Erişkin Murin Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu, Genişlemesi ve Nükleofeksiyonu

Hayvanlarla yapılan tüm deneyler daha önce Valensiya Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve Conselleria de Agricultura, Ganadería y Pesca, Generalitat Valenciana (İspanya) tarafından yetkilendirilmiştir. 1. Nörosferlerin birincil kültürü Reaktiflerin hazırlanmasıDeiyonize suda Dulbecco’nun Fosfat Tuzlu Tamponundan (DPBS) bir tampon çözeltisi hazırlayın ve otoklavlayarak sterilize edin. Alternatif olarak, deiyonize suya 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 ve 1.8 mM KH2PO4 çözeltisi ekleyerek 0.1 M PBS pH 7.4 hazırlayın. İki adet 12 oyuklu plakayı önceden soğutulmuş DPBS ile doldurun ve bunları buz üzerinde tutun: biri diseksiyondan önce tüm beyni korumak için kullanılacak, diğeri ise doku işlemeye kadar disseke SVZ’leri koruyacaktır. Papain içeren enzimatik karışımı aşağıda anlatıldığı gibi hazırlayın.Earl’ün Dengeli Tuz Çözeltisinde (EBSS) EDTA / L-sistein ayrışma çözeltisini her biri 0.2 mg / mL’lik bir nihai konsantrasyona hazırlayın. Tam çözünme elde etmek için, tüpü 37 ° C’de bir su banyosunda inkübe edin. 12 U / mL papain’i EDTA / L-sistein çözeltisi içinde çözün. Beyin başına 500 μL enzimatik çözelti kullanılacağını düşünün. Enzim tamamen eriyene kadar papain solüsyonunu 37 ° C’lik bir su banyosunda yaklaşık 20 dakika boyunca uygulayın. Enzimatik karışımı bir şırınga ve 0,22 μm gözenekli bir filtre ile filtreyle sterilize edin ve kullanana kadar 4 °C’de tutun.NOT: Papain, 37 °C’de 30 dakika sonra aktif hale gelir ve 4 °C’de 12 saat saklanabilir. Tablo 1’e göre hormon karışım solüsyonunu ekleyerek kontrol kültürü ortamını hazırlayın ve nitroselüloz 0.22 μm gözenekli filtreler kullanarak filtreyle sterilize edin. Ortamı 4 °C’de tutun ve kullanmadan önce 37 °C’lik bir su banyosunda ısıtın. Tablo 1’e göre kullanmadan hemen önce kontrol ortamını EGF ve bFGF ile destekleyerek tüm ortamı hazırlayın. Filtreleme ile mitojenler kaybolabileceğinden tüm ortamı filtrelemeyin. Beyin ekstraksiyonu ve SVZ diseksiyonuNOT: Farelerin ötenaziden önce yiyecek ve suya ücretsiz erişimine izin verilir. 8 ila 16 haftalık C57BL / 6 fareler kullanılır. Her iki cinsiyet de hazırlıkta gözle görülür farklılıklar olmadan kullanılır.Ameliyattan önce diseksiyon aletlerini otoklavlayarak sterilize edin. Ardından neşterleri, cımbızları, makasları ve spatulaları etanol ile doldurulmuş bir behere batırın. Her çalışma yüzeyini etanol ile iyice temizleyin. Fareyi CO2 doz aşımı ile feda edin ve servikal çıkık ile onaylayın. Beyin dokusu kontaminasyonu olasılığını en aza indirmek için kafaya% 70 etanol püskürtün. Makas kullanarak farenin başını vücudun geri kalanından ayırın. Kafatası tamamen ortaya çıkana kadar rostro-kaudal eksen boyunca küçük bir makasla kafatasının üzerindeki cildi kesin. Başlangıçta kafatasını sagital sütür boyunca küçük bir makasla keserek beyni açığa çıkarın ve ardından ince cımbız kullanarak kemikleri çıkarın. Bu adım sırasında kafatasının altındaki beyin dokusuna herhangi bir zarar vermemeye dikkat edin. Bir spatula kullanarak beyni kafatasından dikkatlice çıkarın ve soğuk DPBS içeren 12 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Diseksiyon tamamlanana kadar plakayı buz üzerinde tutun. Tüm beyni, diseksiyonun yapılacağı silikon pedin üzerine aktarın ve beynin üzerine birkaç damla soğuk DPBS uygulayın (Şekil 1A). Beynin rostral ucunda bulunan OB’yi ve kaudal kısımda bulunan beyinciği çıkarmak için bir neşter kullanın ve beynin her iki lateral ventrikülü içeren merkezi kısmını koruyun (Şekil 1B). Beyni uzunlamasına fissür boyunca iki hemisfere bölün ve ardından her iki hemisferin diseksiyonuna ayrı ayrı devam edin (Şekil 1C). Bir yarım küre ile çalışarak, medial alan yukarı bakacak şekilde yeniden yönlendirin. Beyni korpus kallozum hattı boyunca açın, korteks ve striatumu hipokampus, septum ve diensefalondan ayırın, böylece lateral ventrikülleri açığa çıkarın (Şekil 1D).NOT: SVZ, ventrikül boşluğu ile striatum arasında yer alır, bu nedenle sonraki adımlar, SVZ’yi çevreleyen dokudan mümkün olduğunca doğru bir şekilde izole etmeyi amaçlar. Ventriküllerin ventral sınırını takip eden hipokampus, septum ve diensefalonu çıkarın (Şekil 1E,F), SVZ’nin rostral ve kaudal uçlarının ötesindeki dokuyu (Şekil 1G) ve korpus kallozumdan sonraki korteksi çıkarın (Şekil 1H,I). Dokuyu, SVZ yana bakacak şekilde eğin (Şekil 1J), SVZ’nin altındaki striatal dokunun çıkarılmasına izin verin (Şekil 1K) ve NSC’leri içeren ince bir doku parçası elde edin (Şekil 1L). Aynı fareden alınan her iki disseke SVZ’yi, doku işleme başlayana kadar soğuk, steril DPBS içeren 12 oyuklu bir plakada saklayın.NOT: Her iki SVZ’nin bir beyinden diseksiyonu 10 dakika sürmelidir. Daha uzun süre hücre canlılığını etkileyebilir. Kültürlerin veriminin artması gerekiyorsa, aynı yaş, cinsiyet, genetik arka plan ve genotipe sahip birden fazla fareden alınan SVZ’ler bir araya getirilebilir. NSC’lerin izolasyonu ve tohumlanmasıDokunun ayrışmasını kolaylaştırmak için her SVZ’yi 4-5 küçük parçaya bölün.NOT: Bu adımdan itibaren, tüm prosedür steril koşullarda laminer akış başlığında gerçekleştirilmelidir. Doğranmış SVZ’leri steril bir plastik Pasteur pipeti kullanarak 15 mL’lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Plakada parça kalmadığından emin olun. Tüpün dibindeki doku tortusuna izin verin ve kalan DPBS’yi çıkarın. Beyin başına 500 μL filtrelenmiş papain içeren enzimatik karışım (2 SVZ) ekleyin ve tüpleri 37 ° C’de 30 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her numuneye 37 °C’de önceden ısıtılmış 5 mL kontrol ortamı ekleyin. Numuneleri 300 x g’da 5 dakika santrifüjleyin. Ardından, bir mikropipet veya vakum pompası kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın. 1 mL kontrol ortamı ekleyin ve homojen bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar ateşle parlatılmış bir Pasteur cam pipet kullanarak peleti 10x ila 20x yukarı ve aşağı pipetleyerek dikkatlice mekanik olarak ayırın.DİKKAT: Bu, protokoldeki en kritik adımlardan biridir, çünkü aşırı veya yetersiz ayrıştırma kültürlerin verimini olumsuz yönde etkileyecektir. 4 mL kontrol ortamı ekleyin ve hücreleri yıkamak için ters çevirerek karıştırın. 300 x g’da 5 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı çıkarın. 1 mL tam ortam ekleyin ve hücre süspansiyonunu homojenize etmek için 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunun 1/2’sini tripan mavisi ile seyrelttikten sonra mikroskop altında bir Neubauer odası kullanarak hücre süspansiyonunu sayın veya otomatik bir hücre sayacı kullanın. Kültürlerin tek hücre düzeyinde ayrıştırıldığından emin olun. Hücre süspansiyonu hazırlandıktan sonra, elde edilen hücreleri, 500 μL tam ortamın nihai hacminde 48 oyuklu bir plakanın 8 oyuğuna eşit olarak tohumlayın.NOT: Genellikle iki SVZ’den 20.000 hücre elde ederiz, bu da kültürlerde maksimum verimi elde etmek için yaklaşık 2.500 hücre/mL’lik bir nihai tohumlama yoğunluğu ile sonuçlanır. Nöroküre oluşumuHücreleri 5 ila 7 gün boyunca in vitro (DIV) nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C ve% 5 CO2’de inkübe edin. Bu koşullar altında, farklılaşmış hücreler ölürken, NSC’ler ve progenitörler mitojenik stimülasyona yanıt olarak çoğalır ve birincil nörosferler olarak tanınan klonal agregatlar oluşturur.NOT: Nörosfer oluşumunu indüklemek için EGF veya bFGF kullanılabilir. Bununla birlikte, bu iki büyüme faktörü tamamen ikame edilemez. Ters mikroskopla birleştirilmiş bir kamera kullanarak nörosferlerin boyutunu kontrol edin ve nörosferler 50 ila 100 μm’lik bir boyut aralığına ulaştığında, kuyuda oluşan tüm birincil nöroküreleri 10x büyütmede sayın. Oluşan toplam birincil nörosfer sayısı, SVZ nişinde bulunan NSC’lerin sayısının bir tahmini olarak hizmet eder. 10 günlük bir süre sonra, geçmeye başlamak için kültür ortamını her kuyucuktan toplayın. 5 ila 7 DIV’den sonra müteakip geçiş yapın, ancak birincil kürelerin alt kültürleme için ideal boyuta (yaklaşık 100 μm) ulaşmak için biraz daha uzun bir süre gerektirebileceğini belirtmekte fayda var. Tablo 1: Kültür ortamı çözümleri. Kontrol ortamının tarifi açıklanmıştır. Önceden karıştırılmış bir hormon karışımı çözeltisi yapılır. Stok hormon çözeltileri belirtildiği gibi önceden hazırlanabilir ve -20 ° C’de saklanabilir. Hücre kültüründen önce, tam ortam hazırlamak için kontrol ortamını EGF ve bFGF ile destekleyin. Her bileşen için depolama özellikleri, stoklar ve çalışma konsantrasyonları sağlanmıştır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. 2. Nörosfer kültürlerinin genişlemesi Nörosferlerin geçişiNörosferleri içeren ortamı çok kuyulu plakalardan toplayın ve bunları 15 mL’lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Kuyuları birkaç mililitre DPBS ile durulayarak mümkün olduğunca çok hücrenin geri kazanılmasını sağlayın. Nöroküreleri 300 x g’da 5 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı çıkarın. Peletin içine 200 μL enzimatik çözelti ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve yerinden çıkarmak için tüpün altına hafifçe vurun. Nörosferlerin ayrışmasını kolaylaştırmak için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Enzimatik reaksiyonu durdurmak için 1 mL kontrol ortamı ekleyin ve nörosferleri bir P1000 mikropipet ile 10 ila 20 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik olarak ayırın. Kontrol ortamından 4 mL’lik ek bir hacim ekleyin ve hücreleri yıkamak için ters çevirerek karıştırın. Hücreleri 300 x g’da 5 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı çıkarın. 1 mL tam ortam ekleyin ve 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek hücresel süspansiyonu homojenize etmek için peleti yeniden süspanse edin.NOT: Nörokürelerin orijinal sayısı ve boyutu çok yüksekse, güvenilir bir hücre sayımı sağlamak için hücre süspansiyonunu seyreltmek için daha fazla tam ortam ekleyin. Hücre süspansiyonunun 1/2’sini tripan mavisi ile seyrelttikten sonra bir Neubauer odası kullanarak hücre süspansiyonunu sayın veya otomatik bir hücre sayacı kullanın. Hücre kültürünü genişletmek için, uygun bir kültür plakasında veya şişede tam ortam kullanarak 10.000 hücre /cm2 yoğunlukta tohum hücreleri (bkz. Tablo 2). Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C’de ve her geçiş için% 5 CO2’de 5 ila 7 DIV için inkübe edin.NOT: Nörosfer kültürleri, proliferasyon kapasitelerini değiştirmeden, 10 pasajı aşmayacak şekilde tekrarlanan alt kültürleme yoluyla tutarlı bir şekilde genişletilebilir ve çoğaltılabilir. Kültür için EGF veya bFGF kullanılabilir; bununla birlikte, kültürlerin uzun vadeli genişlemesi ancak EGF’nin varlığında sağlanabilir. Kendini yenileme testiNörosfer kültürlerini geçtikten sonra, 96 oyuklu bir plakada 1.000 ayrı hücreyi plakalayın, tam ortam ile 200 μL’lik bir nihai hacme kadar tamamlayın, bu da 5 hücre / μL’lik kültürlerin nihai hücre yoğunluğu ile sonuçlanır.NOT: Tohumlanan hücre sayısı mümkün olduğunca doğru olmalıdır. Gerekirse, kaplamadan önce güvenilir bir hücre süspansiyon hacmi sağlamak için ara seyreltmeler hazırlayın. Ayrıca, teknik değişkenliği azaltmak için koşul başına 4 ila 5 kopya plakalanması önerilir. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C ve% 5 CO2’de 5 gün boyunca veya nörosferler yeterli bir boyuta (60 ila 100 μm) ulaşana kadar inkübe edin. Nörosfer toplanmasını önlemek için çok kuyulu plakayı hareket ettirmekten veya sallamaktan kaçının. Nörosfer oluşumundan sonra, bağlı bir kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir faz kontrast mikroskobu kullanarak her bir kuyucukta oluşan nörosferlerin sayısını sayın. Kendini yenileme testi, EGF veya bFGF ayrı ayrı kullanılarak gerçekleştirilebilir. NSC kültürlerinin dondurularak saklanmasıNOT: Nörosfer kültürleri, gereken fare sayısını en aza indirerek ileride kullanılmak üzere dondurularak saklanabilir. Hücrelerin 10. pasaja kadar korunmasını öneririz.Hücreleri kriyoprezervasyon yapmak için, hücre süspansiyonunun 1 mL’sini tam ortamda uygun şekilde etiketlenmiş bir kriyotüpe aktarın. Hücre süspansiyonuna ‘luk bir nihai konsantrasyona kadar dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin ve tüpleri ters çevirerek hafifçe karıştırın.NOT: DMSO bir kriyoprotektan görevi görür ancak hücreler için toksik olabilir, bu nedenle bu adım hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Tüpleri, 80 °C/dk’da kademeli bir sıcaklık düşüşü sağlayan bir dondurma kabı kullanarak -1 °C’lik bir dondurucuya yerleştirin. Bu kademeli dondurma işlemi, kriyoprezervasyon sırasında buz kristallerinin oluşumundan kaynaklanan hücre hasarını önler. Uzun süreli depolama için tüpleri -196 °C’de sıvı nitrojen tankında tutun. NSC kültürlerinin çözülmesiNOT: Gerektiğinde, hücreler çözülebilir ve kültürler deneyler için yeniden genişletilebilir.Donmuş NSC’ler içeren kriyotüpleri sıvı nitrojen depolama tankından çıkarın ve hemen 37 °C’lik bir su banyosuna tamamen çözülene kadar, yaklaşık 5 dakika yerleştirin.DİKKAT: DMSO toksik olduğundan ve hücre canlılığını etkileyebileceğinden banyo süresini en aza indirmek çok önemlidir. Çözülmüş hücreleri, 5 mL önceden ısıtılmış kontrol ortamı içeren 15 mL’lik bir santrifüj tüpüne hızla aktarın. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g’da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. 1 mL tam ortam ekleyin ve tohumlamadan önce hücresel süspansiyonu homojenize etmek için 10 kat yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek peleti yeniden süspanse edin.NOT: Çözülme hücre canlılığını etkileyebilir; Bu nedenle, yeni deneyler için tohumlamadan önce hücrelerin en az bir kez geçirilmesi önerilir. Mikoplazma testiNOT: Mikoplazma kontaminasyonu, büyüme oranlarını etkileyerek hücre sağlığını tehlikeye atabilir. Bu nedenle, mikoplazma testi, deneylerin bütünlüğünü ve güvenilirliğini sağlamak için çok önemlidir.DNA ekstraksiyonuDNA ekstraksiyonu için en az 100 μL hücre kültürü toplayın. DNA ekstraksiyonu için hem süpernatan hem de hücre peleti kullanılabilir. Bu alikotu ekstraksiyona kadar -20 ° C’de saklayın. Tüp kapağını delin ve alikotu bir termoblok kullanarak 99 °C’de 15 dakika kaynatın.NOT: Tüp kapaklarının delinmesi, yüksek sıcaklıklarda kaynatma sırasında tüplerin açılmasını önler. 16.900 x g’da 5 dakika santrifüjleyin. DNA’yı içeren süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. PCR testine kadar tüpü DNA ile birlikte -20 °C’de saklayın. Mikoplazma tespiti için PCRAşağıdaki bileşenleri kullanarak PCR karışımını hazırlayın: 8.9 μL nükleaz içermeyen su, 3 μL 5x reaksiyon tamponu, 1.2 μL 25 mM MgCl2, 0.25 μL 2.5 mM dNTP, 0.15 μL Taq polimeraz ve 0.25 μL 10 μM konsantrasyonda her bir mikoplazmaya özgü primer (İleri, Fw: 5’GATGTTTAGCCGGGTCGAGAG3′ ve Ters, Rv: 5’GATGTCAAGAGTGGGTAAGGTT3’). 1 μL genomik ekstrakte edilmiş DNA ekleyin. DNA kontaminasyonunu önlemek için PCR karışımını laminer bir akış başlığında hazırlayın. Reaksiyonu bir termal döngüleyicide aşağıdaki gibi inkübe edin: 95 ° C’de 5 dakika boyunca ilk denatürasyon, ardından 30 saniye boyunca 95 ° C’de 35 döngü denatürasyon, 53 ° C’de 1 dakika tavlama, 72 ° C’de 30 saniye uzatma ve 72 ° C’de 5 dakika boyunca son bir uzatma. Elde edilen bandın boyutunu (yaklaşık 500 bp) belirlemek için, 3 μL 6x yükleme boyası çözeltisi ile karıştırılmış 15 μL DNA PCR ürününü %2’lik bir agaroz jel üzerine yükleyin ve elektroforezi 100 V’ta 40 ila 50 dakika çalıştırın. Tablo 2: Kültür için kullanılan plakalar ve şişeler. En yaygın olarak kullanılan tohumlama plakalarının ve şişelerinin boyutları ve hacimleri verilmiştir. Tablo, genişleme koşulları altında (10.000 hücre/cm2) tohumlanacak NSC sayısının bir örneği ile birlikte her bir gemi için kullanılan çapı, büyüme alanını ve orta hacmi içerir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. 3. Nörosfer kültürlerinin nükleofeksiyonu Reaktiflerin hazırlanmasıDNA hazırlığıTransformasyon için 1.5 mL’lik bir tüpte 25 μL yetkin E. coli DH5α hücresi hazırlayın. Hücrelere 1 μL ilgilenilen plazmid (100 ila 200 ng / μL’de) ekleyin ve bunları 45 s boyunca 42 ° C’de bir termal şoka maruz bırakın. Burada, Snrpn ekspresyonunu susturmak için kısa bir firkete (sh)RNA içeren bir plazmit ve bir kontrol plazmidi shSCRAMBLE kullanılır.NOT: Transformasyon etkinliğini korumak için prosedür boyunca yetkin hücreleri buz üzerinde tutun. Dönüştürülmüş hücreleri uygun antibiyotik ile LB agar plakaları üzerine yerleştirin ve 37 ° C’de 18 saat inkübe edin. Bakteri kolonilerini rahatsız edebilecek yoğuşma nedeniyle damlacık oluşumunu önlemek için Petri kaplarını ters çevirin.NOT: Yalnızca dönüştürülmüş bakterilerin büyümesine izin vermek için LB kültür ortamına uygun antibiyotikler ekleyin. Steril bir pipet ucu kullanarak, tek tek bakteri kolonilerini seçin ve sıvı bir kültür başlatmak için bunları daha önce 250 mL LB ile doldurulmuş bir Erlenmeyer şişesine aktarın. İstenen plazmidi içermemiş olabilecekleri için, daha büyük hedef kolonilerin etrafına yerleştirilmiş küçük uydu kolonilerini seçmekten kaçının. Gece boyunca 37 °C’de bir orbital çalkalayıcı üzerinde kuvvetlice çalkalarken şişeyi inkübe edin. Endotoksin içermeyen bir maxiprep kiti kullanın ve üreticinin talimatlarını izleyerek bakteri kültürlerinden saf plazmit DNA’sını çıkarın. 1 ila 2 μg/μL’lik bir plazmit konsantrasyonu elde etmek için DNA’yı uygun hacimde endotoksin içermeyen suda sulandırın.NOT: Maxiprep verimi, kültür büyümesine bağlıdır. Genellikle, plazmit DNA peletinin 200 μL’lik bir hacimde yeniden askıya alınması, istenen DNA konsantrasyonu ile sonuçlanacaktır. Tüpü plazmid DNA ile birlikte kullanana kadar -20 °C’de saklayın. Nükleofeksiyon için amaçlanan 2 ila 6 μg plazmit DNA içeren 5 μL’lik bir nihai hacme sahip 1.5 mL’lik bir tüp hazırlayın. Malzeme hazırlamaNükleofeksiyon çözeltisini hazırlayın. Önerilen kiti kullanıyorsanız (Malzeme Tablosuna bakınız), istenen her nükleofeksiyon için 1,5 mL’lik bir tüpte 95 μL nükleofeksiyon solüsyonu hazırlayın. Pipetler ve küvetler genellikle kite dahildir. Her nükleofeksiyon koşulu için her birinden bir tane hazırlayın. Her koşulda 25 mL önceden ısıtılmış tam ortam ile doldurulmuş bir T4 şişesi hazırlayın ve kullanana kadar inkübatörde tutun. NSC’lerin nükleofeksiyonuDeğerlendirme için koşul başına 1 ila 2 x 106 ayrı hücre kullanın. Hücreleri 300 x g’da 5 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı çıkarın. 1 mL DPBS ekleyin ve homojen bir hücresel süspansiyon sağlamak için peleti 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. İkinci bir yıkama için santrifüjlemeyi (adım 2.1.6) tekrarlayın ve son olarak peleti 95 μL nükleofeksiyon çözeltisinde yeniden süspanse edin.NOT: Yıkama adımları, antibiyotikleri kontrol ortamından uzaklaştırmak ve etkili nükleofeksiyonu sağlamak için çok önemlidir. 95 μL hücreyi, nükleofeksiyon için seçilen her bir plazmitten (toplam 2 μg) 5 μL içeren önceden karıştırılmış bir çözelti ile birleştirin. Bir P200 mikropipet kullanarak bu çözeltiyi bir küvete aktarın ve nükleofektör cihazına yerleştirin. Nükleofektör sisteminin optimize edilmiş NSC programını kullanarak hücreleri istenen plazmitlerle çekirdeklendirin. Elektroporasyonu tamamladıktan sonra, kitte verilen Pasteur pipetlerini kullanarak küvete sıcak komple ortamı dikkatlice yerleştirin. Daha sonra, küvetin içeriğini önceden ısıtılmış tam ortam içeren önceden hazırlanmış bir T25 şişesine aktarın. Elektroporasyondan sonra hücre ölümü, DNA çökelmesi ve viskoz bir agrega oluşumu olabilir. Hücre sağkalımını azaltabileceğinden bunu T25 şişesine aktarmaktan kaçının.NOT: Bu adım çok önemlidir ve yüksek bir nükleofeksiyon verimi ve ardından kültür sağkalımı sağlamak için mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirilmelidir. Nükleofected hücreleri 37 ° C’de ve% 5 CO2’de nemlendirilmiş bir inkübatörde 3 ila 5 gün inkübe edin. Nükleofecte hücrelerin seçimiStrateji A: Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile akış sitometrisi seçimi3 ila 5 günlük nükleofeksiyondan sonra, adım 2.1’i izleyerek nükleofected kültürleri geçin ve elde edilen tüm bireyselleştirilmiş hücreleri toplayın. Hücre agregalarını çıkarmak için numuneleri 40 μm’lik bir hücre süzgecinden süzün ve bunları hücre sıralayıcı akış sitometresi ile analiz edin.NOT: Karşılaştırmalı sonuçlar elde etmek için her koşulda aynı sayıda hücreyi sıralamak çok önemlidir. Sitometrenin yazılımını kullanarak, iki ölçüme dayalı olarak canlı hücreleri kapılayın: hücre boyutuna karşılık gelen ileri dağınık ışık (FSC-A) ve hücre içi karmaşıklığa karşılık gelen yandan dağınık ışık (SSC-A). Yüksek FSC-A ve yüksek SSC-A ile karakterize edilen canlı hücre popülasyonunu seçin.NOT: İsteğe bağlı olarak, sıralamadan önce hücre süspansiyonuna 0.1 μg / mL 4 “, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin. Bu, ölü hücrelerin ve apoptotik cisimlerin kapıdan atılmasına izin verecektir. FSC-A’ya karşı FSC-H parametrelerini çizerek hücre çiftlerini ve üçlülerini atın. Tekli öğeleri temsil eden arsanın köşegeninde yer alan olayları seçin.NOT: Hücreler lazerden geçtiğinde, sitometre zamanla voltaj değişikliklerini algılar. FSC-A sinyal alanını temsil eder ve FSC-H tepe yüksekliğini ifade eder. Tekliler, FSC-A ve FSC-H (grafiğin köşegeninde bulunur) arasında orantılı bir ilişki gösterirken, hücre agregaları, daha uzun bir sinyal nedeniyle FSC-H’ye göre daha büyük bir FSC-A gösterir. Kullanılan plazmit tarafından kodlanan raportör genin floresan yoğunluğuna dayalı olarak çekirdekli hücreleri seçin. Örneğin, GFP + kullanılırken, hücreler SSC-A grafiğine karşı FITC-A floresan seviyelerine göre seçilebilir. Her koşul için istenen sayıda hedef hücreyi izole edin ve bunları doğrudan tam ortamla doldurulmuş bir toplama tüpünde toplayın. 10.000 hücre/cm2 yoğunlukta tohum çekirdekli NSC’ler. Sıralanan hücre kültürlerini nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C ve% 5 CO2’de inkübe edin. Strateji B: Plazmidde kodlanmış antibiyotik direnci kullanılarak seçim48 saatlik nükleofeksasyondan sonra, dirençli hücreleri seçmek için uygun antibiyotik konsantrasyonunu ekleyin.NOT: Başlamadan önce, nükleofected olmayan hücreler üzerinde antibiyotiğin çoklu konsantrasyonlarının test edilmesi önerilir. Optimal antibiyotik konsantrasyonu, tüm dirençli olmayan hücrelerin elimine edildiği en düşük miktardır. Örneğin, NSC kültürleri için optimal bir 4 μg/mL antibiyotik blasticidin konsantrasyonu belirledik. Hücreleri 37 ° C’de ve% 5 CO2’de nemlendirilmiş bir inkübatörde 48 saat inkübe edin. 48 saatlik antibiyotik tedavisinden sonra, nükleofekte edilmiş hücreleri adım 2.1’e göre alt kültüre alın. Nöroküreler küçük kalırsa, antibiyotiği 5 dakika boyunca 300 x g’da santrifüjleme ile kültür ortamından çıkarın. Hücreleri yeniden süspanse edin ve sadece tam ortam kullanarak bir şişede kültürleyin. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO2’de nemlendirilmiş bir inkübatörde adım 2.1’i izleyerek genişleyene kadar inkübe edin.