成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

動物を用いたすべての実験は、バレンシア大学の倫理委員会によって承認され、Conselleria de Agricultura, Ganadería y Pesca, Generalitat Valenciana (Spain) によって承認されました。 1. ニューロスフェアの初代培養 試薬の調製ダルベッコのリン酸生理食塩水(DPBS)の緩衝液を脱イオン水に調製し、オートクレーブ滅菌します。あるいは、脱イオン水に137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、 および1.8 mM KH2PO4溶液を加えて、0.1 M PBS pH 7.4を調製します。 2つの12ウェルプレートに以前に冷却したDPBSを充填し、氷上に保ちます:1つは解剖前に全脳を保存するために使用され、もう1つは組織処理まで解剖されたSVZを保存します。 以下に説明するように、パパイン含有酵素ミックスを調製します。EDTA/L-システイン解離溶液をEarl’s Balanced Salt Solution(EBSS)に調製し、最終濃度をそれぞれ0.2 mg/mLにします。完全に溶解するには、チューブを37°Cのウォーターバスでインキュベートします。 12 U/mLのパパインをEDTA/L-システイン溶液に溶解します。脳あたり500μLの酵素溶液が使用されると考えてください。 パパイン溶液を37°Cの水浴に約20分間、酵素が完全に溶解するまで導入します。 シリンジと0.22μmポアフィルターで酵素ミックスをフィルター滅菌し、使用するまで4°Cに保ちます。注:パパインは37°Cで30分後に活性化され、4°Cで12時間保存できます。 表1に従ってホルモンミックス溶液を添加してコントロール培地を調製し、ニトロセルロース0.22μm細孔フィルターを使用してフィルター滅菌します。培地を4°Cに保ち、37°Cのウォーターバスで温めてから使用してください。 表1に示すように、使用する直前にコントロール培地にEGFとbFGFを添加して、完全な培地を調製します。ろ過するとマイトジェンが失われる可能性があるため、完全な培地をろ過しないでください。 脳の抽出とSVZ解剖注:マウスは、安楽死の前に食物と水に自由にアクセスできます。8週齢から16週齢のC57BL/6マウスを使用します。雌雄ともに、調製に目立った違いなく使用されます。手術前にオートクレーブ滅菌して解剖ツールを滅菌します。次に、メス、ピンセット、ハサミ、ヘラを70%エタノールで満たされたビーカーに沈めます。70%エタノールですべての作業面を完全に清掃します。 CO2の過剰摂取によりマウスを犠牲にし、子宮頸部脱臼により確認する。脳組織の汚染の可能性を最小限に抑えるために、ヘッドに70%エタノールをスプレーします。 はさみを使用して、マウスの頭を体の他の部分から分離します。頭蓋骨が完全に覆われるまで、吻尾軸に沿って小さなハサミで頭蓋骨の上の皮膚を切ります。 最初に小さなハサミで矢状縫合糸に沿って頭蓋骨を切って脳を露出させ、次に細いピンセットを使用して骨を取り除きます。このステップでは、頭蓋骨の下の脳組織に損傷を与えないように注意してください。 ヘラを使用して頭蓋骨から脳を慎重に抽出し、冷たいDPBSを含む12ウェルプレートに入れます。解剖が完了するまでプレートを氷の上に置いておきます。 解剖が行われるシリコンパッドに脳全体を移し、脳全体に冷たくしたDPBSを数滴塗布します(図1A)。 メスを使用して、脳の吻側端にあるOBと尾側部分にある小脳を切除し、両側脳室を含む脳の中央部分を保持します(図1B)。 縦方向の裂け目に沿って脳を2つの半球に分割し、次に両方の半球を別々に解剖します(図1C)。 1つの半球で作業し、内側領域が上を向くように向きを変えます。脳梁の線に沿って脳を開き、皮質と線条体を海馬、中隔、間脳から分離し、側脳室を露出させます(図1D)。注:SVZは心室の空洞と線条体の間にあるため、次のステップでは、SVZを周囲の組織からできるだけ正確に分離することを目的としています。 心室の腹側限界(図1E、F)、SVZの吻側端と尾側端の向こう側の組織(図1G)、および脳梁に続く皮質(図1H、I)に従って、海馬、中隔、および間脳波を切除します。 SVZが横を向くように組織を傾け(図1J)、SVZの下の線条体組織(図1K)を除去して、NSCを含む薄い組織片(図1L)を得ることができます。 組織処理が開始されるまで、同じマウスから解剖した両方のSVZを、冷たく滅菌したDPBSを含む12ウェルプレートに保存します。注:1つの脳から両方のSVZを解剖するには10分かかります。時間が長いと、細胞の生存率に影響を与える可能性があります。培養物の収量を増やす必要がある場合は、同じ年齢、性別、遺伝的背景、および遺伝子型の複数のマウスからのSVZをプールできます。 NSCの分離と播種各SVZを4〜5個の小片にカットして、組織の解離を促進します。注:このステップから、すべての手順を層流フード内の無菌状態で実行する必要があります。 刻んだSVZを滅菌プラスチックパスツールピペットを使用して15 mLの遠心分離チューブに移します。プレートに破片が残っていないことを確認してください。 チューブの底に組織沈殿物を沈殿させ、残りのDPBSを取り除きます。 濾過したパパイン含有酵素ミックスを1脳あたり500 μL(2 SVZ)加え、チューブを37°Cの水浴で30分間インキュベートします。 インキュベーション後、37°Cで予熱したコントロール培地5 mLを各サンプルに加えます。 サンプルを300 x g で5分間遠心分離します。次に、マイクロピペットまたは真空ポンプを使用して上清を慎重に取り除きます。 1 mLのコントロール培地を加え、ペレットを慎重に機械的に分解し、ファイヤーポリッシュしたパスツールガラスピペットを使用して、均一な細胞懸濁液が得られるまで10倍から20倍にピペッティングします。注意:これは、過度または不十分なディスアグリゲーションが培養物の収量に悪影響を与えるため、プロトコルで最も重要なステップの1つです。 コントロール培地4mLを加え、反転して混合して細胞を洗浄します。300 x g で5分間遠心分離します。次に、上清を取り除きます。 1 mLの完全培地を加え、ピペッティングで10回上下させてペレットを再懸濁し、細胞懸濁液を均質化します。 細胞懸濁液のアリコートをトリパンブルーで1/2希釈した後、顕微鏡下でノイバウアーチャンバーを使用して細胞懸濁液をカウントするか、自動セルカウンターを使用します。培養物がシングルセルレベルで分解されていることを確認してください。 細胞懸濁液を調製したら、得られた細胞を48ウェルプレートの8ウェルに均等に播種し、最終容量500 μLの完全培地に播種します。注:通常、2つのSVZから20,000個の細胞を取得し、その結果、最終的な播種密度は約2,500細胞/mLになり、培養で最大の収量を達成します。 ニューロスフェア形成加湿インキュベーター内で、37°Cおよび5%CO2のin vitro(DIV)で細胞を5〜7日間インキュベートします。これらの条件下では、分化した細胞は死滅し、NSCと前駆細胞は分裂促進刺激に応答して増殖し、一次神経球として認識されるクローン性凝集体を形成します。注:EGFまたはbFGFのいずれかを使用して、ニューロスフェアの形成を誘導することができます。しかし、これら2つの成長因子は完全に代替可能ではありません。 倒立顕微鏡結合カメラを使用してニューロスフェアのサイズを確認し、ニューロスフェアが50〜100μmのサイズ範囲に達したら、ウェル内で形成されたすべての主要なニューロスフェアを10倍の倍率でカウントします。形成された一次ニューロスフェアの総数は、SVZニッチに存在するNSCの数の推定値として機能します。 10日間の期間後、各ウェルから培地を回収して継代を開始します。その後、5〜7 DIV後に継代を行いますが、一次球体が継代培養の理想的なサイズ(約100μm)に到達するまでにわずかに長い期間が必要になる場合があることに注意してください。 表1:培養培地ソリューション。 制御媒体のレシピが記載されている。あらかじめ混合されたホルモン混合溶液が作られます。ストックホルモン溶液は、示されているように事前に調製し、-20°Cで保存することができます。 細胞培養の前に、コントロール培地にEGFとbFGFを添加して、完全な培地を調製します。各コンポーネントについて、保管仕様、ストック、および作業濃度が提供されます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 2. ニューロスフィア文化の展開 ニューロスフェアの通過ニューロスフェアを含む培地をマルチウェルプレートから回収し、15 mLの遠心チューブに移します。数ミリリットルのDPBSでウェルをすすぐことにより、できるだけ多くの細胞の回収を確保します。 ニューロスフェアを300 x gで5分間遠心分離します。次に、上清を取り除きます。 200 μLの酵素溶液( 材料表を参照)をペレットに加え、チューブの底を軽くたたいて取り除きます。室温で10分間インキュベートして、ニューロスフェアの解離を促進します。 1 mLのコントロール培地を添加して酵素反応を停止させ、ピペッティングを10倍から20倍にすることで、ニューロスフェアをP1000マイクロピペットで機械的に解離します。 コントロール培地4mLを追加し、反転して混合して細胞を洗浄します。 細胞を300 x gで5分間遠心分離します。次に、上清を取り除きます。 1 mLの完全培地を加え、ペレットを再懸濁して、ピペッティングを10回上下させて細胞懸濁液を均質化します。注:ニューロスフェアの元の数とサイズが高すぎる場合は、細胞懸濁液を希釈するために完全な培地をより多く追加し、信頼性の高い細胞数を確保します。 細胞懸濁液のアリコートをトリパンブルーで1/2希釈した後、ノイバウアーチャンバーを使用して細胞懸濁液をカウントするか、自動セルカウンターを使用します。 細胞培養を拡大するには、適切な培養プレートまたはフラスコで完全な培地を使用して、10,000細胞/cm2 の密度で細胞を播種します( 表2を参照のこと)。 加湿インキュベーター内で、各継代ごとに37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーターで5〜7 DIVの細胞をインキュベートします。注:ニューロスフィア培養は、増殖能力を変えることなく、10継代を超えない範囲で、反復的な継代を通じて一貫して拡大および増殖することができます。EGFまたはbFGFのいずれかを培養に利用できます。しかし、培養物の長期的な拡大は、EGFの存在下でのみ達成できます。 自己再生アッセイニューロスフェア培養物を継代した後、96ウェルプレートに1,000個の個々の細胞をプレートし、完全な培地で最大200μLの最終容量を完成させ、5細胞/μLの培養物の最終細胞密度が得られます。注: シードされるセルの数は、できるだけ正確である必要があります。必要に応じて、播種前に細胞懸濁液量の信頼性を確保するために中間希釈液を調製します。さらに、技術的なばらつきを減らすために、条件ごとに4〜5回の繰り返しをめっきすることをお勧めします。 加湿インキュベーター内で細胞を37°Cおよび5%CO2で5日間、またはニューロスフェアが適切なサイズ(60〜100μm)に達するまでインキュベートします。ニューロスフェアの凝集を防ぐために、マルチウェルプレートを動かしたり振ったりしないでください。 ニューロスフェア形成後、カメラを取り付けた倒立位相差顕微鏡を用いて、各ウェルに形成されたニューロスフェアの数をカウントします。自己再生アッセイは、EGFまたはbFGFを別々に使用して実施できます。 NSC培養物の凍結保存注:ニューロスフィア培養物は、将来の使用のために凍結保存することができ、必要なマウスの数を最小限に抑えることができます。継代10までの細胞を保存することをお勧めします。細胞を凍結保存するには、完全培地中の細胞懸濁液1 mLを適切に標識したクライオチューブに移します。 ジメチルスルホキシド(DMSO)を最終濃度10%まで細胞懸濁液に添加し、チューブを反転させて穏やかに混合します。注:DMSOは凍結保護剤として機能しますが、細胞に対して毒性がある可能性があるため、この手順は迅速に実行する必要があります。 チューブを-80°Cの冷凍庫に入れ、1°C/分で徐々に温度を下げることができる冷凍容器を使用します。この段階的な凍結プロセスにより、凍結保存中に氷の結晶が形成されることによる細胞の損傷が防止されます。長期保存の場合は、チューブを液体窒素タンクに-196°Cに維持します。 NSC培養の解凍注:必要に応じて、細胞を解凍し、実験のために培養物を再拡大することができます。凍結したNSCを含むクライオチューブを液体窒素貯蔵タンクから取り出し、すぐに37°Cのウォーターバスに完全に解凍するまで約5分間置きます。注意:DMSOは毒性があり、細胞の生存率に影響を与える可能性があるため、入浴時間を最小限に抑えることが重要です。 解凍した細胞を、予め加温したコントロール培地5 mLが入った15 mLの遠心チューブに素早く移します。 細胞を300 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。1 mLの完全培地を加え、播種前に細胞懸濁液を均質化するために10倍に静かにピペッティングしてペレットを再懸濁します。注:解凍は細胞の生存率に影響を与える可能性があります。したがって、新しい実験のために播種する前に、少なくとも一度は細胞を継代することをお勧めします。 マイコプラズマ検査注:マイコプラズマの汚染は、細胞の健康を損ない、増殖速度に影響を与える可能性があります。したがって、マイコプラズマ試験は、実験の完全性と信頼性を確保するために重要です。DNA抽出DNA抽出のために、最低100μLの細胞培養液を採取します。上清と細胞ペレットの両方をDNA抽出に使用できます。このアリコートは抽出するまで-20°Cで保存してください。 チューブの蓋に穴を開け、サーモブロックを使用してアリコートを99°Cで15分間煮沸します。注:チューブの蓋に穴を開けると、高温での沸騰時にチューブが開くのを防ぎます。 16,900 x gで5分間遠心分離します。DNAを含む上清を新しいチューブに移します。PCR検査まで、DNAを入れたチューブを-20°Cで保存します。 マイコプラズマ検出のためのPCR8.9 μL のヌクレアーゼフリー水、3 μL の 5x 反応バッファー、1.2 μL の 25 mM MgCl2、0.25 μL の 2.5 mM dNTP、0.15 μL の Taq ポリメラーゼ、0.25 μL の各マイコプラズマ特異的プライマー、10 μM の濃度 (フォワード、Fw: 5’GATGTTTAGCCGGGTCGAGAG3′ およびリバース、Rv: 5’GATGTCAAGAGTGGGTAAGGTT3′)。 ゲノム抽出したDNAを1 μL加えます。DNAコンタミネーションを防ぐために、層流フードでPCRミックスを調製します。 95°Cで5分間の初期変性、続いて95°Cで30秒間35サイクルの変性、53°Cで1分間アニーリング、72°Cで30秒間の伸長、および72°Cで5分間の延長で、サーマルサイクラーで反応をインキュベートします。 得られたバンドのサイズ(約500 bp)を特定するには、DNA PCR産物15 μLを6倍ローディング色素溶液3 μLと混合して2%アガロースゲルにロードし、電気泳動を100 Vで40〜50分間実行します。 表2:培養に使用したプレートとフラスコ。 最も一般的に使用される播種プレートとフラスコの寸法と容量が提供されています。この表には、各容器の直径、増殖面積、および培地容量と、増殖条件(10,000細胞/cm2)で播種するNSCの数の例が含まれています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 3. ニューロスフェア培養の核形成 試薬の調製DNA調製形質転換のために、1.5 mLのチューブに25 μLのコンピテント 大腸菌 DH5α細胞を調製します。 目的のプラスミド1μL(100〜200 ng/μL)を細胞に添加し、42°Cで45秒間の熱衝撃を受けさせます。ここでは、 Snrpn 発現をサイレンシングするための短いヘアピン(sh)RNAを含むプラスミドと、コントロールプラスミドshSCRAMBLEを使用します。注:形質転換の有効性を維持するために、手順全体を通してコンピテントセルを氷上に置いてください。 形質転換細胞をLB寒天プレート上に適切な抗生物質で播種し、37°Cで18時間インキュベートします。細菌のコロニーを乱す可能性のある結露による液滴の形成を防ぐために、ペトリ皿を逆さまにしてください。注:LB培地に適切な抗生物質を添加して、形質転換細菌の増殖を排他的に許可します。 滅菌ピペットチップを使用して、個々の細菌コロニーをピッキングし、250 mLのLBを充填した三角フラスコに移して、液体培養を開始します。大きなターゲットコロニーの周囲に配置された小さなサテライトコロニーは、目的のプラスミドを取り込んでいない可能性があるため、選択しないでください。 フラスコを37°Cのオービタルシェーカーで一晩激しく振とうしながらインキュベートします。 エンドトキシンフリーのmaxiprepキットを使用し、製造元の指示に従って細菌培養物から純粋なプラスミドDNAを抽出します。DNAを適切な量のエンドトキシンフリー水に再構成して、1〜2 μg/μLのプラスミド濃度を得ます。注:maxiprepの収量は、培養物の増殖に依存します。通常、プラスミドDNAペレットを200 μLの容量に再懸濁すると、目的のDNA濃度が得られます。 プラスミドDNAを入れたチューブは、使用するまで-20°Cで保存してください。ヌクレオフェクション用のプラスミドDNAを2〜6μg含む最終容量5μLの1.5mLチューブを調製します。 材料の準備ヌクレオフェクション溶液を調製します。推奨キット( 材料表を参照)を使用する場合は、目的のヌクレオフェクションごとに1.5 mLチューブに95 μLのヌクレオフェクション溶液を調製します。通常、ピペットとキュベットがキットに含まれています。各ヌクレオフェクション条件に対してそれぞれ1つずつ調製します。 条件ごとに4 mLの予熱済み完全培地で満たされたT25フラスコを準備し、使用するまでインキュベーターに保管します。 NSCのヌクレオフェクション評価には、条件ごとに1〜2 x 106 個の個々のセルを使用します。細胞を300 x gで5分間遠心分離し、上清を除去します。 1 mLのDPBSを添加し、ピペッティングで10回上下させてペレットを再懸濁し、均一な細胞懸濁液を確保します。 遠心分離(ステップ2.1.6)を繰り返して2回目の洗浄を行い、最後にペレットを95 μLのヌクレオフェクション溶液に再懸濁します。注:洗浄手順は、コントロール培地から抗生物質を除去し、効果的なヌクレオフェクションを確保するために重要です。 95 μLの細胞を、ヌクレオフェクション用に選択した各プラスミド(合計2 μg)を5 μL含むプレミックス溶液と組み合わせます。 P200マイクロピペットを使用して、この溶液をキュベットに移し、ヌクレオフェクターデバイスに入れます。 ヌクレオフェクターシステムの最適化されたNSCプログラムを使用して、目的のプラスミドで細胞を核分離します。 エレクトロポレーションが完了したら、キットに付属のパスツールピペットを使用して、温かい完全な培地をキュベットに慎重に導入します。続いて、キュベットの内容物を、予め加温した完全な培地を含む事前に準備したT25フラスコに移します。エレクトロポレーション後、細胞死、DNA沈殿、および粘性凝集体の形成が起こる可能性があります。これをT25フラスコに移すと、細胞の生存率が低下する可能性があるため、避けてください。注:このステップは非常に重要であり、高収率のヌクレオフェクションとその後の培養生存を確保するために、できるだけ早く実行する必要があります。 有核細胞を37°Cおよび5%CO2で加湿インキュベーター内で3〜5日間インキュベートします。 核球細胞の選択戦略A:蛍光活性化セルソーティング(FACS)によるフローサイトメトリーの選択ヌクレオフェクションの3〜5日後、ステップ2.1に従ってヌクレオフェクトした培養物を継代し、得られたすべての個別化細胞を回収します。 40 μmのセルストレーナーでサンプルをろ過して細胞凝集体を除去し、Cell Sorterフローサイトメーターで分析します。注:比較結果を得るには、各条件で同じ数のセルをソートすることが重要です。 サイトメーターのソフトウェアを使用して、細胞サイズに対応する前方散乱光(FSC-A)と細胞内の複雑さに対応する側方散乱光(SSC-A)の2つの尺度に基づいて細胞をゲートアライブします。高FSC-Aおよび高SSC-Aを特徴とする生細胞の集団を選択します。注:オプションで、ソーティング前に0.1 μg/mLの4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を細胞懸濁液に加えます。これにより、死んだ細胞やアポトーシス体をゲーティングから廃棄することができます。 セルのダブレットとトリプレットを破棄するには、FSC-A と FSC-H のパラメーターをプロットします。プロットの対角線に含まれる事象 (シングレットを表す) を選択します。注:細胞がレーザーを通過すると、サイトメーターは時間の経過に伴う電圧変化を検出します。FSC-Aは信号領域を表し、FSC-Hはピーク高さを表します。一重項はFSC-AとFSC-H(プロットの対角線上)の間に比例関係を示し、セル凝集体はシグナルが長いため、FSC-Hに対してより大きなFSC-Aを示します。 使用するプラスミドによってコードされるレポーター遺伝子の蛍光強度に基づいて、核球化細胞を選択します。例えば、GFP+を使用する場合、FITC-Aの蛍光レベルとSSC-Aプロットに基づいて細胞を選択することができます。 各条件に必要な数の標的細胞を分離し、完全な培地で満たされた収集チューブに直接収集します。 10,000細胞/cm2の密度でヌクレオフェクトされたNSCを播種します。選別した細胞培養物を加湿インキュベーターで37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。 戦略B:プラスミドにコードされた抗生物質耐性を用いた選択ヌクレオフェクションの48時間後、適切な抗生物質濃度を添加して、耐性細胞を選択します。注:開始する前に、非核球細胞で複数の濃度の抗生物質をテストすることをお勧めします。最適な抗生物質濃度は、すべての非耐性細胞が排除される最小量です。例えば、NSC培養に最適な濃度は4 μg/mLの抗生物質ブラスティックスであると判断しました。 細胞を37°Cおよび5%CO2で加湿インキュベーター内で48時間インキュベートします。 抗生物質治療の48時間後、ステップ2.1に従って核球細胞を継代培養します。ニューロスフェアが小さいままの場合は、300 x g で5分間遠心分離することにより、抗生物質を培地から取り出します。細胞を再懸濁し、完全培地のみを使用してフラスコで培養します。ステップ2.1に従って細胞が拡大できるようになるまで、加湿インキュベーターで細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。