בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

כל הניסויים שבוצעו עם בעלי חיים אושרו בעבר על ידי הוועדה האתית של אוניברסיטת ולנסיה ואושרו על ידי Conselleria de Agricultura, Ganadería y Pesca, Generalitat Valenciana (ספרד). 1. תרבות ראשונית של נוירוספרות הכנת ריאגנטיםהכינו תמיסת חיץ של חיץ מלח פוספט של דולבקו (DPBS) במים שעברו דה-יוניזציה ועיקרו על ידי אוטוקלאבינג. לחלופין, הכינו תמיסת PBS pH 7.4 של 0.1 מ”מ על ידי הוספת 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 ותמיסת KH2PO4 של 1.8 mM במים נטולי יונים. מלאו שתי צלחות בנות 12 בארות ב-DPBS מקורר בעבר ושמרו אותן על קרח: אחת תשמש לשימור המוח כולו לפני נתיחה, והשנייה תשמור SVZ מנותחות עד לעיבוד רקמות. הכינו תערובת אנזימטית המכילה פפאין כמתואר להלן.הכינו תמיסת דיסוציאציה של EDTA/L-ציסטאין בתמיסת מלח מאוזנת של ארל (EBSS) לריכוז סופי של 0.2 מ”ג/מ”ל כל אחת. כדי להשיג המסה מלאה, לדגור את הצינור באמבט מים ב 37 °C (77 °F). להמיס 12 U/mL של פפאין בתמיסת EDTA/L-ציסטאין. קחו בחשבון כי 500 μL של פתרון אנזימטי ישמש לכל מוח. הציגו תמיסת פפאין באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך כ-20 דקות עד שהאנזים מתמוסס במלואו. סננו ועיקרו את התערובת האנזימטית בעזרת מזרק ומסנן נקבוביות בגודל 0.22 מיקרומטר ושמרו אותה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.הערה: פפאין מופעל לאחר 30 דקות ב 37 ° C, וזה יכול להיות מאוחסן במשך 12 שעות ב 4 ° C. הכינו את מדיום תרבית הבקרה על ידי הוספת תמיסת תערובת ההורמונים בהתאם לטבלה 1 וסיננו לעקר אותה באמצעות מסנני ניטרוצלולוז 0.22 מיקרומטר נקבוביות. יש לשמור את המדיום על 4°C לחמם אותו באמבט מים ב 37°C לפני השימוש. הכן את המדיום המלא על-ידי השלמת אמצעי הבקרה עם EGF ו-bFGF ממש לפני השימוש לפי טבלה 1. אין לסנן את המדיום המלא, מכיוון שמיטוגנים עלולים ללכת לאיבוד עם סינון. מיצוי מוח ודיסקציה SVZהערה: לעכברים מותרת גישה חופשית למזון ומים לפני המתת חסד. C57BL/6 עכברים בני 8 עד 16 שבועות משמשים. שני המינים משמשים ללא הבדלים ניכרים בהכנה.לעקר את כלי הדיסקציה על ידי autoclaving לפני הניתוח. לאחר מכן, טבלו אזמלים, פינצטה, מספריים ומרית בכד מלא באתנול 70%. נקו ביסודיות כל משטח עבודה עם 70% אתנול. להקריב את העכבר על ידי מנת יתר CO2 ולאשר על ידי נקע צוואר הרחם. רססו את הראש באתנול 70% כדי למזער את האפשרות לזיהום ברקמת המוח. להפריד את ראש העכבר משאר הגוף באמצעות מספריים. חותכים את העור מעל הגולגולת עם מספריים קטנים לאורך ציר rostro-caudal עד הגולגולת הוא חשוף לחלוטין. לחשוף את המוח על ידי חיתוך הגולגולת בתחילה לאורך תפר הקשת עם מספריים קטנים ולאחר מכן, להסיר את העצמות באמצעות פינצטה עדינה. היזהר לא לגרום נזק לרקמת המוח מתחת לגולגולת במהלך שלב זה. בזהירות לחלץ את המוח מן הגולגולת באמצעות מרית ומניחים אותו לתוך צלחת 12 בארות המכילה DPBS קר. שומרים את הצלחת על קרח עד להשלמת הנתיחה. העבירו את המוח כולו אל משטח הסיליקון שבו תתרחש הדיסקציה, ומרחו כמה טיפות של DPBS קר על המוח (איור 1A). השתמשו באזמל כדי להסיר את ה-OB הממוקם בקצה הרוסטרלי של המוח ואת המוח הקטן הממוקם בחלק הקאודלי, תוך שמירה על החלק המרכזי של המוח המכיל את שני החדרים הצדיים (איור 1B). חלקו את המוח לאורך הסדק האורכי לשתי המיספרות, ואז המשיכו בדיסקציה של שתי ההמיספרות בנפרד (איור 1C). עבודה עם חצי כדור אחד, לכוון אותו מחדש כך האזור המדיאלי פונה כלפי מעלה. פתחו את המוח לאורך הקו של כפיס המוח, הפרידו את קליפת המוח והסטריאטום מההיפוקמפוס, המחיצה והדיאנצפלון, וכך חשפו את החדרים הצדיים (איור 1D).הערה: ה-SVZ ממוקם בין חלל החדר לבין הסטריאטום, ולכן השלבים הבאים שואפים לבודד את ה-SVZ בצורה מדויקת ככל האפשר מהרקמה שמסביב. הסירו את ההיפוקמפוס, המחיצה והמוח בעקבות הגבול הגחוני של החדרים (איור 1E,F), הרקמה שמעבר לקצוות הרוסטרליים והקאודליים של SVZ (איור 1G), ואת קליפת המוח שעוקבת אחרי כפיס המוח (איור 1H,I). הטו את הרקמה כך שה-SVZ יפנה הצידה (איור 1J), ואפשרו להסיר את הרקמה הסטריאטלית מתחת ל-SVZ (איור 1K) כדי לקבל פיסת רקמה דקה שמכילה את ה-NSCs (איור 1L). אחסן את שני SVZ מנותחים מאותו עכבר בצלחת בת 12 בארות המכילה DPBS קר וסטרילי עד לתחילת עיבוד הרקמות.הערה: הדיסקציה של שני SVZ ממוח אחד אמורה להימשך 10 דקות. זמן ארוך יותר עלול להשפיע על יכולת הקיום של התא. אם יש צורך בתפוקה מוגברת של התרביות, ניתן לאסוף SVZ מעכברים מרובים באותו גיל, מין, רקע גנטי וגנוטיפ. בידוד וזריעה של מל”ליםחותכים כל SVZ ל 4-5 חתיכות קטנות כדי להקל על פירוק הרקמה.הערה: משלב זה ואילך, יש לבצע את כל ההליך בתנאים סטריליים במכסה מנוע זרימה למינרית. מעבירים את ה-SVZ הקצוצים לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ”ל באמצעות פיפטת פסטר סטרילית מפלסטיק. ודא שלא נותרו שברים בצלחת. תן את משקעי הרקמה בתחתית הצינור ולהסיר את DPBS הנותרים. הוסף 500 μL של תערובת אנזימטית מסוננת המכילה פפאין לכל מוח (2 SVZs) ודגר על הצינורות באמבט מים ב 37 ° C במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, להוסיף 5 מ”ל של אמצעי בקרה שחומם מראש ב 37 ° C לכל דגימה. צנטריפוגה את הדגימות ב 300 x גרם במשך 5 דקות. לאחר מכן, בזהירות להסיר את supernatant באמצעות micropipette או משאבת ואקום. מוסיפים 1 מ”ל של אמצעי בקרה ומפרקים בזהירות מכנית את הכדורית, תוך שהם מעלים ויורדים פי 10 עד פי 20, באמצעות פיפטה מזכוכית פסטר מלוטשת באש עד לקבלת תרחיף תאים הומוגני.זהירות: זהו אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול, שכן פירוק מוגזם או לא מספיק ישפיע לרעה על התשואה של התרביות. מוסיפים 4 מ”ל של אמצעי בקרה ומערבבים בהיפוך כדי לשטוף את התאים. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. לאחר מכן, הסר את supernatant. הוסף 1 מ”ל של מדיום מלא והשהה מחדש את הגלולה על ידי פיפטציה למעלה ולמטה פי 10 כדי ליצור הומוגניות של תרחיף התא. ספרו את תרחיף התא באמצעות תא נויבאואר מתחת למיקרוסקופ לאחר דילול 1/2 אליקוט של תרחיף התא עם טריפאן כחול או השתמשו במונה תאים אוטומטי. ודא כי תרביות מפורקות ברמת תא בודד. לאחר הכנת תרחיף התא, זרעו את התאים המתקבלים באופן שווה ב -8 בארות של צלחת 48 בארות בנפח סופי של 500 מיקרוליטר של תווך שלם.הערה: בדרך כלל אנו מקבלים 20,000 תאים משני SVZs, וכתוצאה מכך צפיפות הזריעה הסופית היא כ-2,500 תאים/מ”ל כדי להשיג את התפוקה המרבית בתרביות. היווצרות נוירוספרותלדגור על תאים במשך 5 עד 7 ימים במבחנה (DIV) באינקובטור לח ב 37 ° C ו 5% CO2. בתנאים אלה, תאים ממוינים מתים בעוד NSCs ואבות מתרבים בתגובה לגירוי מיטוגני, ויוצרים אגרגטים שבטיים המוכרים כנוירוספרות ראשוניות.הערה: ניתן להשתמש ב-EGF או ב-bFGF כדי לגרום להיווצרות נוירוספרה. עם זאת, שני גורמי גדילה אלה אינם ניתנים להחלפה מלאה. בדקו את גודל הנוירוספרות באמצעות מצלמה מצומדת למיקרוסקופ הפוך, וברגע שהנוירוספרות מגיעות לטווח גודל של 50 עד 100 מיקרומטר, ספרו את כל הנוירוספרות הראשוניות שנוצרו בבאר בהגדלה של פי 10. המספר הכולל של נוירוספרות ראשוניות שנוצרו משמש כהערכה של מספר NSCs הנוכחים בנישת SVZ. לאחר תקופה של 10 ימים, אספו את מדיום התרבית מכל באר כדי להתחיל לעבור. בצע מעבר לאחר מכן לאחר 5 עד 7 DIV, אם כי ראוי לציין כי כדורים ראשוניים עשויים לדרוש משך זמן מעט ארוך יותר כדי להגיע לגודל האידיאלי עבור subculturing (סביב 100 מיקרומטר). טבלה 1: פתרונות מדיה תרבותית. המתכון של מדיום הבקרה מתואר. תמיסת תערובת הורמונים מעורבבת מראש נעשתה. מלאי פתרונות הורמונליים ניתן להכין מראש כפי שצוין ומאוחסן ב -20 ° C. לפני תרבית תאים, להשלים את מדיום הבקרה עם EGF ו bFGF כדי להכין מדיום שלם. מפרטי אחסון, מלאי וריכוזי עבודה מסופקים עבור כל רכיב. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. 2. הרחבת תרבויות נוירוספריות מעבר של נוירוספרותלאסוף את המדיום המכיל את הנוירוספרות מן לוחות multiwell ולהעביר אותם צינור צנטריפוגה 15 מ”ל. להבטיח את ההתאוששות של תאים רבים ככל האפשר על ידי שטיפת הבארות עם כמה מיליליטר של DPBS. נוירוספרות צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 x גרם. לאחר מכן, הסר את supernatant. הוסף 200 μL של תמיסה אנזימטית (ראה רשימת חומרים) לגלולה והקש בעדינות על תחתית הצינור כדי לעקור אותו. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להקל על הדיסוציאציה של הנוירוספרות. הוסף 1 מ”ל של אמצעי בקרה כדי לעצור את התגובה האנזימטית ולנתק באופן מכני נוירוספרות עם מיקרופיפטה P1000 על ידי פיפטציה למעלה ולמטה 10x עד 20x. מוסיפים נפח נוסף של 4 מ”ל של אמצעי הבקרה ומערבבים בהיפוך כדי לשטוף את התאים. צנטריפוגה את התאים במשך 5 דקות ב 300 x גרם. לאחר מכן, הסר את supernatant. הוסף 1 מ”ל של מדיום מלא והשהה מחדש את הגלולה כדי ליצור הומוגניות של התרחיף התאי על ידי פיפטציה למעלה ולמטה פי 10.הערה: אם המספר והגודל המקוריים של נוירוספרות גבוהים מדי, הוסף מדיום שלם יותר כדי לדלל את תרחיף התא ולהבטיח ספירת תאים אמינה. ספור את מתלה התא באמצעות תא נויבאואר לאחר דילול 1/2 aliquot של מתלה התא עם כחול טריפאן או להשתמש מונה תאים אוטומטי. כדי להרחיב את תרבית התאים, זרעו תאים בצפיפות של 10,000 תאים לסמ”ק2 באמצעות תווך שלם בצלחת תרבית מתאימה או בבקבוק (ראה טבלה 2). תאי דגירה עבור 5 עד 7 DIV באינקובטור לח ב 37 ° C ו 5% CO2 עבור כל מעבר.הערה: ניתן להרחיב ולהפיץ תרביות נוירוספריות באופן עקבי באמצעות תת-תרבית חוזרת, שלא תעלה על 10 מעברים, מבלי לשנות את יכולות ההתפשטות שלהן. ניתן להשתמש ב-EGF או ב-bFGF לגידול; עם זאת, התרחבות ארוכת טווח של התרבויות יכולה להיות מושגת רק בנוכחות EGF. בדיקת התחדשות עצמיתלאחר מעבר תרביות נוירוספרה, לוחית 1,000 תאים בודדים בצלחת של 96 בארות, ומשלימה עד נפח סופי של 200 μL עם תווך שלם, וכתוצאה מכך צפיפות התאים הסופית של תרביות של 5 תאים/μL.הערה: מספר התאים שנזרעו חייב להיות מדויק ככל האפשר. במידת הצורך, הכינו דילולי ביניים כדי להבטיח נפח תרחיף תאים אמין לפני הציפוי. יתר על כן, מומלץ צלחת 4 עד 5 משכפלים לכל תנאי כדי להפחית את השונות הטכנית. לדגור על תאים ב 37 ° C ו 5% CO2 באינקובטור לח במשך 5 ימים או עד נוירוספרות להגיע לגודל מתאים (60 עד 100 מיקרומטר). הימנע להזיז או לנער את הצלחת multiwell כדי למנוע הצטברות נוירוספרה. לאחר היווצרות נוירוספרה, ספור את מספר הנוירוספרות הנוצרות בכל באר באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה המצויד במצלמה מחוברת. בדיקת החידוש העצמי יכולה להתבצע באמצעות EGF או bFGF בנפרד. שימור בהקפאה של תרביות המל”להערה: תרביות נוירוספריות יכולות להישמר בהקפאה לשימוש עתידי, תוך מזעור מספר העכברים הדרוש. מומלץ לשמר תאים עד מעבר 10.כדי לשמר תאים בהקפאה, העבר 1 מ”ל של תרחיף התא בתווך מלא לצינור קריו-צינור מסומן כראוי. הוסף דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לריכוז סופי של 10% לתרחיף התא וערבב בעדינות על ידי היפוך הצינורות.הערה: DMSO משמש כמגן קריוגני אך עלול להיות רעיל לתאים, ולכן יש לבצע שלב זה במהירות. הכניסו את הצינורות למקפיא בטמפרטורה של -80°C באמצעות מיכל הקפאה המאפשר ירידה הדרגתית בטמפרטורה של 1°C/min. תהליך הקפאה הדרגתי זה מונע נזק לתאים הנגרם על ידי היווצרות גבישי קרח במהלך שימור בהקפאה. לאחסון לטווח ארוך, שמור על הצינורות במיכל חנקן נוזלי ב -196 ° C. הפשרת תרביות המל”להערה: בעת הצורך, ניתן להפשיר תאים, ולהרחיב תרביות מחדש לניסויים.הסר את צינורות ההקפאה המכילים NSCs קפואים ממיכל אחסון החנקן הנוזלי והניחו אותם מיד באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד להפשרה מלאה, כ -5 דקות.זהירות: חיוני למזער את זמן האמבטיה מכיוון ש- DMSO רעיל ויכול להשפיע על יכולת הקיום של התא. העבר במהירות תאים מופשרים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ”ל המכיל 5 מ”ל של אמצעי בקרה שחומם מראש. תאי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. הוסף 1 מ”ל של מדיום מלא והשהה מחדש את הגלולה על ידי זינוק עדין למעלה ולמטה פי 10 כדי ליצור הומוגניות של התרחיף התאי לפני הזריעה.הערה: הפשרה עלולה להשפיע על כדאיות התא; לכן, מומלץ לעבור תאים לפחות פעם אחת לפני הזריעה לניסויים חדשים. בדיקת מיקופלסמההערה: זיהום מיקופלסמה עלול לפגוע בבריאות התא, ולהשפיע על קצב הגדילה. לכן, בדיקות מיקופלסמה חיוניות כדי להבטיח את שלמות ואמינות הניסויים.מיצוי DNAלאסוף מינימום של 100 μL של תרבית התא עבור מיצוי DNA. גם סופרנאטנט וגם גלולת תא יכולים לשמש למיצוי DNA. יש לאחסן aliquot זה בטמפרטורה של -20°C עד לחילוץ. ניקב את מכסה הצינור והרתיח את aliquot ב 99 ° C במשך 15 דקות באמצעות thermoblock.הערה: פירסינג של מכסי צינור מונע פתיחת צינורות במהלך הרתחה בטמפרטורות גבוהות. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 16,900 x גרם. מעבירים את הסופרנאטנט המכיל את הדנ”א לצינור חדש. אחסן את הצינור עם ה- DNA ב -20 ° C עד בדיקת PCR. PCR לזיהוי מיקופלסמההכן את תערובת ה- PCR באמצעות הרכיבים הבאים: 8.9 μL של מים ללא נוקלאז, 3 μL של 5x מאגר תגובה, 1.2 μL של 25 mM MgCl2, 0.25 μL של 2.5 mM dNTPs, 0.15 μL של Taq פולימראז ו- 0.25 μL של כל פריימר ספציפי למיקופלסמה בריכוז של 10 μM (קדימה, Fw: 5’GATGTTTAGCCGGGTCGAGAG3′ והפוך, Rv: 5’GATGTCAAGAGTGGGTAAGGTT3″). הוסף 1 μL של DNA גנומי שחולץ. הכן את תערובת ה- PCR במכסה מנוע זרימה למינרית כדי למנוע זיהום DNA. לדגור את התגובה במחזור תרמי כדלקמן: דנטורציה ראשונית ב 95 ° C במשך 5 דקות ואחריה 35 מחזורים של denaturation ב 95 ° C במשך 30 שניות, חישול ב 53 ° C במשך 1 דקה, הארכה ב 72 ° C במשך 30 שניות, והארכה סופית ב 72 ° C במשך 5 דקות. כדי לזהות את גודל הרצועה המתקבלת (סביב 500 bp), לטעון 15 μL של מוצר PCR DNA מעורבב עם 3 μL של 6x טעינת תמיסת צבע על ג’ל agarose 2% ולהפעיל את האלקטרופורזה במשך 40 עד 50 דקות ב 100 V. טבלה 2: צלחות וצלוחיות המשמשות לגידול. הממדים והנפחים של לוחות הזריעה והצלוחיות הנפוצים ביותר מסופקים. הטבלה כוללת את הקוטר, שטח הגידול והנפח הבינוני המשמש לכל כלי שיט, יחד עם דוגמה למספר ה-NSCs שיש לזרוע בתנאי התפשטות (10,000 תאים לסמ”ק2). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. 3. נוקלאופקציה של תרבויות נוירוספריות הכנת ריאגנטיםהכנת DNAהכן 25 μL של תאי E. coli DH5α מוכשרים בצינור 1.5 מ”ל לטרנספורמציה. הוסף 1 μL של פלסמיד עניין (ב 100 עד 200 ng / μL) לתאים ולחשוף אותם להלם תרמי ב 42 ° C במשך 45 שניות. כאן משתמשים בפלסמיד המכיל סיכת ראש קצרה (sh)RNA להשתקת ביטוי Snrpn ובפלסמיד בקרה shScramble.הערה: שמור תאים מתאימים על קרח לאורך כל ההליך כדי לשמור על יעילות הטרנספורמציה. צלחת את התאים מותמרים על לוחות אגר LB עם אנטיביוטיקה מתאימה לדגור אותם ב 37 ° C במשך 18 שעות. שמרו על צלחות פטרי הפוכות כדי למנוע היווצרות טיפות כתוצאה מעיבוי, שעלול להפריע למושבות חיידקים.הערה: הוסף אנטיביוטיקה מתאימה למדיום תרבית LB כדי לאפשר באופן בלעדי צמיחה של חיידקים מותמרים. בעזרת קצה פיפטה סטרילי, בחרו מושבות חיידקים בודדות והעבירו אותן לבקבוק ארלנמאייר שהיה מלא בעבר ב-250 מ”ל LB כדי להתחיל תרבית נוזלית. הימנעו מבחירת מושבות לוויין קטנות הממוקמות סביב מושבות המטרה הגדולות יותר, מכיוון שייתכן שהן לא שילבו את הפלסמיד הרצוי. יש לדגור על הבקבוק תוך כדי ניעור נמרץ על שייקר אורביטלי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. השתמשו בערכת maxiprep נטולת אנדוטוקסין והפיקו DNA פלסמיד טהור מתרביות החיידקים בהתאם להוראות היצרן. הרכיבו מחדש את הדנ”א בנפח המתאים של מים נטולי אנדוטוקסין כדי לקבל ריכוז פלסמיד של 1 עד 2 מק”ג/מיקרוליטר.הערה: תשואת maxiprep תלויה בצמיחת התרבית. בדרך כלל, השעיה מחדש של כדורית הדנ”א פלסמיד בנפח של 200 μL תגרום לריכוז ה- DNA הרצוי. יש לאחסן את הצינור עם ה-DNA של הפלסמיד בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש. הכן צינור 1.5 מ”ל עם נפח סופי של 5 μL המכיל 2 עד 6 מיקרוגרם של DNA פלסמיד המיועד nucleofection. הכנת חומריםהכן את תמיסת הנוקלאופקציה. אם אתם משתמשים בערכה המומלצת (ראו טבלת חומרים), הכינו 95 מיקרוליטר של תמיסת הנוקלאופקציה בצינור של 1.5 מ”ל עבור כל נוקלאופקציה רצויה. פיפטות וקוביטות כלולות בדרך כלל בערכה. הכינו אחד מכל אחד לכל תנאי נוקלאופקטציה. הכינו בקבוק T25 מלא ב-4 מ”ל של מדיום מלא שחומם מראש לכל מצב ושמרו אותו באינקובטור עד לשימוש. נוקלאופקציה של NSCsהשתמש 1 עד 2 x 106 תאים נפרדים לכל תנאי לצורך הערכה. צנטריפוגו את התאים במשך 5 דקות ב 300 x גרם, ולאחר מכן להסיר את supernatant. הוסף 1 מ”ל של DPBS והשהה מחדש את הגלולה על ידי צנרת למעלה ולמטה פי 10 כדי להבטיח השעיה תאית הומוגנית. חזור על הצנטריפוגה (שלב 2.1.6) לשטיפה שנייה ולבסוף תשעה מחדש את הגלולה בתמיסת נוקלאופקציה של 95 מיקרוליטר.הערה: שלבי שטיפה חיוניים להסרת אנטיביוטיקה ממדיום הבקרה ולהבטחת גרעין יעיל. שלב את 95 μL של תאים עם תמיסה מעורבבת מראש המכילה 5 μL של כל פלסמיד (2 מיקרוגרם בסך הכל) שנבחר עבור nucleofection. באמצעות מיקרופיפטה P200, להעביר פתרון זה cuvette ומניחים אותו במכשיר נוקלאופקטור. Nucleofect התאים עם פלסמידים הרצויים באמצעות תוכנית NSC אופטימלית של מערכת nucleofector. לאחר השלמת האלקטרופורציה, הציגו בזהירות מדיום שלם וחם לקובט באמצעות פיפטות פסטר המסופקות בערכה. לאחר מכן, מעבירים את תכולת הקובט לבקבוק T25 שהוכן בעבר המכיל מדיום שלם שחומם מראש. לאחר התחשמלות, ייתכן מוות תאי, משקעים DNA, והיווצרות של צבר צמיג. הימנע מלהעביר את זה לצלוחית T25, מכיוון שזה עלול להפחית את הישרדות התא.הערה: שלב זה הוא חיוני ויש לבצע אותו מהר ככל האפשר כדי להבטיח תשואה גבוהה של נוקלאופקציה והישרדות תרבית לאחר מכן. לדגור על תאים גרעיניים ב 37 ° C ו 5% CO2 באינקובטור לח במשך 3 עד 5 ימים. בחירת תאים בעלי גרעיןאסטרטגיה א’: בחירת ציטומטריית זרימה באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS)לאחר 3 עד 5 ימים של נוקלאופקטציה, עברו את התרביות הגרעיניות לאחר שלב 2.1 ואספו את כל התאים הבודדים שהתקבלו. סנן דגימות דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להסיר צברי תאים ולנתח אותם באמצעות ציטומטר זרימת ממיין התא.הערה: חיוני למיין את אותו מספר תאים בכל מצב כדי לקבל תוצאות השוואתיות. באמצעות תוכנת הציטומטר, שער תאים חיים המבוסס על שני מדדים: אור מפוזר קדמי (FSC-A) המתאים לגודל התא ואור מפוזר צדדי (SSC-A) המתאים למורכבות תוך תאית. בחר את אוכלוסיית התאים החיים המאופיינים ב- FSC-A גבוה ו- SSC-A גבוה.הערה: לחלופין, הוסף 0.1 מיקרוגרם/מ”ל של 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לתרחיף תאים לפני המיון. זה יאפשר השלכה של תאים מתים וגופים אפופטוטיים מן gating. מחק כפילים ושלישיות של תאים על-ידי התוויית פרמטרים של FSC-A לעומת FSC-H. בחר את האירועים הכלולים באלכסון של העלילה, המייצג סינגלים.הערה: כאשר תאים עוברים דרך הלייזר, הציטומטר מזהה שינויי מתח לאורך זמן. FSC-A מייצג את אזור האות, ו- FSC-H מציין את גובה השיא. סינגלים מציגים יחס יחסי בין FSC-A ו- FSC-H (הממוקם באלכסון של העלילה), בעוד שצברי תאים מציגים FSC-A גדול יותר ביחס ל- FSC-H עקב אות ארוך יותר. בחר תאים נוקלאופקטיים בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנטיות של הגן המדווח המקודד על ידי הפלסמיד שבו נעשה שימוש. לדוגמה, בעת שימוש בתאי GFP+ ניתן לבחור בהתבסס על רמות פלואורסצנטיות של FITC-A לעומת התוויית SSC-A. בודד את המספר הרצוי של תאי מטרה עבור כל מצב ואסוף אותם ישירות בצינור איסוף מלא בתווך שלם. זרעים גרעיניים NSCs בצפיפות של 10,000 תאים לסמ”ק2. לדגור על תרביות תאים ממוינות ב 37 ° C ו 5% CO2 באינקובטור לח. אסטרטגיה ב’: סלקציה באמצעות עמידות לאנטיביוטיקה המקודדת בפלסמידלאחר 48 שעות של נוקלאופקטציה, הוסף את ריכוז האנטיביוטיקה המתאים לבחירת תאים עמידים.הערה: לפני שמתחילים, מומלץ לבדוק ריכוזים מרובים של אנטיביוטיקה על תאים שאינם נוקלאופקטים. ריכוז האנטיביוטיקה האופטימלי הוא הכמות הנמוכה ביותר שבה מסולקים כל התאים שאינם עמידים. לדוגמה, קבענו ריכוז אופטימלי של 4 מיקרוגרם/מ”ל אנטיביוטיקה בלסטיצידין עבור תרביות NSC. לדגור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO2 באינקובטור לח במשך 48 שעות. לאחר 48 שעות של טיפול אנטיביוטי, תת-תרבית של התאים הנוקלאופקטיים לפי שלב 2.1. אם הנוירוספרות נשארות קטנות, הסר את האנטיביוטיקה ממדיום התרבית על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 5 דקות. להשהות מחדש את התאים ולתרבית אותם בבקבוק באמצעות מדיום מלא בלבד. יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 באינקובטור לח עד שניתן יהיה להרחיבם לאחר שלב 2.1.