliale stamcellen (h-SC-NES) in de SC-plakjes getransplanteerd in de eerste stadia van neuronale differentiatie. Het NSC-transplantaat werd gedurende 30 dagen na transplantatie gehandhaafd en de cellen vertoonden GFP-expressie gedurende de hele periode in de kweek. De apoptotische snelheid van cellen op de dag na transplantatie (DPT) 30 bleek ook in overeenstemming te zijn met de apoptotische snelheidswaarde die werd waargenomen bij DPT 7 in dezelfde cellen40. Cellen leken zich te enten in de weefselomgeving en overleefden tot enkele weken.

Samenvattend tonen onze gegevens aan dat het mogelijk is om SC organotypische plakjes gedurende 3 maanden in cultuur te houden zonder hun oorspronkelijke cytoarchitectuur en de weefselomgeving in gevaar te brengen. Het belangrijkste is dat ze kunnen worden gebruikt om celtherapieën te testen voordat wordt doorgegaan met een in vivo experiment, waardoor de kosten en de experimentele tijd worden verminderd. Hier illustreren we in detail alle passages om SC-organotypische plakjes van muizen te genereren en hoe deze gedurende lange perioden (≥30 dagen) kunnen worden bewaard. Bovendien leggen we uitgebreid uit hoe NPC-transplantatie in de plakjes moet worden uitgevoerd en hoe ze moeten worden onderhouden voor stroomafwaartse analyse.

Protocol

Dierproeven werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid en de lokale ethische commissie van de Universiteit van Pisa, in overeenstemming met Richtlijn 2010/63/EU (projectlicentie nr. 39E1C. N.5Q7 uitgebracht op 30/10/2021). C57BL/6J muizen werden gehouden in een gereguleerde omgeving (23 ± 1 °C, 50 ± 5% luchtvochtigheid) met een licht-donkercyclus van 12 uur met voedsel en water ad libitum. Al het werk met betrekking tot h-SC-NES-cellen werd uitgevoerd volgens de NIH-richtlijnen voor het verkrijgen en distribueren van menselijk weefsel voor biomedische onderzoeksdoeleinden en met goedkeuring door de Human Investigation Committees en Institutional Ethics Committees van elk instituut waarvan monsters werden verkregen. De definitieve goedkeuring werd verkregen van de Commissie voor Bio-ethiek van de Universiteit van Pisa (Beoordeling nr. 29/2020). Geanonimiseerde menselijke specimens werden geleverd door de Joint MRC/Wellcome Trust-subsidie (099175/Z/12/Z), Human Developmental Biology Resource (www.hdbr.org). De juiste geïnformeerde toestemming werd verkregen en alle beschikbare niet-identificerende informatie werd voor elk monster geregistreerd. Weefsel werd behandeld in overeenstemming met ethische richtlijnen en voorschriften voor het onderzoeksgebruik van menselijk hersenweefsel, uiteengezet door de NIH (http://bioethics.od.nih.gov/humantissue. html) en de WMA-verklaring van Helsinki (http://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html). 1. Bereiding van oplossingen en apparatuur voor het isoleren en kweken van het ruggenmerg (SC) Coatingoplossing voor membraaninzetstukkenBereid de coatingoplossing voor (tabel 1): een waterige oplossing met 0,1 mg ml-1 collageen, 0,01 mg ml-1 poly-L-lysine en 0,01 mg ml-1 laminine. Plaats elk membraaninzetstuk in een schaal van 35 mm of een plaat met 6 putjes. Voeg aan de bovenkant van het membraan 1 ml coatingoplossing toe: incubeer de oplossing gedurende 4 uur bij kamertemperatuur (RT); verwijder het vervolgens en laat het membraaninzetstuk een nacht drogen (AAN). Bewaar de membraaninzetstukken bij 4 °C tot gebruik.OPMERKING: Alle passages moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. De membraancoating moet voor gebruik maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard om eiwitafbraak en suboptimale plakhechting aan het membraan te voorkomen. Mediavoorbereiding: organotypisch medium, dissectiemedium, transplantaatmediumBereid organotypisch medium voor (OM, tabel 1). Bereid het dissectiemedium voor zoals beschreven in tabel 1. Bereid het transplantaatmedium voor (GM, geoptimaliseerd op basis van Onorati et al.46, tabel 1).OPMERKING: Oplossingen moeten worden bereid in steriele omstandigheden en vlak voor gebruik (1 dag voor of dezelfde dag van het experiment). Materiaalvoorbereiding voor een operatieBewaar in de bioveiligheidskast het volgende bij de hand: de dissectie-stereomicroscoop en de chirurgische instrumenten: twee paar microscharen, twee paar rechte pincetten en twee paar gebogen pincetten. Bereid in de bioveiligheidskast het hakselinstrument voor door het uit te rusten met een mes om de SC in plakjes te snijden. Draai aan een schroef van de hakmolen om de metalen arm op te tillen waar het mes moet worden geplaatst. Plaats het mes op de daarvoor bestemde plaats, laat de metalen arm met het mes zakken totdat deze contact maakt met het snijdek en bevestig het door de borgschroef vast te draaien met een inbussleutel totdat het mes stevig vastzit. Draai de micrometrische schroef tot de gewenste plakdikte (meestal 350 μm). Controleer of het mes precies loodrecht op het maaidek is geplaatst.NOTITIE: Een precies loodrechte plaatsing van het mes ten opzichte van het maaidek is noodzakelijk om het snijden correct uit te voeren. Bereid in de bioveiligheidskast voor: twee plastic pasteurpipetten (nodig om geïsoleerde SC en de plakjes te verplaatsen), ten minste vier schalen van 35 mm en twee schalen van 60 mm en een doos vers ijs. Steriliseer alle instrumenten met 70% ethanol en UV (één cyclus van 20 minuten) vlak voor gebruik om de steriliteit van de cultuur te behouden. 2. Isolatie van muis SC en slice generatie Isolatie van muis SCOffer postnatale dag 3 (P3) muizenpups op volgens de projectlicentie. Door middel van een laparotomie op de middellijn met de microschaar, isoleert u het lumbale gebied van de ruggengraat van de rest van het muislichaam en plaatst u het in een koud dissectiemedium in een schaal van 35 mm. Knip met behulp van een dissectie-stereomicroscoop en de microschaar de ruggengraat langs de sagittale as en gebruik een recht pincet om de SC voorzichtig uit de ruggengraatholte te verwijderen. Verwijder voorzichtig de hersenvliezen van het geïsoleerde lumbale gebied van de SC met een recht pincet. Breng het geïsoleerde SC-lumbale gebied over en incubeer het gedurende 10-15 minuten in koud en vers dissectiemedium voordat u doorgaat met de volgende stap. Genereren van plakjesNeem met behulp van een plastic pasteurpipet het geïsoleerde SC-lumbale gebied uit het dissectiemedium en plaats dit op het snijdek van het hakselinstrument, loodrecht op het mes.OPMERKING: De juiste positionering van de SC ten opzichte van het mes (loodrecht) is essentieel om SC-plakjes correct te genereren. Verwijder het resterende dissectiemedium op het dek rond de SC met behulp van de pasteurpipet en steriel absorberend papier. Ga verder met SC geautomatiseerde secties. Zodra de plakjes zijn gegenereerd, plaatst u wat vers dissectiemedium met een pasteurpipet op het snijdek met de plakjes. Verzamel vervolgens de plakjes in een schaal van 35 mm met vers dissectiemedium en broed ze 15 minuten uit. Was tijdens de snij-incubatie het oppervlak van de membraaninzetstukken 3x met OM met behulp van een plastic pasteurpipet. Laat vervolgens 1 ml OM achter op de bodem van elk membraaninzetstuk. Controleer de plakjes onder de dissectie-stereomicroscoop. Zaai het gewenste aantal plakjes op de geconditioneerde membraaninzetstukken door ze over te brengen met een plastic pasteurpipet. Verplaats de plakjes in de gewenste richting en gewenste positie op de membraaninzetstukken met behulp van het rechte pincet. Verwijder het overtollige medium met een pasteurpipet om de plakjes beter aan het membraanoppervlak te laten hechten.NOTITIE: Het verplaatsen en oriënteren van de plakjes met het rechte pincet moet voorzichtig worden uitgevoerd om beschadiging van het weefsel of het membraaninzetstuk te voorkomen. Na 30 minuten incubatie bij 37 °C plaatst u het inzetstuk in een nieuwe petrischaal.NOTITIE: Raak de plastic ring aan, maar niet de membranen tijdens het verwisselen van het medium. Voeg 1 ml verse OM toe, aangevuld met van gliacellijn afgeleide neurotrofe factor (GDNF) 100 μg ml-1, aan de onderkant van het membraaninzetstuk. Incubeer de plakjes bij 37 °C. Verwijs naar de eerste dag in de cultuur als dag ex vivo (DEV) 0. 3. Langdurige teelt van organotypische plakjes Houd de plakjes op cultuur bij 37 °C tot de gewenste tijdstippen. Vervang het medium door vers OM bij DEV 1 zoals beschreven in de stappen 2.2.7-2.2.8. Schakel bij DEV 3 het medium over naar de GM om de juiste omgeving te creëren voor het transplanteren van stamcellen de dag erna. Vervang het medium elke 48 uur door verse GM (bijv. DEV 5, DEV 7…). Voeg elke dag verse GDNF (eindconcentratie 100 μg ml-1) toe aan het medium tot DEV 7. Voeg het na DEV 7 pas toe als het medium wordt vervangen (stap 3.3). 4. h-SC-NES celkweek OPMERKING: h-SC-NES-cellen worden in cultuur gehouden in aanwezigheid van groeifactoren (NES-medium, stap 4.1.1). Vóór de transplantatie worden de cellen gedurende 7 dagen in predifferentiatietoestand geplaatst door de groeifactoren uit het medium te verwijderen (Predifferentiatiemedium: NES-medium zonder fibroblastgroeifactor 2 (FGF-2) en epidermale groeifactor (EGF), stap 4.1.2). Vervolgens worden de cellen gedurende 2 dagen vóór transplantatie in differentiatietoestand (differentiatiemedium, stap 4.1.3) geplateerd. De differentiatie wordt ondersteund door neurotrofe supplementen (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) toe te voegen aan het Differentiation medium. Het onderhoud, de splitsing, de predifferentiatie en de differentiatie van h-SC-NES-cellen 12,46 worden hieronder in detail beschreven. Mediavoorbereiding: NES, predifferentiatie en differentiatiemediaBereid het onderhoudsmedium voor h-SC-NES-cellen voor (NES-medium, tabel 1). Bereid h-SC-NES-celpredifferentiatiemedium voor (Pre-differentiatiemedium, tabel 1). Bereid h-SC-NES celdifferentiatiemedium voor (Differentiatiemedium, Tabel 1). Voeg BDNF vers toe wanneer het medium wordt vervangen of wanneer de cellen voor het eerst in de differentiatietoestand worden geplateerd.OPMERKING: Alle media moeten onder steriele omstandigheden worden bereid en moeten worden gefilterd met filters van 0.22 μm. Coatingoplossing voor h-SC-NES-cellenOPMERKING: h-SC-NES-cellen worden onderhouden in POLFN-gecoate cultuurdragers (POLFN = Poly-L-Ornithine, Laminine, Fibronectin).Bereid de coatingoplossing voor in een buis: een Poly-L-Ornithine-oplossing met laminine (5 μg ml−1) en fibronectine (1 μg ml−1). Breng de voorbereide coatingoplossing over in de celcultuurdrager en zorg ervoor dat er voldoende wordt toegevoegd om het hele oppervlak van de celcultuurdrager te bedekken. Incubeer de coating gedurende 1 uur bij 37 °C of een nacht bij 4 °C. Verwijder de coatingoplossing van de celcultuursteunen.OPMERKING: POLFN-oplossing kan nog twee keer worden gerecycled, maar laminine en fibronectine moeten elke keer vers worden toegevoegd. Was de coating 3x met celcultuur grade steriel water. Bewaar de coatings bij 4 °C of gebruik het.OPMERKING: Coatings moeten binnen 1 week worden gebruikt. Daarna worden de coatings als verlopen beschouwd vanwege afbraakprocessen van de toegevoegde eiwitten. h-SC-NES cel onderhoudOnderhoud h-SC-NES-cellen in cultuur in NES-medium. Controleer de cellen elke dag onder de microscoop om na te gaan wanneer ze de samenvloeiing bereiken. Vervang elke 2 dagen de helft van het medium: verwijder de helft van het geconditioneerde medium en voeg het verse toe (houd rekening met een verdampingssnelheid van 20%). Als de cellen de samenvloeiing bereiken, gaat u verder met de splitsing, zoals beschreven in stap 4.4. h-SC-NES cel passageOPMERKING: Cellen worden als volgt gesplitst12:Verwijder het geconditioneerde medium en was de cellen eenmaal met Dulbecco’s fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) zonder Ca2+/Mg2+. Verwijder de DPBS en voeg trypsine/EDTA-oplossing toe aan de cellen om enzymatische loslating uit te voeren. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 30 s tot 1 minuut. Controleer na de incubatie de cellen onder de microscoop: als ze niet zijn losgemaakt, tik dan lichtjes op de celcultuursteun om mechanische onthechting uit te voeren en incubeer ze nog 30 s bij 37 °C. Na de incubatie inactiveert u de trypsine/EDTA door 4 volumes DPBS/foetaal runderserum (FBS) (10% vol/vol) oplossing toe te voegen aan de celcultuurondersteuning met cellen en trypsine/EDTA. Pipeteer de oplossing voorzichtig op het steunoppervlak van de celcultuur op en neer om alle cellen te helpen loskomen. Vang de celsuspensie op in een buis. Centrifugeer de celsuspensie bij 200 × g gedurende 3 minuten. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet in vers NES-medium. Tel de cellen en leg ze op elke nieuwe POLFN-gecoate cultuurdrager met een dichtheid van ̴0,5-1 × 105 cellen/cm2. Voeg Y-27632 (10 μM) toe en plaats de cellen bij 37 °C. Controleer ze elke dag tot samenvloeiing en splits ze dan weer op voor onderhoud/uitbreiding of celbankieren. predifferentiatie van h-SC-NES-cellenSplits de cellen zoals beschreven in stap 4.4. Plaat de cellen op de POLFN-gecoate celcultuursteunen met een dichtheid van ̴0,5-1 × 105 cellen/cm2 in predifferentiatiemedium. Voeg Y-27632 (10 μM) toe na de splitsing. Noem de eerste dag in predifferentiatiedag in vitro (DIV) 0. Vervang elke 2-3 dagen de helft van het medium (zie stap 4.3.2). Houd de cellen in predifferentiatietoestand tot DIV 7 en ga dan verder met stap 4.6. h-SC-NES cel differentiatieBij DIV 7 van predifferentiatie splitst u de cellen zoals beschreven in stap 4.4. Plaat de cellen op POLFN-gecoate celcultuursteunen met een dichtheid van ̴1-1,5 × 105cellen/cm2in differentiatiemedium. Voeg Y-27632 (10 μM) en BDNF (30 ng ml−1) toe na de splitsing. Na 2 dagen differentiatie (DIV 10) splitst u de cellen voor de transplantatie in plakjes. 5. h-SC-NES-celtransductie met GFP-dragende lentivirale vectoren OPMERKING: Celtransductie wordt uitgevoerd tijdens de onderhoudsfase van h-SC-NES-cellen. Wanneer cellen op de juiste manier worden getransduceerd, kunnen deze worden uitgebreid en worden eerder beschreven predifferentiatie- en differentiatieprotocollen toegepast (stappen 4.5 en 4.6). Bereiding van het celtransductiemediumOPMERKING: Celtransductiemedium wordt bereid door een specifiek volume NES-medium en een nauwkeurig volume lentiviral vector stock (LVS)-preparaat te mengen volgens verschillende parameters: de gewenste MOI (multipliciteit van infectie = verhouding van het aantal virale deeltjes tot het aantal gastheercellen in een bepaald infectiemedium); het aantal vergulde cellen; de aanvankelijke concentratie van LVS-preparaat (=LVS PFU, plaquevormende eenheid); de oppervlakte van het gebruikte kweekvat.Bereken het juiste volume LVS-preparaat dat aan het NES-medium moet worden toegevoegd, volgens het gekozen MOI met behulp van vergelijkingen (1) en (2).(n cellen tot plaat/cm2) × cm2 celcultuurondersteuning × MOI = LVS PFU voor de gekozen MOI (1)LVS PFU : Tot Initial LVS Vol (μL) = LVS PFU voor MOI : LVS Vol om toe te voegen aan medium (μL)(2)OPMERKING: De LVS-PFU (initiële PFU van LVS) en het totale initiële LVS-volume worden door de fabrikant gegeven. De LVS PFU voor de gekozen MOI wordt berekend zoals beschreven in vergelijking (1). Zo kunnen we het volume LVS-preparaat verkrijgen dat moet worden toegevoegd aan het totale volume NES-medium (op basis van celcultuurondersteuning) voor de gekozen MOI, zoals beschreven in vergelijking (2).Voorbeeld: We gebruikten MOI 3, op basis van eerdere laboratoriumervaring (de MOI kon variëren afhankelijk van de gebruikte cellijn en het virale preparaat). Als het gewenste MOI 3 is, het aantal cellen dat moet worden geplateerd 0,5 × 105/cm2 is, en de cultuurondersteuning een 1 put-MW24 (2 cm2) is, ervan uitgaande dat de initiële LVS PFU/TU (plaquevormende eenheid/transducerende eenheid) 25 × 106 PFU in 1 ml is (1.000 μL = initiële LVS vol), zijn de berekeningen als volgt:Cellen geplateerd in 1 put-MW24 (2 cm2) = 0,5 × 105 cellen × 2 cm2 = 1 × 105 cellen1 × 105 cellen × 3 (MOI) = 3 × 105 PFU = LVS PFU voor MOI 325 × 106 PFU:1.000 μL = 3 × 105 PFU:x μLx μL = 12 μL = LVS-volume om aan het medium toe te voegenDus, om de cellen te transduceren met celtransductiemedium met MOI 3 in 1 put-MW24, voeg je 12 μL initiële LVS-voorbereiding toe aan het NES-medium (238 μL) bereid voor 1 putje MW24. Het uiteindelijke totale volume is 250 μL.OPMERKING: Het medium wordt meestal vers bereid op de dag van transductie onder steriele omstandigheden. h-SC-NES transductie protocolPlaat h-SC-NES-cellen bij een lage doorgang op een met POLFN gecoate plaat van 24 multiputjes (of in een andere kweekdrager) met een dichtheid van 0,5 × 105/cm2 in NES-medium. Verzamel de volgende dag het geconditioneerde NES-medium uit de putjes waar de cellen zijn geplateerd. Afhankelijk van de gekozen kweekondersteuning, voegt u aan de cellen het kleinste volume vers celtransductiemedium toe dat nodig is om het zaaioppervlak gelijkmatig te bedekken (bijv. 250 μL/putje van een plaat met 24 multiwells). Incubeer de h-SC-NES-cellen vervolgens gedurende 6 uur bij 37 °C. Voeg daarna het eerder verzamelde geconditioneerde medium toe aan de cellen (200 μl/putje van een plaat van 24 multiwells) en incubeer de cellen AAN bij 37 °C. Was de volgende dag de h-SC-NES-cellen één keer met DPBS en voer een totale mediumverandering uit (NES-medium). Controleer de volgende dagen de cellen onder een fluorescentiemicroscoop om GFP-expressie te observeren. Breid de h-SC-NES-cellen uit voor celbankieren en -transplantatie. 6. Celtransplantatie in SC-plakjes en co-culturing Bereiding van glazen micronaaldenGebruik een trekker om fijne naalden uit de capillairen van borosilicaatglas te verkrijgen. Stel de trekker als volgt in: HEAT 990, PULL 350.OPMERKING: Uit één capillair is het mogelijk om twee fijne naalden te verkrijgen. Celvoorbereiding voor transplantatieSplits de cellen zoals beschreven in stap 4.4.OPMERKING: Als de cellen geen fluorescerende reporter tot expressie brengen, label ze dan met een celvolgkleurstof om ze te controleren met een fluorescentiemicroscoop na transplantatie en tijdens langdurige kweek. Volg het protocol van de gekozen fabrikant voor de etiketteringsstap. Tel de cellen na de splitsing en centrifugeer bij 200 × g gedurende 3 minuten. Suspendeer de verkregen pellet met vers medium + Y-27632 (10 μM) om de gewenste celconcentratie te hebben (meestal een bereik tussen 30.000-50.000 cellen μL-1). Breng de celsuspensie over in een buisje van 500 μl of 1,5 ml en plaats het op ijs. Cellen zijn klaar voor transplantatie. Celtransplantatie in organotypische plakjesOPMERKING: Voer h-SC-NES-celtransplantaties uit in de SC-organotypische plakjes van de muis met behulp van een luchtmicroinjector en glazen micronaalden.Laad een glazen micronaald met 4 μL celsuspensie met behulp van een micropipet en micro-loader tips.OPMERKING: Vermijd de vorming van luchtbellen in de naald, omdat dit het micro-injectieproces kan belemmeren. Als er belletjes ontstaan, verwijder deze dan met de micropipet. Plaats de naald in de daarvoor bestemde steun van de microinjector en breek de naaldpunt met behulp van het rechte pincet.NOTITIE: Breek de glazen naald dichter bij de punt om de vorming van grote gaten te voorkomen. Voordat u in de plakjes transplanteert, stelt u de micro-injectieparameters in. Stel de druk in op 10 psi.OPMERKING: De drukwaarde kan worden gewijzigd op basis van de microinjector en de observaties van de operator: de druk moet voldoende zijn om de celsuspensie te micro-injecteren, waardoor weefselbeschadiging wordt voorkomen. Doe op een gekalibreerd glasplaatje een druppel minerale olie met een Pasteur-pipet en injecteer de celsuspensie in de druppel. De diameter van de verkregen bol van celsuspensie in de oliedruppel correleert met een specifiek micro-injectievolume. Wijzig de micro-injectieparameters indien nodig om een diameter van de celsuspensiebol van 0,2 mm te bereiken voor het injecteren van 4nL. Nadat u het juiste volume hebt ingesteld, injecteert u de celsuspensie snel in de plakjes. Controleer onder de fluorescentie-stereomicroscoop op de aanwezigheid van de cellen in de plakjes om te controleren of de micro-injectie/transplantatie is geslaagd.OPMERKING: De celsuspensie kan soms de naald blokkeren: probeer in dit geval de verstopping van de celsuspensie te verwijderen door de injectieparameters te wijzigen of laad een nieuwe naald met verse celsuspensie. Leg de plakjes na de transplantatie op 37 °C en 5% CO2tot het gewenste tijdstip en voer om de dag een mediumwissel uit zoals beschreven in de stappen 2.2.7-2.2.8. 7. Immunofluorescentie kleuring Dag 1Verwijder het medium van de onderkant van het insteekmembraan en was de plakjes 3x met voorverwarmd DPBS. Fixeer de plakjes met voorverwarmde 4% formaldehyde (FA): verwijder de DPBS en voeg 1,5 ml 4% FA toe aan de onderkant van het membraaninzetstuk met de plakjes. Voeg na 15 minuten incubatie bij RT nog 1 ml 4% FA toe aan de bovenkant van het membraaninzetstuk en incubeer gedurende 15 minuten bij RT. Totale fixatietijd: 30 min bij RT Verwijder de 4% FA en was de plakjes 3 x 10 min met DPBS. Snijd het membraan van het inzetstuk in de omtrek met een chirurgisch mes, scheid het membraan met de plakjes van het plastic onderdeel van het inzetstuk en ga verder met de immunofluorescentiestappen.OPMERKING: Na deze stap drijft het membraan met de plakjes in DPBS in de schaal. Permeabiliseer met 1 ml/membraan van een oplossing met 0,7% Triton in DPBS gedurende 10 minuten bij RT. Verwijder de permeabilisatieoplossing en incubeer de monsters gedurende 4 uur bij 4 °C met 1 ml/membraan blokkeeroplossing bestaande uit 0,5% Triton, 10% FBS in DPBS. Verwijder de blokkerende oplossing en voeg aan de plakjes de primaire antilichamen toe in hun werkverdunning, bijv. anti-neurofilament (NFL) antilichaam tegen muizen, 1:500; konijn anti-NFL, 1:500; konijn anti-RBFOX3 (NeuN) antilichaam, 1:400; konijn anti-actieve caspase-3 (aCASP3), 1:400; muis anti-menselijke Nuclei, (Hu-Nu), 1:400; konijn anti-Hu-Nu, 1:400; anti-GFP bij muizen, 1:400 (zoals gerapporteerd in tabel 1) in 1 ml antilichaamoplossing bestaande uit 0,5% Triton, 1% FBS in DPBS. Incubeer AAN bij 4 °C. Dag 2Was de membranen 3 x 10 minuten met 1-2 ml DPBS. Incubeer het membraan met secundaire antilichamen (bijv. Goat anti-Mouse IgG (H+L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 488, 1:500; Geit anti-Rabbit IgG (H+L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 568, 1:500; Geit anti-muis IgG (H+L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 647, 1:500; Geiten anti-Rabbit IgG (H+L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 647, 1:500 zoals gerapporteerd in tabel 1) en Hoechst/DAPI voor kernen verdund in 1 ml/membraan van antilichaamoplossing (Triton 0,5% + FBS 1% in DPBS) gedurende 3 uur bij RT.OPMERKING: Bescherm de monsters zorgvuldig tegen het licht om verbleking van secundaire antilichamen tijdens de incubatie en in de volgende stappen te voorkomen. Verwijder de antilichaamoplossing en was gedurende 3 x 10 minuten met DPBS (1-2 ml). Vervang het DPBS door vers DPBS en bewaar bij 4 °C in lichtbeschermde omstandigheden. Monteer aan het einde van het immunofluorescentieprotocol de membranen op glasplaatjes. Doe een druppel van 200 μL montageoplossing op een glasplaatje. Breng met behulp van een recht pincet het zwevende membraan van de 35 mm schotel over op een afdekglaasje en breng het membraan vervolgens over op het glasplaatje met de montageoplossing. Doe een druppel van 100 μL montageoplossing op een nieuw dekglaasje en bedek het membraan ermee en bevestig het op het glasplaatje. Laat het een nacht drogen onder de chemische kap in lichtbeschermde omstandigheden. Bewaar de monsters bij 4 °C in het donker of voer beeldvormende analyses uit. 8. Levende/dode test Bereid de werkoplossing door 700 μL per gerecht vers medium te aliquoteren en voeg in de juiste werkverdunning de Sytox (bijv. Component B, 1:2.000) en de Calcein AM (bijv. Component A, 1:2.000) toe.OPMERKING: Aangezien de reagentia lichtgevoelig zijn, moet u de werkoplossing beschermen tegen licht. Evalueer het gemiddelde volume aan de onderkant van het membraan en voeg de Sytox en de Calcein AM toe in dezelfde werkverdunning als beschreven in stap 8.1. Voeg 2 druppels van elk 30 μl toe aan de bovenkant van elk plakje van de in stap 8.1 bereide werkoplossing.NOTITIE: Bescherm de schaal tegen licht door deze in donkere omstandigheden te plaatsen. Incubeer de plakjes gedurende 30 minuten bij RT. Snijd na de incubatie het membraan rondom uit het inzetstuk met een chirurgisch mes: daarna drijft het membraan met de plakjes in de werkoplossing. Plaats het membraan zonder de montageoplossing ondersteboven op een dekglaasje met behulp van een recht pincet en voeg 100 μL DPBS toe aan de membranen om ze gehydrateerd te houden. Maak zo snel mogelijk live-beelden met de confocale microscoop.OPMERKING: Voeg tijdens de beeldacquisitie elke 30 minuten 2 druppels DPBS van elk 40 μl toe aan de bovenkant van het membraan om te voorkomen dat het membraan uitdroogt. 9. Beeldvorming Confocale beeldvorming van vaste monstersVoor kwalitatieve analyse verkrijgt u beelden met behulp van een confocale microscoop met de volgende acquisitieparameters: stel de optie voor grote afbeeldingen in (kies: 4 x 4), gebruik 10 x objectief, geen stapels en een resolutie van 3.634 x 3.634 pixels. Voor kwantitatieve analyse (aCASP3, Calcein en Sytox voor plakjes en aCASP3 voor cellen) maakt u beelden met behulp van de confocale microscoop met de volgende acquisitieparameters: 20 x objectief, resolutie van 1.024 x 1.024 pixels met een Z-stap van 3 μm. Live beeldvorming van getransplanteerde plakjes met behulp van de stereomicroscoopOPMERKING: Leg beelden vast met de stereomicroscoop in de helderveld- en epifluorescentiemodi.Gebruik de helderveldinstelling om afbeeldingen van de plakjes te maken (1 x objectief met 3x zoom hier gebruikt).OPMERKING: Pas het licht aan afhankelijk van de gebruikte microscoop en gebruik de optische vezels indien nodig. Gebruik de fluorescentie-instelling om beelden van de getransplanteerde cellen te maken met hetzelfde objectief en dezelfde zoom die voor de plakjes zijn gebruikt (zie stap 9.2.1). Gebruik de volgende parameters voor de acquisitie: versterking 1, belichting 200-500 ms, offset -10. Live beeldvorming na Live/Dead-test met behulp van de confocale microscoopVerkrijg beelden met behulp van een confocale microscoop met de volgende acquisitieparameters: 20x objectief, resolutie 1.024 x 1.024 pixels met een Z-stap van 3 μm. 10. Beeldanalyse door ImageJ Analyse van NFL-, RBFOX3- en DAPI-gebiedenOpen de ImageJ-software (https://imagej.net/software/imagej/). Open de afbeelding van het bestand door te klikken op Bestand | openen | bestand selecteren | openen. Selecteer in het pop-upvenster de optie Stapelweergave | Hyperstack en kleurmodus | Standaard (met automatisch schalen). Selecteer in de werkbalk de optie Afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen. Kies de gewenste kanalen om te analyseren: groen kanaal voor NFL (axonale marker), rood kanaal voor RBFOX 3 (neuronale marker) en blauw kanaal voor DAPI (nucleaire kleuring). Ga voor NFL-analyse verder met de volgende stappen: selecteer in de werkbalk Afbeelding | Aanpassen | Drempel | Selecteer de parameters (donkere achtergrond, algoritme, bijv. standaard) en verplaats de cursor op de waardebalk (onder/boven) om het hele neurietgebied te bedekken en te omschrijven (neurieten worden wit gemarkeerd op een donkere achtergrond) | Reeks | Toepassen. Selecteer in de werkbalk de overtrektool Wand en gebruik deze om automatisch het witte gebied te definiëren dat door NFL wordt bedekt.  Pers Analyseren | Maatregel | Oppervlaktewaarde in μm2. Ga voor DAPI- en RBFOX3-analyse verder met de volgende stappen: selecteer in de werkbalk de optie Afbeelding | Aanpassen | Drempel | Selecteer de parameters (witte achtergrond, algoritme, bijv. standaard) en verplaats de cursor op de waardebalk (onder/over) om het hele RBFOX3- of DAPI-gebied te bedekken en te beschrijven | Reeks | Toepassen. Selecteer in de werkbalk de optie Verwerken | FFT | Bandpass-filter. Gebruik de drempelwaardebalk om het witte gebied dat wordt bestreken door RBFOX3 of DAPI aan te passen en dat overeenkomt met hun fluorescentiesignaal. Selecteer in de werkbalk de overtrektool Wand en gebruik deze om automatisch het gebied te definiëren dat wordt bestreken door RBFOX3 of DAPI.  Pers Analyseren | Maatregel | Oppervlaktewaarde in μm2. Analyse van apoptose door ImageJOpen de ImageJ-software (https://imagej.net/software/imagej/). Open de afbeelding van het Z-stack-bestand door te klikken op Bestand | openen | bestand selecteren | openen. Selecteer in het pop-upvenster de optie Stapelweergave | Hyperstack en kleurmodus | Standaard (met automatisch schalen). Selecteer in de werkbalk de optie Afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen. Kies de gewenste kanalen: rood kanaal voor aCASP3 (apoptosemarker om te analyseren) en blauw of cyaan voor DAPI of Hu-Nu voor kernen. Leg vervolgens de kanalen over elkaar heen door in de werkbalk Afbeelding | Kleur | Kanalen samenvoegen | Composiet maken. Sleep de Z-balk onder aan de afbeelding om door de Z-stapel van de afbeelding te bladeren en stapels in het centrale gebied van de plakjes te identificeren met aCASP3-positiviteit. Selecteer in de werkbalk de optie Insteekfilters | Analyseren | Cel teller. Selecteer in het geopende pop-upvenster de optie Initialiseren om de afbeelding voor te bereiden op de telling; selecteer vervolgens een tellertype (bijv. Type 1) en hernoem het als het object dat moet worden geteld (bijv. aCASP3+- cellen). Wijzig de naam van andere typen tellers zoals hierboven beschreven om andere objecten te tellen (bijv. DAPI+ – of Hu-Nu+- cellen voor het totale aantal cellen). Selecteer in het pop-upvenster het tellertype dat overeenkomt met het object dat moet worden geteld (bijv. aCASP3+ -cellen), selecteer vervolgens het gereedschap Punt in de werkbalk en begin handmatig het aantal apoptotische cellen te tellen, positief voor aCASP3, door op elke positieve in de geopende afbeelding te klikken. Selecteer een ander type teller in het venster van de cellenteller en begin met het tellen van het totale aantal cellen (DAPI+- cellen, voor segmenten; Hu-Nu+ cellen, voor getransplanteerde cellen). Analyse van de levende/dode test door ImageJOpen de ImageJ-software (https://imagej.net/software/imagej/). Open de afbeelding van het Z-stack-bestand door te klikken op Bestand | openen | bestand selecteren | openen. Selecteer in het pop-upvenster de optie Stapelweergave | Hyperstack en kleurmodus | Standaard (met automatisch schalen). Selecteer in de werkbalken de optie Afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen. Kies de gewenste kanalen: groen kanaal voor Calcein (vitaliteitsmarker om te analyseren) en cyaan kanaal voor Sytox (dode marker). Leg vervolgens de kanalen over elkaar heen door in de werkbalk Afbeelding | Kleur | Kanalen samenvoegen | Selecteer Samenstelling maken. Sleep de Z-balk onder aan de afbeelding om door de Z-stapel van de afbeelding te bladeren en stapels in het centrale gebied van de plakjes te identificeren met Calcein- en Sysox-positiviteit. Selecteer in de werkbalk de optie Insteekfilters | Analyseren | Cel teller. Selecteer in het geopende pop-upvenster de optie Initialiseren om de afbeelding voor te bereiden op de telling; selecteer vervolgens een tellertype (bijv. Type 1) en hernoem het als het object dat moet worden geteld (bijv. Calcein+- cellen). Hernoem andere typen tellers zoals hierboven beschreven als het nodig is om een ander object te tellen (bijv. Sytox+- cellen). Selecteer in het pop-upvenster het tellertype dat overeenkomt met het te tellen object; selecteer vervolgens het gereedschap Punt in de werkbalk en begin handmatig het aantal Calcein+- cellen te tellen, door op elke positieve cel in de geopende afbeelding te klikken. Selecteer een ander type teller in het venster van de cellenteller en tel de Sytox+ cellen zoals beschreven voor Calcein. 11. Grafieken en statistische analyse Voer alle statistische analyses uit en plot grafieken met behulp van de software van uw keuze.

Representative Results

De beschreven methoden maken het mogelijk om SC-organotypische plakjes van muizen in stadium P3 vast te stellen en hun gedurende langere tijd in cultuur te houden onder gezonde omstandigheden. Bovendien laten we een protocol zien voor het transplanteren van cellen in de plakjes en voor het samen kweken ervan gedurende maximaal 30 dagen (Figuur 1). Eerst tonen we de optimalisatie van de kweekomstandigheden en een protocol dat geschikt is voor het langdurig kweken van de SC-plakjes met getransplanteerde cellen (Figuur 2A). Plakjes worden gegenereerd en onderhouden van DEV 0 tot DEV 2 in het OM, dat oorspronkelijk werd voorgesteld als een optimaal medium voor het onderhoud van SC-plakjes47. Door de aanwezigheid van serumeiwitten kan dit medium echter suboptimaal zijn om de neuronale differentiatie en rijping van de getransplanteerde neurale voorlopercellen te ondersteunen. Inderdaad, bij DEV 3 hebben we de overstap van OM naar de GM getest, een formulering met Neurobasal plus B27, die de neurale overleving ondersteunt, en zonder serum, dat de juiste neuronale differentiatie remt en in plaats daarvan een gliaal lot bevordert48,49. Figuur 2B toont de resultaten die worden bereikt door het medium bij DEV 3 om te schakelen van OM naar GM, vergeleken met de SC-plakjes die de schakelaar niet ontvingen (controleplakjes werden gekweekt in OM). We gebruikten de verdeling van het NFL-signaal in de plakjes als een marker voor neuronale integriteit (Figuur 2B,C). Plakjes bij DEV 7 waren gezond in beide kweekomstandigheden, wat de diffuse verdeling van neurofilament (NFL, in groen) erin vertoonde. Bij DEV 10 leken plakjes gekweekt in GM gezonder te zijn ten opzichte van de controleplakjes gekweekt in OM, zoals gedocumenteerd door NFL-kleuringsverdeling. We hebben ook een schatting gemaakt van het NFL+-gebied (% NFL+-gebied/DAPI+-gebied) van de plakjes die worden weergegeven in de representatieve afbeeldingen van figuur 2B. Het geschatte NFL+-gebied wordt weergegeven in de histogrammen in figuur 2C, wat bevestigt dat het NFL-signaal onder beide omstandigheden diffuus wordt verdeeld in de plakjes bij DEV 7. Bij DEV 10 neemt het geschatte gebied dat door NFL-kleuring wordt bedekt, echter af voor de OM-kweekconditie. Deze gegevens suggereren dat het overschakelen op de GM bij DEV 3 goed wordt verdragen voor langdurige teelt van SC-plakjes (DEV 10). Als volgende stap hebben we GM getest op langere tijdstippen: DEV 30, DEV 60 en DEV 90. Zoals te zien is in figuur 3A,B, werden plakjes gezond in cultuur gehouden tot DEV 90. NFL-kleuring werd op elk tijdstip op grote schaal aanwezig gevonden in de plakjes, met diffuse ontkieming rond de plakjes neurieten die uit het centrale gebied vertrokken. We hebben inderdaad het NFL+-gebied van de plakjes in figuur 3A geschat en dit is in de loop van de tijd toegenomen, zoals weergegeven in de histogrammen van figuur 3B. We zagen ook positiviteit ten opzichte van de neuronale marker RBFOX3, wat een ander bewijs levert van de neuronale differentiatie van de plakjes. Op elk tijdstip controleerden we ook het apoptosepercentage door in verschillende plakjes het aantal cellen positief voor aCASP3 te evalueren (Figuur 4A,B). De analyse werd uitgevoerd zoals beschreven in protocolparagraaf 10.2. Het apoptotische percentage (% aCASP3+-cellen/totaal aantal DAPI+-cellen) bleek op elk tijdstip zeer laag te zijn (0,85 ± 0,52%, 0,71 ± 0,27%, 0,66 ± 0,45% voor respectievelijk DEV 30, 60 en 90) zonder significante verschillen tussen de drie beschouwde tijdstippen (p-waarde > 0,05, figuur 4B). Deze gegevens suggereren dat de apoptotische snelheid geassocieerd met aCASP3 gedurende de tijd stabiel blijft en, samen met de brede verdeling van NFL in de plakjes (Figuur 4A), de overleving van de plakjes op elk tijdstip bevestigen. Ter ondersteuning van eerdere gegevens hebben we ook een levend/dood-test uitgevoerd om de levensvatbaarheid van de plakjes op de drie verschillende tijdstippen te evalueren. We gebruikten Calcein (groene kleuring) om de levensvatbare en metabolisch actieve cellen te labelen en Sytox (cyaankleuring) om celdood te beoordelen. Zoals te zien is in de histogrammen in figuur 4C, neemt het percentage metabolisch actieve cellen licht toe van DEV 30 tot DEV 90 (93,17 ± 5,21%, 96,43 ± 3,02%, 96,33 ± 3,10% voor respectievelijk DEV 30, 60 en 90), stabiliserend tussen de laatste twee tijdstippen (DEV 30 versus DEV 60 p-waarde = 0,018; DEV 30 versus DEV 90 p-waarde = 0.027; DEV 60 vs DEV 90 p-waarde = 0.99). We vonden lage niveaus van celdood die in de loop van de tijd afnamen (6,83 ± 5,21%, 3,57 ± 3,02%, 3,66 ± 3,10% voor respectievelijk DEV 30, 60 en 90) en er werd een significant verschil gevonden tussen DEV 30 en latere tijdstippen, DEV 60 en DEV 90 (DEV 30 versus DEV 60 p-waarde = 0,018; DEV 30 versus DEV 90 p-waarde = 0.027; DEV 60 vs DEV 90 p-waarde = 0.99). Deze gegevens, in combinatie met het apoptosepercentage, bevestigen de overleving van plakjes in de loop van de tijd en ondersteunen de effectiviteit van het uitgevoerde kweekprotocol op lange termijn. Toen de haalbaarheid van langdurige kweek van de SC-plakjes eenmaal was vastgesteld, daagden we het systeem uit door transplantatie van h-SC-NES-cellen in de eerste stadia van neuronale differentiatie. We hebben de h-SC-NES-cellen getest omdat ze veelbelovende resultaten hebben laten zien voor SCI-behandeling12. De transplantatieprocedure van h-SC-NES-cellen in de SC-plakjes van de muis wordt beschreven in protocolsectie 6. De SC-plakjes en getransplanteerde h-SC-NES-cellen werden bewaard tot DPT 30. Cellen werden geënt bij DIV 10 van differentiatie (neurale voorloperfase) in DEV 4 organotypische plakjes, zoals weergegeven in het protocolschema van figuur 5A. Getransplanteerde cellen werden tot 30 dagen gecontroleerd op de expressie van GFP in cultuur. Figuur 5B toont representatieve live-beelden, bij verschillende DPT’s, van een SC-plak met getransplanteerde GFP+- cellen. De stabiele expressie van GFP in de loop van de tijd (Figuur 5B en Figuur 6A) suggereert dat cellen in het SC-weefsel overleefden in de eerder geoptimaliseerde kweekomstandigheden. We controleerden ook de apoptotische snelheid van getransplanteerde cellen zoals beschreven in protocolsectie 10.2. De apoptotische snelheid (% aCASP3+- cellen/totaal aantal Hu-Nu+ -cellen) bleek zeer laag te zijn (0,44 ± 0,34%) na 30 DPT (figuur 6B). Bovendien bleek de apoptotische snelheid bij DPT 30 in lijn te zijn met die gevonden voor hetzelfde type cellen bij DPT 7, zoals eerder gerapporteerd40, wat documenteert dat de culturen in de loop van de tijd stabiliseren. Figuur 1: Workflow van het protocol. Representatief schema dat de algemene workflow van het uitgevoerde protocol weergeeft. (A) Aan de linkerkant een schema met een samenvatting van het genereren van SC-plakjes van muizen uit geïsoleerde SC van muizenpups op P3 en het langdurig kweken van SC-organotypische plakjes. (B) Aan de rechterkant, een schema dat de transplantatie samenvat van h-SC-NES-cellen die GFP tot expressie brengen in SC-organotypische plakjes van muizen. Getransplanteerde cellen worden gedurende 30 dagen na de transplantatie bewaard. Afkortingen: h-SC-NES = van het menselijk ruggenmerg afgeleide neuro-epitheliale stam; GFP = groen fluorescerend eiwit; DEV = dag ex vivo; DPT = dag na transplantatie; NFL = neurofilament lichte keten; RBFOX3= RNA-bindende fox-1 homoloog 3; aCASP3 = actieve Caspase-3; SC= ruggenmerg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Optimalisatie van de teeltomstandigheden op lange termijn. (A) Representatief schema van het protocol voor het testen van OM en GM. OM wordt gehandhaafd tot DEV 7-10 voor de controlegroep. Het medium wordt overgeschakeld naar de GM bij DEV 3 voor de behandelde plakjes; vervolgens worden ze vastgesteld op DEV 7-10 voor vergelijking met controles. (B) Representatieve beelden waarin de organotypische plakjes SC van muizen bij DEV 7 en 10 worden vergeleken die onder verschillende omstandigheden zijn gekweekt. Plakjes worden gekleurd voor de cytoskeletmarker neurofilament (NFL, groen). De brede verdeling van NFL-kleuring in plakjes gekweekt met GM suggereert een algehele overleving en differentiatie. Kernen worden tegengekleurd met DAPI. Schaalbalk = 500 μm. (C) Representatieve histogrammen van de schatting van het door NFL bestreken gebied in de segmenten weergegeven in figuur 1B. Bij DEV 10 neemt het NFL-oppervlak af in de OM-kweekconditie. Afkortingen: DEV = dag ex vivo; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylinde; NFL = neurofilament lichte keten.; OM = organotypisch medium; GM = transplantaatmedium; SC = ruggenmerg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Langdurig gekweekte SC van muizen organotypische plakjes. (A) Plakjes worden in cultuur gehouden tot DEV 90. Immunofluorescentietest onthult een brede verdeling van de cytoskeletale marker neurofilament (NFL, groen) en de nucleaire neuronale marker RBFOX3 (rood), wat getuigt van hun gezonde toestand en neuronale identiteit na langdurige kweek. Merk op dat NFL+- axonen na verloop van tijd diffuus rond de plakjes ontkiemen. Kernen worden tegengekleurd met DAPI. Schaalbalk = 500 μm. (B) Representatieve histogrammen van de schatting van het NFL+- gebied en de tijd en, RBFOX3+- gebied van de plakjes weergegeven in paneel A. Het NFL+ neurietgebied neemt in de loop van de tijd toe. Afkortingen: DEV = dag ex vivo; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylinde; NFL = neurofilament lichte keten; SC = ruggenmerg; RBFOX3= RNA-bindende fox-1 homoloog 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen in de SC-plakjes in de loop van de tijd. (A) Representatieve afbeeldingen van organotypische plakjes bij DEV 60 gekleurd voor aCASP3 (rood) en NFL (groen). Schaalbalk = 100 μm. NFL vertoont een diffuus patroon. Zeldzame cellen zijn positief voor de apoptotische marker aCASP3 (inzetstukken: 1-2-3). (B) Analyse van het apoptosepercentage in plakjes op verschillende tijdstippen. Gemiddelde ± SD, N (replicaten) = 6 plakjes, n (totaal aantal cellen) > 1.000 voor elke plak, Kruskal-Wallis-test, meervoudige vergelijking, p-waarde > 0,05. De apoptotische snelheid is stabiel in de tijd. In de inzet 1-2-3 van paneel A is het mogelijk om details van cellen die positief zijn voor aCASP3 (rode kleuring, witte pijlen) waar te nemen. Kleine rode stippen labelen celresten en pyknotische kernen. Schaalbalk = 50 μm. (C) Representatieve beelden van levende/dode test uitgevoerd op SC-plakjes bij DEV 90: metabolisch actieve cellen worden groen gelabeld met Calceïne, terwijl dode en beschadigde cellen worden gelabeld in lichtblauw (cyaan) met Sytox. De twee histogrammen tonen het % cellen dat positief is voor Calceïne (links) en Sytox (rechts) op het totale aantal cellen. Voor beide gemiddelde ± SD geldt dat N (replicaten) = 6 plakjes, n (totaal aantal cellen) > 1.000 voor elk plakje, Kruskal-Wallis-test, meervoudige vergelijking, DEV 30 versus DEV 60 p-waarde = 0,018; DEV 30 versus DEV 90 p-waarde = 0.027; DEV 60 vs DEV 90 p-waarde > 0.99. Afkortingen: DEV = dag ex vivo; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylinde; NFL = neurofilament lichte keten; SC = ruggenmerg; aCASP3 = actieve caspase-3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: h-SC-NES celtransplantatie in organotypische plakjes van muizen. (A) Representatief schema van het transplantatieprotocol. Cellen worden getransplanteerd als neurale voorlopers bij DIV 10 van differentiatie in DEV 4 organotypische plakjes. (B) Representatieve beelden van organotypische plakjes van muizen die in de loop van de tijd tot DPT 30 zijn getransplanteerd met h-SC-NES-cellen die GFP tot expressie brengen. Cellen worden getransduceerd met een lentivirale vector die het GFP-gen draagt. GFP-expressie in de loop van de tijd bevestigt hun levensvatbaarheid en aanpassing aan de slice-omgeving. Schaal balk = 500 μm. Afkortingen: DIV = eerste dag in pre-differentiatie; h-SC-NES = van het menselijk ruggenmerg afgeleide neuro-epitheliale stam; GFP = groen fluorescerend eiwit; DEV = dag ex vivo; OM = organotypisch medium; GM = transplantaatmedium; DPT = dagen na transplantatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Evaluatie van de apoptosesnelheid van getransplanteerde h-SC-NES-cellen na 30 dagen na transplantatie. (A) Representatief beeld van een organotypische plak van een muis die is getransplanteerd met h-SC-NES-cellen die GFP tot expressie brengen. Cellen worden getransduceerd met een lentivirale vector die het GFP-gen draagt om ze na transplantatie in de plakjes te controleren. GFP-expressie in de loop van de tijd bevestigt hun levensvatbaarheid en aanpassing aan de slice-omgeving. Het getoonde tijdstip is DPT 30; cellen worden gekleurd voor menselijke kernen (cyaan) en aCASP3 (rood). Schaalbalk = 150 μm. (B) Aan de linkerkant, representatief cirkeldiagram van de apoptose-analyse van cellen die in plakjes zijn getransplanteerd bij DPT 30 (N (replicaten) = 5 plakjes, n (cellen) = 5.000), en aan de rechterkant een inzet van Hu-Nu+- cellen en een detail van een cel die positief is voor aCASP3 (witte pijl). Schaal balk = 75 μm. Kleine rode stippen labelen celresten en pyknotische kernen. Afkortingen: h-SC-NES = van het menselijk ruggenmerg afgeleide neuro-epitheliale stam; GFP = groen fluorescerend eiwit; DPT = dag na transplantatie; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylinde; NFL = neurofilament lichte keten; aCASP3 = actieve caspase-3; Hu-Nu = menselijke kernen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Tabel 1: Samenstelling van de in dit protocol gebruikte oplossingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Er is nog steeds geen effectieve behandeling voor patiënten met dwarslaesie. Er zijn verschillende benaderingen getest en een van de meest veelbelovende is gebaseerd op een regeneratieve strategie: celvervanging. Momenteel vraagt de vooruitgang op het gebied van regeneratieve geneeskunde om nieuwe platforms om de werkzaamheid en veiligheid van celtransplantaties te testen, alleen of in combinatie met andere benaderingen. Hun preklinische validatie is essentieel om verdere klinische studies voort te zetten. SC organotypische culturen zijn een nuttig platform voor het bestuderen van verschillende aspecten van neurodegeneratie, neurale regeneratie en neuroontwikkeling, en voor het onderzoeken van de effectiviteit van nieuwe therapeutische benaderingen23. Met name specifieke kenmerken van de organotypische culturen, zoals het behoud van de oorspronkelijke histoarchitectuur en de samenstelling van de cel- en micro-omgeving, zijn nuttig voor het ontrafelen van de transplantatiedynamiek, zoals celimplantatie, integratie, differentiatie en rijping.

In overeenstemming met gepubliceerde protocollen kunnen SC-organotypische plakjes ongeveer 2-3 weken in cultuur worden gehouden onder gezonde omstandigheden, wat het gebruik ervan voor de langetermijnonderzoeken en functionele screening die nodig zijn voor testschema’s van celtherapie beperkt. Het onderzoeken van belangrijke processen zoals differentiatie en rijping naar het juiste lot van getransplanteerde cellen in SC-weefsel vereist monitoring op lange termijn. Deze cellulaire processen zijn van cruciaal belang tijdens gewone transplantaties in diermodellen. De beschikbaarheid van een ex vivo-systeem dat veel kenmerken nabootst die in vivo aanwezig zijn, zou nuttig zijn in de preklinische screeningfase.

Om deze reden stellen we in dit werk een optimale SC-organotypische kweekmethode op lange termijn (≥30 dagen) voor die het mogelijk maakt om levensvatbare SC-plakjes tot 90 dagen te behouden, waardoor hun gebruikelijke kweektijdsbestek wordt verdrievoudigd. Bovendien tonen we een stabiele h-SC-NES-celimplantatie in SC-plakjes en het behoud van de transplantatiecultuur tot 30 dagen. We hebben de celimplantatie in de loop van de tijd gevolgd door GFP-expressie te observeren om de celoverleving tot DPT 30 te verifiëren. Na 30 DPT evalueerden we het celapoptosepercentage. In de literatuur is de evaluatie van apoptose van getransplanteerde h-SC-NES-cellen in SC-plakjes bij 7 DPT gerapporteerd40. Hier hebben we de analyse van celapoptose bij DPT 30 uitgebreid om de apoptotische snelheid te vergelijken met het eerdere tijdstip (DPT 7). We ontdekten dat onze gegevens in overeenstemming zijn met de literatuur, wat suggereert dat getransplanteerde h-SC-NES-cellen ook op een later tijdstip overleven als ze in de kweekconditie worden gehouden die in ons werk is geoptimaliseerd. Dit verbeterde ex vivo-platform op lange termijn, alleen en in de transplantatieconfiguratie, zal onderzoekers helpen bij preklinische screening op stamceltransplantaties voor dwarslaesie. Dit zal hen in staat stellen om de beste celkandidaat te identificeren voor verdere in vivo studies die het succes van de transplantaties bevorderen. Bovendien kunnen SC-organotypische plakjes na de eerste screening ook parallel aan de in vivo studies worden gebruikt om de cellulaire dynamiek en het gedrag op lange termijn die in diermodellen zijn waargenomen, te bevestigen en te bevestigen of om mechanistische studies te ondersteunen.

Ons protocol beschrijft in detail hoe dit organotypische model op lange termijn kan worden gegenereerd, maar er moeten ook enkele cruciale stappen worden besproken. Wat betreft het genereren van de SC organotypische culturen, zijn er enkele uitdagingen tijdens de operatie en de eerste stadia van de kweek. Een goed uitgevoerde chirurgische ingreep is essentieel om plakjes te genereren die de oorspronkelijke histoarchitectuur behouden. Als de SC tijdens de isolatie wordt geruïneerd, kunnen plakjes hun typische anatomische structuur verliezen en kan weefselbeschadiging een overmatige pro-inflammatoire belediging veroorzaken, wat leidt tot ongezonde omstandigheden en celdood. De meest uitdagende fase tijdens de operatie is de extractie van de SC uit de ruggengraat en de verwijdering van hersenvliezen uit de geïsoleerde SC. Het succes van deze stappen hangt af van de ervaring van de operator; Daarom is een trainingsperiode aan te raden voordat met de experimenten wordt begonnen.

Coronale doorsnede van de SC door middel van een helikopter is ook een uitdagende fase. De geïsoleerde SC moet op het maaidek worden geplaatst, precies loodrecht op het mes. De bediener moet het mes ook loodrecht op het maaidek plaatsen. Deze voorzorgsmaatregelen zijn nodig om ervoor te zorgen dat er reproduceerbare plakjes worden gegenereerd tussen dezelfde en verschillende experimenten. Een ander belangrijk punt is dat de tijd voor een operatie beperkt is: de hele procedure voor het genereren van plakjes moet ~30 minuten duren. Als de operator meer tijd besteedt aan chirurgie en snijden, zal het SC-weefsel eronder lijden en dit kan het succes van de kweek en de volgende stappen van het experiment schaden.

Zodra de plakjes op het kweekmembraan zijn geplaatst, is het belangrijk om ze op de juiste manier te voeren. GDNF is nodig om weefselherstel en overleving te ondersteunen. Snijden met een hakmolen is traumatisch voor het weefsel en om deze reden worden plakjes kort na de snede in een ijskoud dissectiemedium geplaatst om het teveel aan pro-inflammatoire en doodbevorderende moleculen te verwijderen. Vervolgens worden plakjes op de kweekmembranen (celcultuurinserts) geplaatst met vers medium dat is gemodificeerd met GDNF om een sneller herstel en plakhechting aan het membraan te bevorderen. GDNF moet de eerste week in cultuur elke dag aan het medium worden toegevoegd vanwege de korte halfwaardetijd50,51. We hebben vastgesteld dat plakjes de continue aanwezigheid van GDNF nodig hebben tijdens de eerste dagen in de kweek om weefselherstel en levensvatbaarheid te bevorderen. In ieder geval, aangezien de aanwezigheid van GDNF belangrijk is voor de gehele teeltperiode, wordt het sterk afgeraden om de GDNF-administratie op verdere tijdstippen te onderbreken.

Tijdens de eerste week in de kweek is het ook belangrijk om de plakjes macroscopisch met het oog en met de microscoop te controleren. Doorschijnend weefsel en transparantie van de randen zijn tekenen van een goede hechting van de plakjes aan het membraan en van levensvatbaar weefsel. Het necrotische weefsel zal op het eerste macroscopische zicht extreem wit lijken en de necrotische gebieden zullen er donkergrijs uitzien met de microscoop. Na enkele weken in kweek kan de morfologie van het weefsel veranderen: celbewegingen en weefseladhesie aan het membraan kunnen dit proces beïnvloeden. We zagen bijvoorbeeld het verlies van het centrale lumen in sommige plakjes gevuld met cellen en het verlies van de morfologie van de dorsale en ventrale hoorn. Dit gebeurt voornamelijk met kleinere plakjes, terwijl de meeste van hen een anatomische structuur behouden die dicht bij de originele ligt. Plakjes worden meestal gegenereerd vanuit de lumbale of thoracale regio’s, omdat ze op deze manier de juiste grootte kunnen hebben om hun oorspronkelijke histoarchitectuur in de loop van de tijd te behouden: als ze te klein zijn, verliezen ze hun architectuur, terwijl, als ze te groot zijn, het centrale gebied necrose kan ondergaan. Daarom hebben we het lumbale gebied van muizenpups gebruikt om plakjes te genereren met de juiste grootte voor een optimale kweek op lange termijn, maar in principe kunnen ook andere segmenten worden overwogen. Bovendien hebben we ervoor gekozen om de lumbale regio te gebruiken, omdat ventrale en dorsale regio’s beter van elkaar te onderscheiden zijn. Bovendien presenteert dit gebied weefselgebieden met een hoger percentage motorneuronen en grijze stof, die van belang zijn voor celvervangende therapieën bij dwarslaesie. Wat betreft het transplanteren van cellen in de plakjes, houdt het belangrijkste probleem verband met het breken van de glazen micronaaldpunt. Als het gat voor de doorgang van cellen te groot is, kan dit tijdens de micro-injectie schade aan SC-weefsel veroorzaken. Als het te klein is, kan celstapeling de naald belemmeren, waardoor het transplantatieproces wordt belemmerd. De transplantatieprocedure moet binnen 1 uur worden voltooid om cellijden en -dood tot een minimum te beperken.

Het voorgestelde protocol biedt een optimaal en veelzijdig hulpmiddel voor verschillende soorten onderzoeken. Hier passen we ons langetermijnplatform toe om de transplantatie van h-SC-NES-cellen in de eerste stadia van differentiatie in SC-weefsel van muizen gedurende 30 dagen te valideren. De belangrijkste nieuwigheid van de voorgestelde aanpak is de optimalisatie van het co-cultuurprotocol. De componenten van GM ondersteunen de neuronale overleving op lange termijn van de SC-plakjes en de getransplanteerde h-SC-NES-cellen. Inderdaad, GM, als een serumvrij medium, ondersteunt de differentiatie van de getransplanteerde cellen naar het neuronale lot ten opzichte van het medium dat eerder werd gebruikt voor organotypische plakcultuur47.

Wat betreft de voorgestelde modellen voor dwarslaesie, worden experimenten meestal uitgevoerd op volwassen muizen. Tot nu toe zijn de belangrijkste verschillen tussen neonatale en volwassen SC gerelateerd aan het hogere regeneratieve potentieel dat wordt gevonden bij neonatale muizen met betrekking tot de volwassen muizen52. Dergelijke verschillen hebben echter geen invloed op het type protocol dat we voorstellen, aangezien we ons hier concentreren op de reactie van getransplanteerde cellen op de omgeving van het hostende weefsel in plaats van op het regeneratievermogen van de residente neuronen. Een ander verschil tussen neonatale en volwassen muizen na een dwarslaesie houdt verband met de vorming van het glialitteken dat optreedt bij volwassenen. Met dit aspect wordt geen rekening gehouden in het voorgestelde model, dat geen rekening houdt met de complexe fysiopathologische processen die het gevolg zijn van primaire en secundaire verwondingen.

Wat de toepassingen betreft, zou het platform ook kunnen worden gebruikt om de integratie te onderzoeken tussen de getransplanteerde cellen en residente circuits die aanwezig zijn in het SC-organotypische model. Genetische manipulatie-instrumenten werden al gebruikt in het CZS om synaptische connectiviteit te evalueren en zouden in dit opzicht kunnen worden geëxploiteerd 53,54,55. In het bijzonder kan de integratie worden onderzocht en gevalideerd door de vorming van synapsen tussen de getransplanteerde cellen en het SC ex vivo weefsel te beoordelen. Deze organotypische culturen op lange termijn kunnen ook worden gebruikt voor het testen van neuroprotectieve en neuroregeneratieve middelen of nieuwe moleculen/materialen of voor het bestuderen van neurodegeneratieve aandoeningen waarbij de SC betrokken is. Om specifieke neurodegeneratieve aandoeningen te bestuderen, moet het protocol worden aangepast voor het kweken van SC-plakjes die zijn gegenereerd uit relevante modellen, zoals transgene muizen met specifieke pathologie-geassocieerde mutaties, in het relevante stadium voor de pathologie (d.w.z. neonataal, juveniel, volwassen). Concluderend kunnen we stellen dat ons protocol en organotypische culturen in het algemeen, als explantaten van een specifiek orgaan, kenmerken vertonen die de kloof overbruggen tussen 2D-celculturen en in vivo modellen, en bevestigen dat ze van onschatbare waarde zijn voor zowel fundamenteel onderzoek als preklinische tests.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De studie werd ondersteund door de Wings for Life Foundation (WFL-IT- 20/21), het European Union Next-Generation EU-National Recovery and Resilience Plan (NRRP)-missie 4 component 2, investering n. 1.4-CUP N. B83C22003930001 (Tuscany Health Ecosystem-THE, Spoke 8) en de Marina Romoli Onlus. Dit manuscript geeft alleen de standpunten en meningen van de auteurs weer, noch de Europese Unie, noch de Europese Commissie kunnen hiervoor verantwoordelijk worden geacht. Gegevens en metadata zijn beschikbaar op Zenodo 10.5281/zenodo.10433147. Afbeeldingen zijn gegenereerd met Biorender https://www.biorender.com/.

Materials

anti-cleaved Caspase-3,  (Asp175) (5A1E) (Rabbit) Cell Signaling Technology 9661S 1:400
anti-GFP (Mouse) – monoclonal Sigma/Merck G6539 1:400
anti-Human Nuclei (Mouse) – monoclonal, clone 235-1  Sigma/Merck MAB1281 1:400
anti-Human Nuclei (Rabbit) NeoBiotechnologies RBM5-346-P1 1:400
anti-NeuN (RBFOX3) (Rabbit) – polyclonal Sigma/Merck ABN78 1:400
anti-NFL (Mouse) Sigma/Merck MAB1615 1:400
anti-NFL H-Phospho (Rabbit) -polyclonal Biologend 840801 1:500
Aqua Polymount Poly-sciences 18606-20
B-27 Gibco 17504-044
BDNF Gibco PHC7074
Blades Leica 118364227
Cell culture graded water Sigma/Merck W3500-500ML
Collagen from rat tail Sigma/Merck C7661
Confocal microscope – A1 Confocal Microscope (Eclipse Ti) Nikon 
D(+)-Glucose Sigma/Merck G7021
Dissecting Forceps World Precision Instruments 15915
DMEM/F12 Gibco 31330
DPBS Sigma/Merck D8537
EGF Sigma/Merck gf144
FBS Gibco 10270-106
FGF-2 Stemgent 03-0002
GDNF Sigma/Merck SRP3200
Glass capillaries, 3.5"  Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X
Glutamax Gibco 35050-038
Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11029
Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A21236 1:500
Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A11011 1:500
Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A21244 1:500
Graph Pad-Prism Dotmatics Software for Statistical Analysis
HBSS Gibco 14025-050 1:500
HEPES Gibco 15630-056
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Horse Serum Gibco 16050-122
Insulin Sigma/Merck I9278
Laminin Sigma/Merck L2020
Lentiviral prep Addgene 17446-LV
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030024
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity assay kit Thermo Fisher Scientific L32250
McIlwain Tissue Chopper World Precision Instruments
MEM Gibco 11090-081
Microloader tips Eppendorf 5242956003 to load cells in the needle for transplantation
Microscope slides VWR 631-0909
Millicell cell culture membrane Sigma/Merck PICM0RG50
Miscroscope cover glasses VWR  ECN 631-1572
N-2 Gibco 17502-048
Neurobasal Gibco 21103-049
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri dish (35mm) VWR 734-2317
PFA Sigma/Merck P6148-500G
Plastic pasteur pipette Sarstedt 86.1171.010
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments PV830 Microinjector for transplantation
Poly-L-lysine Sigma/Merck P4707
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel VWR International SWAN3001
Scalpel handle #3 World Precision Instruments 500236
Spring Scissors World Precision Instruments 501235
Stereomicroscope for imaging and acquisition Nikon  SMZ18
Stereomicroscope for surgery VWR
Triton X-100 Merck T8787
Tweezers-Dumont #5-inox World Precision Instruments 501985
Vannas Scissors, 8.5 cm World Precision Instruments 500086
Vertical micropipette puller Shutter Instrument P-30
Y-27632 R&D Systems 1254/50
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ding, W., et al. Spinal cord injury: The global incidence, prevalence, and disability from the Global Burden of Disease Study 2019. Spine. 47 (21), 1532-1540 (2022).
  2. Yang, B., et al. Strategies and prospects of effective neural circuits reconstruction after spinal cord injury. Cell Death Dis. 11 (6), 439 (2020).
  3. Liu, K., et al. PTEN deletion enhances the regenerative ability of adult corticospinal neurons. Nat Neurosci. 13 (9), 1075-1081 (2010).
  4. Anderson, M. A., et al. Required growth facilitators propel axon regeneration across complete spinal cord injury. Nature. 561 (7723), 396-400 (2018).
  5. de Freria, C. M., Van Niekerk, E., Blesch, A., Lu, P. Neural stem cells: promoting axonal regeneration and spinal cord connectivity. Cells. 10 (12), 3296 (2021).
  6. Badner, A., Siddiqui, A. M., Fehlings, M. G. Spinal cord injuries: how could cell therapy help. Expert Opin Biol Ther. 17 (5), 529-541 (2017).
  7. Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nat Neurosci. 20 (5), 637-647 (2017).
  8. Ishii, K., et al. Neutralization of ciliary neurotrophic factor reduces astrocyte production from transplanted neural stem cells and promotes regeneration of corticospinal tract fibers in spinal cord injury. J Neurosci Res. 84 (8), 1669-1681 (2006).
  9. Zhang, Y. W., Denham, J., Thies, R. S. Oligodendrocyte progenitor cells derived from human embryonic stem cells express neurotrophic factors. Stem Cells Dev. 15 (6), 943-952 (2006).
  10. Faulkner, J., Keirstead, H. S. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors for the treatment of spinal cord injury. Transpl Immunol. 15 (2), 131-142 (2005).
  11. Kadoya, K., et al. Spinal cord reconstitution with homologous neural grafts enables robust corticospinal regeneration. Nat Med. 22 (5), 479-487 (2016).
  12. Dell’ Anno, M. T., et al. Human neuroepithelial stem cell regional specificity enables spinal cord repair through a relay circuit. Nat Commun. 9 (1), 3419 (2018).
  13. Wu, S., FitzGerald, K. T., Giordano, J. On the viability and potential value of stem cells for repair and treatment of central neurotrauma: overview and speculations. Front Neurol. 9, 602 (2018).
  14. Nardone, R., et al. Rodent, large animal and non-human primate models of spinal cord injury. Zoology. 123, 101-114 (2017).
  15. Hartung, T. Thoughts on limitations of animal models. Parkinsonism Relat Disord. 14, (2008).
  16. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philosophy, Ethics, and Humanities in Medicine. 4 (1), 2 (2009).
  17. Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. Animal models of neurodegenerative diseases. Nat Neurosci. 21 (10), 1370-1379 (2018).
  18. Hayden, P. J., Harbell, J. W. Special review series on 3D organotypic culture models: Introduction and historical perspective. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 57 (2), 95 (2021).
  19. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33 (2020).
  20. Mirbagheri, M., et al. Advanced cell culture platforms: a growing quest for emulating natural tissues. Materials Horizons. 6 (1), 45-71 (2019).
  21. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  22. Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  23. Pandamooz, S., Nabiuni, M., Miyan, J., Ahmadiani, A., Dargahi, L. Organotypic spinal cord culture: a proper platform for the functional screening. Mol Neurobiol. 53 (7), 4659-4674 (2016).
  24. Fuller, L., Dailey, M. E. Preparation of rodent hippocampal slice cultures. CSH Protoc. 2007, (2007).
  25. Gertz, C. C., Lui, J. H., LaMonica, B. E., Wang, X., Kriegstein, A. R. Diverse behaviors of outer radial glia in developing ferret and human cortex. J Neurosci. 34 (7), 2559-2570 (2014).
  26. Ballerini, L., Galante, M. Network bursting by organotypic spinal slice cultures in the presence of bicuculline and/or strychnine is developmentally regulated. Eur J Neurosci. 10 (9), 2871-2879 (1998).
  27. Avossa, D., Rosato-Siri, M. D., Mazzarol, F., Ballerini, L. Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord. Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).
  28. Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3RS philosophy. Front Vet Sci. 5, 164 (2018).
  29. Nogueira, G. O., Garcez, P. P., Bardy, C., Cunningham, M. O., Sebollela, A. Modeling the human brain with ex vivo slices and in vitro organoids for translational neuroscience. Front Neurosci. 16, 838594 (2022).
  30. Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: a useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neurosci Bull. 35 (2), 244 (2019).
  31. Park, H. W., et al. Human mesenchymal stem cell-derived Schwann cell-like cells exhibit neurotrophic effects, via distinct growth factor production, in a model of spinal cord injury. Glia. 58 (9), 1118-1132 (2010).
  32. Charrière, K., Risold, P. Y., Fellmann, D. In vitro interactions between bone marrow stromal cells and hippocampal slice cultures. C R Biol. 333 (8), 582-590 (2010).
  33. Jeong, D. K., Taghavi, C. E., Song, K. J., Lee, K. B., Kang, H. W. Organotypic human spinal cord slice culture as an alternative to direct transplantation of human bone marrow precursor cells for treating spinal cord injury. World Neurosurg. 75 (3-4), 533-539 (2011).
  34. Riggio, C., et al. Generation of magnetized olfactory ensheathing cells for regenerative studies in the central and peripheral nervous tissue. Int J Mol Sci. 14 (6), 10852-10868 (2013).
  35. Kamei, N., et al. Neural progenitor cells promote corticospinal axon growth in organotypic co-cultures. Neuroreport. 15 (17), 2579-2583 (2004).
  36. Kamei, N., et al. NGF released from transplanted neural progenitor cells promote corticospinal axon growth in organotypic cocultures. Spine. 32 (12), 1272-1278 (2007).
  37. Hamasaki, T., et al. Magnetically labeled neural progenitor cells, which are localized by magnetic force, promote axon growth in organotypic cocultures. Spine. 32 (21), 2300-2305 (2007).
  38. Kim, H. M., Lee, H. J., Lee, M. Y., Kim, S. U., Kim, B. G. Organotypic spinal cord slice culture to study neural stem/progenitor cell microenvironment in the injured spinal cord. Exp Neurobiol. 19 (2), 106-113 (2010).
  39. Liu, X., Chu, T. H., Su, H., Guo, A., Wu, W. Neural progenitor cell apoptosis and differentiation were affected by activated microglia in spinal cord slice culture. Neurol Sci. 35 (3), 415-419 (2014).
  40. De Vincentiis, S., et al. Low forces push the maturation of neural precursors into neurons. Small. 19 (30), 2205871 (2023).
  41. Abouelfetouh, A., Kondoh, T., Ehara, K., Kohmura, E. Morphological differentiation of bone marrow stromal cells into neuron-like cells after co-culture with hippocampal slice. Brain Res. 1029 (1), 114-119 (2004).
  42. Sypecka, J., Koniusz, S., Kawalec, M., Sarnowska, A. The organotypic longitudinal spinal cord slice culture for stem cell study. Stem Cells Int. 2015, 471216 (2015).
  43. Tanvig, M., et al. A brain slice culture model for studies of endogenous and exogenous precursor cell migration in the rostral migratory stream. Brain Res. 1295, 1-12 (2009).
  44. Tennstaedt, A., et al. Human neural stem cell intracerebral grafts show spontaneous early neuronal differentiation after several weeks. Biomaterials. 44, 143-154 (2015).
  45. Vogel, S., et al. The in vivo timeline of differentiation of engrafted human neural progenitor cells. Stem Cell Res. 37, 101429 (2019).
  46. Onorati, M., et al. Zika virus disrupts phospho-TBK1 localization and mitosis in human neuroepithelial stem cells and radial glia. Cell Rep. 16 (10), 2576-2592 (2016).
  47. Vyas, A., et al. An in vitro model of adult mammalian nerve repair. Exp Neurol. 223 (1), 112-118 (2010).
  48. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
  49. De Vries, G. H., Boullerne, A. I. Glial cell lines: an overview. Neurochem Res. 35 (12), 1978-2000 (2010).
  50. Ziv-Polat, O., et al. The role of neurotrophic factors conjugated to iron oxide nanoparticles in peripheral nerve regeneration: in vitro studies. Biomed Res Int. 2014, 267808 (2014).
  51. Mesa-Infante, V., Afonso-Oramas, D., Salas-Hernández, J., Rodríguez-Núñez, J., Barroso-Chinea, P. Long-term exposure to GDNF induces dephosphorylation of Ret, AKT, and ERK1/2, and is ineffective at protecting midbrain dopaminergic neurons in cellular models of Parkinson’s disease. Mol Cell Neurosci. 118, 103684 (2022).
  52. Montero, A. M., Huang, A. H. The regenerative capacity of neonatal tissues. Development. 149 (12), (2022).
  53. Feng, L., Kwon, O., Lee, B., Oh, W. C., Kim, J. Using mammalian GFP reconstitution across synaptic partners (mGRASP) to map synaptic connectivity in the mouse brain. Nat Protoc. 9 (10), 2425-2437 (2014).
  54. Il Choi, D., Kaang, B. -. K. Interrogating structural plasticity among synaptic engrams. Curr Opin Neurobiol. 75, 102552 (2022).
  55. Choi, J. -. H., et al. Interregional synaptic maps among engram cells underlie memory formation. Science. 360 (6387), 430-435 (2018).

Tags

Spinal Cord InjuryOrganotypic Slice CultureStem Cell TransplantationNeural Stem CellsLong-term CultureNeuroepithelial Stem CellsPre-screening Platform

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Merighi, F., De Vincentiis, S., Onorati, M., Raffa, V. Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (206), e66704, doi:10.3791/66704 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image