In dieser Arbeit stellen wir eine reproduzierbare Methode zur Generierung und Erhaltung von organotypischen Schnitten des Rückenmarks vor, die mit neuralen Stammzellen transplantiert wurden, als ex vivo-Modell für die Erprobung von zellulären Ersatztherapien.
Lösende Heilmittel für Rückenmarksverletzungen (SCI) fehlen aufgrund der komplexen Pathophysiologie immer noch. Einer der vielversprechendsten regenerativen Ansätze basiert auf der Stammzelltransplantation, um verlorenes Gewebe zu ersetzen und die funktionelle Wiederherstellung zu fördern. Dieser Ansatz sollte im Hinblick auf Sicherheit und Wirksamkeit in vitro und ex vivo weiter untersucht werden, bevor mit teureren und zeitaufwändigeren Tierversuchen fortgefahren wird. In dieser Arbeit zeigen wir die Etablierung einer Langzeitplattform auf der Grundlage von organotypischen Schnitten des Rückenmarks der Maus, die mit humanen neuralen Stammzellen transplantiert wurden, um zelluläre Ersatztherapien für Querschnittlähmungen zu testen.
Organotypische Standardkulturen des SC werden in vitro etwa 2 bis 3 Wochen lang aufbewahrt. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Langzeitwartung (≥30 Tage) für bis zu 90 Tage. Das Medium, das für die Langzeitkultivierung von SC-Schnitten verwendet wird, wurde auch für die Transplantation von neuralen Stammzellen in das organotypische Modell optimiert. Humane SC-abgeleitete neuroepitheliale Stammzellen (h-SC-NES), die einen grün fluoreszierenden Protein-Reporter (GFP) tragen, wurden in SC-Schnitte von Mäusen transplantiert. Dreißig Tage nach der Transplantation zeigen die Zellen immer noch eine GFP-Expression und eine niedrige apoptotische Rate, was darauf hindeutet, dass die optimierte Umgebung ihr Überleben und ihre Integration in das Gewebe aufrechterhielt. Dieses Protokoll stellt eine robuste Referenz für die effiziente Erprobung von Zellersatztherapien im SC-Gewebe dar. Diese Plattform wird es Forschern ermöglichen, ein Ex-vivo-Vorscreening verschiedener Zelltransplantationstherapien durchzuführen und ihnen dabei zu helfen, die am besten geeignete Strategie zu wählen, bevor sie mit In-vivo-Experimenten fortfahren.
Eine traumatische Rückenmarksverletzung (SCI) hat verheerende physische, psychische und wirtschaftliche Folgen für Patienten und Betreuer1. Es wurden viele Versuche unternommen, die axonale Regeneration bei Querschnittlähmung mit unterschiedlichen Ansätzen zu fördern 2,3,4 und einige vorteilhafte Effekte wurden durch die Bildung von neuronalen Relais zwischen proximalen und distalen Neuronen in der Verletzungsstelle durch Zellersatztherapien gezeigt. Das Interesse an Zelltherapien wächst weiter5, da transplantierte Zellen viele Rollen spielen können, darunter trophische Unterstützung, Immunmodulation, Regeneration verlorener neuronaler Schaltkreise durch Induktion von Plastizität, Zellersatz und Axonremyelinisierung6.
In jüngster Zeit konzentrierten sich die Hauptbemühungen auf menschliche neurale Stamm-/Vorläuferzellen (NSCs/NPCs)7. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass NSCs/NPCs die Astrozytenantwort modulieren8, die Sekretion von proregenerativen Faktorenfördern 9,10 und fehlende neuronale Zellen bei Querschnittlähmung ersetzen11,12. Studien, die die Differenzierung von transplantierten Zellen in funktionsfähige Neuronen unterstützen, sind jedoch noch dürftig. Darüber hinaus sind das Überleben und die Differenzierung transplantierter Zellen im verletzten Rückenmark (SC) gering13, möglicherweise weil transplantierte Zellen mehrere Wochen oder sogar Monate benötigen, um sich in vivo zu differenzieren. Darüber hinaus haben aktuelle Studien viele biochemische, molekulare, zelluläre und funktionelle Aspekte von Zellersatztherapien nicht vollständig aufgeklärt. In diesem Zusammenhang sind einfache, schnelle und kostengünstige Modelle erforderlich, um die Mechanismen der Zelltransplantation zu untersuchen, die Fähigkeit transplantierter Zellen, sich zu vermehren, sich in bestimmte Zelltypen oder Subpopulationen zu differenzieren und Synapsen mit ansässigen Neuronen zu bilden.
Die Integration histologischer Untersuchungen in die elektrophysiologische Aufzeichnung und das Transkriptom- und Proteom-Profiling ist notwendig, um die molekulare Kaskade, die nach einer Zelltransplantation auftritt, vollständig zu verstehen. Dies wird sicherlich das Design und die Validierung neuer Zellersatztherapien in präklinischen Modellen und klinischen Studien beschleunigen. Tatsächlich hat sich der Einsatz von Nagetieren, Großtieren und nichtmenschlichen Primaten bisher gelohnt, um viele zelluläre Prozesse nach der Transplantation aufzuklären14. Aufgrund der hohen Kosten, der hohen ethischen Auswirkungen sowie der Komplexität des Organismus ist ihre Anwendung jedoch oft nicht einfach oder nicht ausreichend, um biochemische und molekulare Prozesse zu entschlüsseln. Darüber hinaus können sie viele Nachteile aufweisen, die mit biologischen Unterschieden korrelieren, sowohl zwischen den Arten (Stoffwechsel) als auch innerhalb der Arten (Geschlecht, Alter). Diese Faktoren, zusammen mit externen Faktoren wie Stresssituationen, könnten das Ergebnis eines Experiments und ihre Vorhersagbarkeit im Hinblick auf die therapeutische Umsetzung auf den Menschen verändern 15,16,17.
Daher verwenden viele Gruppen neben Tiermodellen auch 2D-in-vitro-Zellkulturen und ex vivo organotypische Schnitte (ex vivo-Kulturen). Die 2D-Zellkultur ist das am häufigsten verwendete System zur Untersuchung spezifischer biologischer Prozesse auf Einzelzell- und/oder Zellpopulationsebene. Dennoch spiegeln Monolayer-Zellkulturen nicht die Komplexität wider, die in einem ganzen Organismus zu finden ist. Das Fehlen von Gewebestrukturen und physiologischer Umgebung erlaubt es den 2D-Kultursystemen nicht, wichtige strukturelle, morphologische und funktionelle Aspekte des untersuchten Gewebes vollständig zu emulieren 18,19,20.Organotypische Kulturen können einige dieser Probleme überwinden. Organotypische Modelle basieren auf der Explantation eines Fragments eines Gewebes oder Organs und dessen Ex-vivo-Konservierung für einen begrenzten Zeitraum 21,22. Insbesondere werden Scheiben des explantierten Gewebes mit einer präzisen Dicke erzeugt, die es ermöglicht, dass die Nährstoffe fast alle Zellen in den Scheiben leicht erreichen können. Sie können aus verschiedenen Regionen des Zentralnervensystems gebildet werden, wie z. B. dem Hippocampus, dem Hypothalamus, dem Kleinhirn, dem Thalamus, der Großhirnrinde, der Substantia nigra und dem Striatum sowie dem Rückenmark23. Organotypische Kulturen bewahren die Gewebearchitektur, die räumliche Verteilung der Zellen, die zelluläre Vielfalt und die Umgebung (d.h. die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix) des Ursprungsorgans. Darüber hinaus bewahren sie die ursprüngliche neuronale Aktivität, die Verbindungen zwischen den Zellen und insbesondere die Kurzstreckenschaltkreise nach der Explantation.
Diese Aspekte bieten einige Vorteile für ex vivo-Kulturen sowohl in Bezug auf Monolayer-Kulturen als auch auf Tiermodelle. Sie behalten wichtige Gewebemerkmale bei, die in vivo gefunden werden, jedoch mit einer Reduzierung der Kosten und der Möglichkeit, verschiedene Arten von molekularen, zellulären und funktionellen Experimenten mit einer genauen Regulierung der Umweltparameter der Kultur durchzuführen 24,25,26,27,28,29. Organotypische Schnitte können auch genutzt werden, um Modelle für verschiedene neurologische Erkrankungen zu entwickeln, indem sie wichtigen histopathologischen Merkmalen bestimmter Erkrankungen ähneln30. Darüber hinaus sind sie durch die Beibehaltung der ursprünglichen multizellulären Gewebeumgebung geeignete Plattformen für das Wirkstoffscreening und für die Erprobung neuroprotektiver und neuroregenerativer Moleküle und Materialien.
In dieser Arbeit schlagen wir die Verwendung von organotypischen SC-Kulturen als Modell zur Optimierung von NSC-Transplantationen vor. Dies ist nicht trivial, da optimale Kultivierungsbedingungen erforderlich sind, um das Überleben sowohl des Wirts (SC-Gewebe) als auch des Transplantats (NSCs) über Wochen zu gewährleisten. Verschiedene Forschungsgruppen transplantierten in organotypische Kulturen, aus dem Gehirn und aus SC, verschiedene Zelltypen. Die meisten Arbeiten zeigten die Transplantation von mesenchymalen Stammzellen 31,32,33, olfaktorischen Hüllzellen34 oder NSCs 35,36,37,38,39,40 und bewerteten die Wechselwirkungen der transplantierten Zellen mit den Wirtszellen, das Überleben des gesamten Systems und ob sich die transplantierten Zellen in Neuronen oder neuronenähnliche Zellen differenzierten in der ex vivo Gewebeumgebung 32,33,41. Einige von ihnen untersuchten das regenerative Potenzial von Zellen nach der Transplantation, indem sie ihr axonales Wachstum im Gewebebeobachteten 37,40,41, die myelinisierende Fähigkeit von transplantierten Vorläufern von Oligodendrozyten42, die Migration transplantierter Zellen in das Wirtsgewebe43 und ob die transplantierten Zellen Faktoren freisetzten, die in Richtung einer proregenerativen Umgebung drängen31. Eine Einschränkung der aktuellen Studien besteht darin, dass sie die Transplantation nicht über einen längeren Zeitraum untersuchen.
In Anbetracht der Tatsache, dass NSCs anscheinend mehrere Wochen benötigen, um in vivo zu differenzieren 44,45, konzentriert sich diese Studie auf die Generierung und Aufrechterhaltung langfristiger (≥30 Tage) Maus-SC-Schnitte für bis zu 90 Tage. Es wurde festgestellt, dass die Schnitte ihre ursprüngliche anatomische Struktur beibehalten und über die Zeit eine niedrige und stabile apoptotische Rate sowie eine hohe Zellviabilität aufweisen. Wir beobachteten eine diffuse Expression der neuronalen Marker RNA-binding fox-1 homolog 3 (RBFOX3) und neurofilament light chain (NFL), wobei letztere im Laufe der Zeit einen zunehmenden Trend der axonalen Keimung um die Schnitte zeigten, was ihren gesunden Zustand bestätigt. Darüber hinaus haben wir in den ersten Stadien der neuronalen Differenzierung erfolgreich GFP-exprimierende humane SC-abgeleitete neuroepitheliale Stammzellen (h-SC-NES) in die SC-Schnitte transplantiert. Das NSC-Transplantat wurde 30 Tage nach der Transplantation aufbewahrt und die Zellen zeigten während des gesamten Kulturzeitraums eine GFP-Expression. Es wurde auch festgestellt, dass die apoptotische Rate der Zellen am Tag nach der Transplantation (DPT) 30 in Bezug auf den apoptotischen Ratenwert übereinstimmte, der bei DPT 7 in denselben Zellenbeobachtet wurde 40. Die Zellen schienen sich in die Gewebeumgebung einzunisten und überlebten bis zu mehreren Wochen.
Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass es möglich ist, organotypische Scheiben in Kultur für 3 Monate zu erhalten, ohne ihre ursprüngliche Zytoarchitektur und das Gewebemilieu zu beeinträchtigen. Am wichtigsten ist, dass sie genutzt werden können, um Zelltherapien zu testen, bevor mit einem In-vivo-Experiment fortgefahren wird, wodurch die Kosten und die Versuchszeit reduziert werden. Im Folgenden veranschaulichen wir im Detail alle Passagen zur Generierung von organotypischen Slices für Maus-SC und wie sie über einen längeren Zeitraum (≥30 Tage) aufrechterhalten werden können. Darüber hinaus erklären wir ausführlich, wie eine NPC-Transplantation in die Schichten durchgeführt und wie sie für die nachgelagerte Analyse aufbewahrt werden.
Es gibt immer noch keine wirksame Behandlung für Patienten mit Querschnittlähmung. Verschiedene Ansätze wurden getestet, und einer der vielversprechendsten basiert auf einer regenerativen Strategie – dem Zellersatz. Derzeit erfordern die Fortschritte im Bereich der regenerativen Medizin neuartige Plattformen, um die Wirksamkeit und Sicherheit von Zelltransplantaten allein oder in Kombination mit anderen Ansätzen zu testen. Ihre präklinische Validierung ist für die Durchführung weiterer klinischer Studien unerlässlich. Organotypische Kulturen des SC sind eine nützliche Plattform, um verschiedene Aspekte der Neurodegeneration, der neuronalen Regeneration und der Neuroentwicklung zu untersuchen und die Wirksamkeit neuartiger therapeutischer Ansätze zu untersuchen23. Insbesondere spezifische Merkmale der organotypischen Kulturen, wie die Beibehaltung der ursprünglichen Histoarchitektur und der Zell- und Mikroumgebungszusammensetzung, sind vorteilhaft, um die Transplantationsdynamik zu entschlüsseln, wie z. B. Zelltransplantation, Integration, Differenzierung und Reifung.
In Übereinstimmung mit den veröffentlichten Protokollen können subkutanische organotypische Schnitte unter gesunden Bedingungen etwa 2-3 Wochen lang in Kultur gehalten werden, was ihre Verwendung für Langzeituntersuchungen und funktionelles Screening einschränkt, die für Testschemata der Zelltherapie erforderlich sind. Die Erforschung wichtiger Prozesse wie Differenzierung und Reifung hin zum korrekten Verbleib transplantierter Zellen im SC-Gewebe erfordert eine Langzeitüberwachung. Diese zellulären Prozesse sind bei gängigen Transplantationen in Tiermodellen von entscheidender Bedeutung. Die Verfügbarkeit eines ex vivo-Systems , das viele in vivo vorhandene Merkmale nachahmt, wäre in der präklinischen Screening-Phase hilfreich.
Aus diesem Grund schlagen wir in dieser Arbeit eine optimale langfristige (≥30 Tage) organotypische SC-Kulturmethode vor, die es ermöglicht, lebensfähige SC-Scheiben für bis zu 90 Tage zu erhalten und damit ihren üblichen Kulturzeitraum zu verdreifachen. Darüber hinaus zeigen wir eine stabile h-SC-NES-Zelltransplantation in SC-Schnitten und die Aufrechterhaltung der Transplantatkultur für bis zu 30 Tage. Wir überwachten die Zelltransplantation im Laufe der Zeit, indem wir die GFP-Expression beobachteten, um das Überleben der Zellen bis zu DPT 30 zu verifizieren. Nach 30 DPT bewerteten wir die Apoptoserate der Zellen. In der Literatur wurde über die Bewertung der Apoptose von transplantierten h-SC-NES-Zellen in SC-Schnitten bei 7 DPT berichtet40. In dieser Arbeit haben wir die Zellapoptose-Analyse an DPT 30 erweitert, um die apoptotische Rate in Bezug auf den früheren Zeitpunkt (DPT 7) zu vergleichen. Wir fanden heraus, dass unsere Daten mit der Literatur übereinstimmen, was darauf hindeutet, dass transplantierte h-SC-NES-Zellen auch zu einem späteren Zeitpunkt überleben, wenn sie unter den in unserer Arbeit optimierten Kulturbedingungen gehalten werden. Diese verbesserte Langzeit-Ex-vivo-Plattform allein und in der Transplantationskonfiguration wird Forschern beim präklinischen Screening auf stammzellbasierte Transplantationen auf Rückenmarksverletzung helfen. Auf diese Weise können sie den besten Zellkandidaten für weitere in vivo-Studien identifizieren, die den Erfolg der Transplantationen fördern. Darüber hinaus könnten nach einem ersten Screening auch organotypische Schnitte parallel zu den In-vivo-Studien verwendet werden, um die in Tiermodellen beobachtete langfristige zelluläre Dynamik und Verhaltensweisen zu bestätigen und zu bestätigen oder um mechanistische Studien zu unterstützen.
Unser Protokoll beschreibt im Detail, wie dieses langfristige organotypische Modell generiert werden kann, aber es sollten auch einige kritische Schritte besprochen werden. Bei der Generierung der organotypischen SC-Kulturen gibt es einige Herausforderungen während der Operation und in den ersten Phasen der Kultur. Ein gut durchgeführter chirurgischer Eingriff ist unerlässlich, um Slices zu erzeugen, die die ursprüngliche Histoarchitektur beibehalten. Wenn der SC während der Isolierung ruiniert wird, können die Scheiben ihre typische anatomische Struktur verlieren und die Gewebeschädigung kann zu einer übermäßigen entzündungsfördernden Beleidigung führen, die zu ungesunden Bedingungen und zum Zelltod führt. Die schwierigste Phase während der Operation ist die Extraktion des SC aus der Wirbelsäule und die Entfernung der Hirnhäute aus dem isolierten SC. Der Erfolg dieser Schritte hängt von der Erfahrung des Bedieners ab. Daher wird eine Einarbeitungsphase empfohlen, bevor mit den Experimenten begonnen wird.
Auch die koronale Sektion des SC durch einen Hubschrauber ist eine herausfordernde Phase. Der isolierte SC sollte genau senkrecht zur Klinge auf dem Mähdeck platziert werden. Der Bediener sollte das Messer auch senkrecht zum Mähdeck platzieren. Diese Vorsichtsmaßnahmen sind notwendig, um die Erzeugung reproduzierbarer Schichten zwischen demselben und unterschiedlichen Experimenten zu gewährleisten. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass die Zeit für die Operation begrenzt ist: Die gesamte Schnitterzeugung muss ~30 Minuten dauern. Wenn der Bediener mehr Zeit für die Operation und das Schneiden aufwendet, leidet das SC-Gewebe, was den Erfolg der Kultur und die nächsten Schritte des Experiments beeinträchtigen kann.
Sobald die Scheiben auf die Kulturmembran gelegt wurden, ist es wichtig, sie richtig zu füttern. GDNF ist notwendig, um die Erholung und das Überleben des Gewebes aufrechtzuerhalten. Das Schneiden mit einem Zerkleinerer ist traumatisch für das Gewebe und aus diesem Grund werden die Scheiben kurz nach dem Schnitt in ein eiskaltes Seziermedium gelegt, um den Überschuss an entzündungsfördernden und todfördernden Molekülen zu entfernen. Dann werden die Scheiben mit frischem Medium auf die Kulturmembranen (Zellkulturinsertionen) gelegt, das mit GDNF modifiziert ist, um eine schnellere Erholung und die Adhäsion der Scheiben an der Membran zu fördern. GDNF sollte dem Medium in der ersten Woche in Kultur wegen seiner kurzen Halbwertszeit täglich zugesetzt werden50,51. Wir haben beobachtet, dass die Scheiben in den ersten Tagen der Kultur die kontinuierliche Anwesenheit von GDNF benötigen, um die Regeneration und Lebensfähigkeit des Gewebes zu fördern. Da die GDNF-Präsenz für den gesamten Kulturzeitraum wichtig ist, wird in jedem Fall dringend davon abgeraten, die GDNF-Verabreichung zu einem späteren Zeitpunkt zu unterbrechen.
In der ersten Woche in Kultur ist es auch wichtig, die Scheiben makroskopisch mit dem Auge und am Mikroskop zu überprüfen. Durchscheinendes Gewebe und Transparenz der Ränder sind Zeichen für eine gute Haftung der Scheiben an der Membran und für lebensfähiges Gewebe. Das nekrotische Gewebe erscheint auf den ersten makroskopischen Blick extrem weiß und die nekrotischen Bereiche erscheinen am Mikroskop dunkelgrau. Nach einigen Wochen in Kultur kann sich die Morphologie des Gewebes verändern: Zellbewegungen und die Adhäsion des Gewebes an der Membran können diesen Prozess beeinflussen. Wir beobachteten zum Beispiel den Verlust des zentralen Lumens in einigen mit Zellen gefüllten Schnitten und den Verlust der Morphologie des Hinter- und Bauchhorns. Dies geschieht vor allem bei kleineren Scheiben, während die meisten von ihnen eine anatomische Struktur beibehalten, die der ursprünglichen nahe kommt. Schnitte werden in der Regel aus dem lumbalen oder thorakalen Bereich erzeugt, da sie auf diese Weise die entsprechende Größe haben können, um ihre ursprüngliche Histoarchitektur im Laufe der Zeit beizubehalten: Wenn sie zu klein sind, verlieren sie ihre Architektur, während sie, wenn sie zu groß sind, in der zentralen Region in Nekrose geraten können. So haben wir die Lendenwirbelsäule von Mausjungtieren verwendet, um Scheiben mit der richtigen Größe für eine optimale Langzeitkultivierung zu erzeugen, aber im Prinzip können auch andere Segmente in Betracht gezogen werden. Darüber hinaus haben wir uns für die Lendenwirbelsäule entschieden, da ventrale und dorsale Regionen besser voneinander unterscheidbar sind. Darüber hinaus weist diese Region Gewebebereiche mit einem höheren Anteil an Motoneuronen und grauer Substanz auf, die für Zellersatztherapien bei Rückenmarksverletzung von Interesse sind. Bei der Transplantation von Zellen in die Scheiben hängt das Hauptproblem mit dem Bruch der Glasmikronadelspitze zusammen. Wenn das Loch für den Zelldurchgang zu groß ist, kann es während der Mikroinjektion zu einer Schädigung des SC-Gewebes kommen. Wenn sie zu klein ist, kann das Stapeln von Zellen die Nadel verstopfen und den Transplantationsprozess behindern. Die Transplantation sollte innerhalb von 1 Stunde abgeschlossen sein, um das Leiden und den Tod der Zellen zu minimieren.
Das vorgeschlagene Protokoll bietet ein optimales und vielseitiges Werkzeug für verschiedene Arten von Untersuchungen. Hier setzen wir unsere Langzeitplattform ein, um die Transplantation von h-SC-NES-Zellen in den ersten Stadien der Differenzierung in SC-Gewebe der Maus für 30 Tage zu validieren. Die wichtigste Neuerung des vorgeschlagenen Ansatzes ist die Optimierung des Co-Kulturprotokolls. Die Bestandteile von GM sorgen für das langfristige neuronale Überleben der SC-Schnitte und der transplantierten h-SC-NES-Zellen. In der Tat erhält GM, da es sich um ein serumfreies Medium handelt, die Differenzierung der transplantierten Zellen in Bezug auf das neuronale Schicksal im Vergleich zu dem Medium, das zuvor für die organotypische Schnittkultur verwendet wurde,aufrecht 47.
Was die vorgeschlagenen Modelle für die Querschnittlähmung betrifft, so werden die Experimente in der Regel an erwachsenen Mäusen durchgeführt. Bisher hängen die wichtigsten Unterschiede zwischen neonatalen und adulten subkutanen Mäusen mit dem höheren Regenerationspotenzial zusammen, das bei neonatalen Mäusen im Vergleich zu adulten Mäusen gefunden wurde52. Solche Unterschiede haben jedoch keinen Einfluss auf die Art des Protokolls, das wir vorschlagen, da wir uns hier auf die Reaktion transplantierter Zellen auf die Umgebung des Wirtsgewebes konzentrieren und nicht auf die Regenerationsfähigkeiten der ansässigen Neuronen. Ein weiterer Unterschied zwischen neonatalen und adulten Mäusen nach einer Querschnittlähmung hängt mit der Bildung der Glianarbe zusammen, die bei Erwachsenen auftritt. Dieser Aspekt wird in dem vorgeschlagenen Modell nicht berücksichtigt, das die komplexen physiopathologischen Prozesse, die sich aus primären und sekundären Verletzungen ergeben, nicht berücksichtigt.
Was die Anwendungen betrifft, so könnte die Plattform auch genutzt werden, um die Integration zwischen den transplantierten Zellen und den residenten Schaltkreisen zu untersuchen, die im organotypischen SC-Modell vorhanden sind. Gentechnische Werkzeuge wurden bereits im ZNS zur Bewertung der synaptischen Konnektivität eingesetzt und könnten in dieser Hinsicht genutzt werden 53,54,55. Insbesondere konnte die Integration untersucht und validiert werden, indem die Bildung von Synapsen zwischen den transplantierten Zellen und dem SC ex vivo Gewebe untersucht und validiert wurde. Diese organotypischen Langzeitkulturen könnten auch zur Erprobung neuroprotektiver und neuroregenerativer Wirkstoffe oder neuartiger Moleküle/Materialien oder zur Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen, an denen der SC beteiligt ist, genutzt werden. Um spezifische neurodegenerative Erkrankungen zu untersuchen, muss das Protokoll für die Kultivierung von SC-Schnitten angepasst werden, die aus relevanten Modellen generiert wurden, wie z. B. transgenen Mäusen mit spezifischen pathologieassoziierten Mutationen, in dem für die Pathologie relevanten Stadium (d. h. Neugeborene, Jungtiere, Erwachsene). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser Protokoll und unsere organotypischen Kulturen im Allgemeinen, da es sich um Explantate eines bestimmten Organs handelt, Merkmale aufweisen, die die Lücke zwischen 2D-Zellkulturen und In-vivo-Modellen schließen und sie als unschätzbares Werkzeug sowohl für die Grundlagenforschung als auch für präklinische Tests bestätigen.
The authors have nothing to disclose.
Die Studie wurde unterstützt von der Wings for Life Foundation (WFL-IT- 20/21), dem EU-Nationalen Aufbau- und Resilienzplan (NRRP) der Europäischen Union Next-Generation – Mission 4 Komponente 2, der Investition Nr. 1.4-CUP N. B83C22003930001 (Tuscany Health Ecosystem-THE, Spoke 8) und der Marina Romoli Onlus. Dieses Manuskript gibt nur die Ansichten und Meinungen der Autoren wieder, weder die Europäische Union noch die Europäische Kommission können dafür verantwortlich gemacht werden. Daten und Metadaten sind auf Zenodo 10.5281/zenodo verfügbar.10433147. Die Bilder wurden mit Biorender https://www.biorender.com/ erzeugt.
anti-cleaved Caspase-3, (Asp175) (5A1E) (Rabbit) | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:400 |
anti-GFP (Mouse) – monoclonal | Sigma/Merck | G6539 | 1:400 |
anti-Human Nuclei (Mouse) – monoclonal, clone 235-1 | Sigma/Merck | MAB1281 | 1:400 |
anti-Human Nuclei (Rabbit) | NeoBiotechnologies | RBM5-346-P1 | 1:400 |
anti-NeuN (RBFOX3) (Rabbit) – polyclonal | Sigma/Merck | ABN78 | 1:400 |
anti-NFL (Mouse) | Sigma/Merck | MAB1615 | 1:400 |
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Aqua Polymount | Poly-sciences | 18606-20 | |
B-27 | Gibco | 17504-044 | |
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Cell culture graded water | Sigma/Merck | W3500-500ML | |
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FGF-2 | Stemgent | 03-0002 | |
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Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11029 | |
Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21236 | 1:500 |
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Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21244 | 1:500 |
Graph Pad-Prism | Dotmatics | Software for Statistical Analysis | |
HBSS | Gibco | 14025-050 | 1:500 |
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McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
MEM | Gibco | 11090-081 | |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | to load cells in the needle for transplantation |
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Millicell cell culture membrane | Sigma/Merck | PICM0RG50 | |
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Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
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PFA | Sigma/Merck | P6148-500G | |
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Poly-L-lysine | Sigma/Merck | P4707 | |
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
Spring Scissors | World Precision Instruments | 501235 | |
Stereomicroscope for imaging and acquisition | Nikon | SMZ18 | |
Stereomicroscope for surgery | VWR | ||
Triton X-100 | Merck | T8787 | |
Tweezers-Dumont #5-inox | World Precision Instruments | 501985 | |
Vannas Scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
Vertical micropipette puller | Shutter Instrument | P-30 | |
Y-27632 | R&D Systems | 1254/50 |