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Neuroscience

Isolierung, Expansion und Nukleofektion von neuralen Stammzellen aus der adulten subventrikulären Zone der Maus

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/66651
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1Instituto de Biotecnología y Biomedicina (BIOTECMED), Departamento de Biología Celular, Biología Funcional y Antropología Física,Universitat de València

Summary

Hier beschreiben wir ein Nukleofektionssystem, das die Effizienz der Genübertragung in expandierten neuralen Stammzellen (NSCs) verbessern soll, die aus der adulten subventrikulären Zone von Mäusen isoliert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die Genstörung in NSCs signifikant verbessert, die Wirksamkeit traditioneller Transfektionsprotokolle übertrifft und die Überlebensrate der Zellen erhöht.

Abstract

Die Isolierung und Expansion von neuralen Stammzellen (NSCs) aus der subventrikulären Zone (SVZ) des adulten Mausgehirns kann in einem Medium erreicht werden, das mit dem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) als Mitogene ergänzt wird, wodurch klonale Aggregate entstehen, die als Neurosphären bekannt sind. Dieses In-vitro-System ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung des NSC-Potenzials. Die Transfektion von siRNAs oder Genen, die in Plasmiden transportiert werden, kann verwendet werden, um Störungen der Genexpression zu induzieren und die NSC-Biologie zu untersuchen. Die Verabreichung exogener Nukleinsäuren an NSC-Kulturen ist jedoch aufgrund der geringen Effizienz der Transfektion von Zellen des Zentralnervensystems (ZNS) eine Herausforderung. Hier stellen wir ein verbessertes Nukleofektionssystem vor, das eine hohe Effizienz des Gentransfers in expandierten NSCs aus adultem murinem SVZ erreicht. Wir zeigen, dass diese relativ einfache Methode die Genstörung bei adulten NSCs verstärkt und traditionelle Transfektionsprotokolle mit Überlebensraten von über 80% übertrifft. Darüber hinaus kann diese Methode auch in primär isolierten NSCs angewendet werden, was einen entscheidenden Fortschritt in der Genfunktionsforschung durch Genexpressionsmanipulation durch Knockdown oder Überexpression in Neurosphärenkulturen darstellt.

Introduction

Neuronale Stammzellen (NSCs) sind multipotente Stammzellen, die im Gehirn beheimatet sind. Diese Zellen besitzen die Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und sich in die drei neuronalen Linien Astrozyten, Oligodendrozyten und Neuronen zu differenzieren1. Folglich spielen NSCs eine entscheidende Rolle bei der adulten Neurogenese bei Säugetieren, einem Prozess, bei dem neue Neuronen im Gehirn gebildet werden2. NSCs befinden sich überwiegend in zwei Regionen innerhalb des adulten Gehirns, die als neurogene Nischen bezeichnet werden: die subventrikuläre Zone (SVZ) entlang der Wände der lateralen Ventrikel und die subgranuläre Zone (SGZ) innerhalb des Gyrus dentatus des Hippocampus 3,4. NSCs (auch B-Zellen genannt) in der SVZ, der aktivsten neurogenen Nische der erwachsenen Maus, erneuern sich selbst und produzieren transitverstärkende Vorläuferzellen (TAPs oder C-Zellen), die sich anschließend zu Neuroblasten (A-Zellen) differenzieren. Diese Neuroblasten wandern durch den rostralen Migrationsstrom (RMS) zu den Riechkolben (OB), wo sie sich vollständig zu Interneuronen differenzieren und sich in die bereits bestehenden Schaltkreiseintegrieren 3,4,5,6.

Das Verständnis des komplizierten Zusammenspiels von molekularen Signalen und Signalen, die NSCs in diesen Nischen regulieren, ist wichtig, um ihr Potenzial für therapeutische Anwendungen zu nutzen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Methoden entwickelt, um diese Zellpopulation zu untersuchen, die von der selektiven Primärkultur von NSCs bis hin zur Zellselektion unter Verwendung von Oberflächenmarkernreichen 7,8,9,10. Das vorliegende Manuskript beschreibt die Isolierung und Kultivierung von SVZ-NSCs in vitro unter Verwendung eines serumfreien Selektivmediums, das beide Mitogene enthält: basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und epidermaler Wachstumsfaktor (EGF). Dieses Medium erleichtert die Zellproliferation und erhält die Stammheit von NSCs, die aus dem SVZ adulter Mäusegehirne gewonnen werden, die in vitro klonale, dreidimensionale, nicht adhärente Aggregate bilden, die als Neurosphären bekannt sind9. Neurosphärenkulturen dienen als kontrollierte Plattform für die Manipulation und Untersuchung der molekularen Mechanismen und Faktoren, die die Proliferation, Selbsterneuerung, Differenzierung und das Überleben von NSC beeinflussen11. Insbesondere die Anzahl der in der Kultur gebildeten primären Neurosphären ermöglicht eine Schätzung der Anzahl der in der SVZ in vivo vorhandenen NSCs, was sie zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Erkrankungen auf den adulten NSC-Pool macht12,13. Darüber hinaus können NSCs, sobald die Primärkultur etabliert ist, neue Aggregate (sekundäre Neurosphären) erzeugen, wenn sie unter Proliferationsbedingungen symmetrische Teilungen durchlaufen14. Daher kann die Aussaat von sekundären Neurosphärenzellen mit niedriger Dichte (klonaler Assay) verwendet werden, um die Selbsterneuerungsrate dieser Kulturen zu beurteilen 4,15,16,17.

Trotz des Potenzials von Neurosphären bei der Aufdeckung der Mechanismen, die die NSC-Regulation steuern, stellen einige Forscher die Gültigkeit von In-vitro-Ergebnissen in Frage und argumentieren, dass die künstlichen Bedingungen, unter denen Zellen wachsen, die komplizierte In-vivo-Mikroumgebung neurogener Nischen möglicherweise nicht originalgetreu replizieren 18,19,20,21,22. Ein weiterer umstrittener Punkt dreht sich um die beobachtete Heterogenität in Neurosphären. Nichtsdestotrotz wird angenommen, dass diese Variabilität die symmetrische und asymmetrische Aufteilung der NSCs widerspiegelt, die natürlicherweise in vivo vorkommen 23,24. Darüber hinaus hat die jüngste Validierung die Verwendung von NSZ-Kulturen zur Vorhersage von Mechanismen unterstützt, die in der neurogenen SVZ-Nische in vivo wirken, und mehrere Studien haben gezeigt, dass NSCs, die in vitro kultiviert wurden, das in vivo beobachtete transkriptomische Profil genau beibehalten 11,25.

Daher dienen Neurosphärenkulturen nicht nur als Methode zur Erforschung der Proliferations- und Differenzierungsfähigkeiten von NSC, sondern bieten auch ein System, um den Einfluss von Genen zu untersuchen, die die NSC-Biologie steuern. Eine zentrale Technik zur Untersuchung der Genfunktion in NSCs ist die Störung der Genexpression. siRNAs oder Gene, die durch Plasmide transportiert werden, können in Zellkulturen transfiziert werden, was zu einem Knockdown oder einer Hochregulierung des Zielgens führt. Dieser vielseitige Ansatz reduziert den Zeit- und Kostenaufwand im Vergleich zur Etablierung von Kulturen mit bedingten Knockout-Mäusen erheblich und stellt einen vielversprechenden Weg dar, um die genetischen Grundlagen der Neurogenese zu entschlüsseln und therapeutische Perspektiven zu erkunden. Die Veränderung der Expression spezifischer Gene in NSCs ermöglicht die Modulation ihres Verhaltens und beeinflusst wichtige biologische Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Migration. Die Aussicht auf die Transfizierung von NSCs, insbesondere in Neurosphären von Mäusen, stellt jedoch eine große Herausforderung dar. Die dreidimensionale Struktur der Neurosphären beeinträchtigt die Effizienz der Transfektion, was oft zu geringen Raten erfolgreicher exogener Nukleinsäureabgabe führt, was das Ausmaß der genetischen Manipulation einschränkt 26,27. Darüber hinaus können Transfektionsverfahren die Lebensfähigkeit und Funktionalität der Zellen nachteilig beeinflussen27. In diesem Zusammenhang stellen wir das Nukleofektionssystem als eine Methode vor, um Zellschäden zu mildern, eine hohe Überlebensrate zu erreichen und eine höhere Wirksamkeit in Gentransfer-Assays zu gewährleisten, die zur Störung von NSC-Kulturen verwendet werden.

Dieses Manuskript zielt darauf ab, das Verfahren zur Isolierung, Expansion und Nukleofektion von NSCs aus der adulten neurogenen SVZ-Nische zu veranschaulichen, um Gene mit Hilfe des Neurosphärenkultursystems zu stören. Diese Methode übertrifft die Wirksamkeit herkömmlicher Transfektionsprotokolle und bietet signifikant höhere Überlebensraten und eine verbesserte Effizienz der Genübertragung zwischen den Zielzellen.

Protocol

Alle Tierversuche wurden zuvor von der Ethikkommission der Universität Valencia genehmigt und von der Conselleria de Agricultura, Ganadería y Pesca, Generalitat Valenciana (Spanien) genehmigt. 1. Primäre Kultur der Neurosphären Vorbereitung der ReagenzienEine Pufferlösung aus Dulbecco’s Phosphatsalzpuffer (DPBS) in deionisiertem Wasser herstellen und durch Autoklavieren sterilisieren. Alternativ können 0,1 M PBS pH 7,4 durch Zugabe von 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,8 mM KH2PO4 Lösung in entionisiertem Wasser hergestellt werden. Füllen Sie zwei 12-Well-Platten mit zuvor abgekühlten DPBS und bewahren Sie sie auf Eis auf: Eine wird verwendet, um das gesamte Gehirn vor der Dissektion zu konservieren, und die andere bewahrt präparierte SVZs bis zur Gewebeverarbeitung auf. Bereiten Sie eine papainhaltige enzymatische Mischung wie unten beschrieben vor.Bereiten Sie EDTA/L-Cystein-Dissoziationslösung in Earl’s Balanced Salt Solution (EBSS) auf eine Endkonzentration von jeweils 0,2 mg/ml vor. Um eine vollständige Auflösung zu erreichen, inkubieren Sie das Röhrchen in einem Wasserbad bei 37 °C. 12 U/ml Papain in EDTA/L-Cysteinlösung auflösen. Bedenken Sie, dass pro Gehirn 500 μl enzymatische Lösung verwendet werden. Papainlösung in einem Wasserbad bei 37 °C für ca. 20 min geben, bis sich das Enzym vollständig aufgelöst hat. Sterilisieren Sie die enzymatische Mischung mit einer Spritze und einem 0,22-μm-Porenfilter und halten Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C.HINWEIS: Papain wird nach 30 Minuten bei 37 °C aktiviert und kann 12 Stunden bei 4 °C gelagert werden. Bereiten Sie das Kontrollkulturmedium vor, indem Sie die Hormonmischlösung gemäß Tabelle 1 zugeben und mit Nitrozellulosefiltern mit 0,22 μm Porenfilz filtrieren. Halten Sie das Medium bei 4 °C und erwärmen Sie es vor Gebrauch in einem Wasserbad bei 37 °C. Bereiten Sie das vollständige Medium vor, indem Sie das Kontrollmedium unmittelbar vor der Verwendung gemäß Tabelle 1 mit EGF und bFGF ergänzen. Filtern Sie nicht das gesamte Medium, da Mitogene beim Filtern verloren gehen können. Hirnextraktion und SVZ-DissektionHINWEIS: Mäusen wird vor der Euthanasie freier Zugang zu Futter und Wasser gewährt. Es werden C57BL/6-Mäuse verwendet, die 8 bis 16 Wochen alt sind. Es werden beide Geschlechter verwendet, ohne dass es zu spürbaren Unterschieden in der Zubereitung kommt.Sterilisieren Sie die Präparierwerkzeuge vor der Operation durch Autoklavieren. Tauchen Sie dann Skalpelle, Pinzetten, Scheren und Spatel in ein Becherglas, das mit 70 % Ethanol gefüllt ist. Reinigen Sie jede Arbeitsfläche gründlich mit 70% Ethanol. Opfern Sie die Maus durch eine CO2 -Überdosierung und bestätigen Sie durch eine Gebärmutterhalsluxation. Besprühen Sie den Kopf mit 70% Ethanol, um die Möglichkeit einer Kontamination des Gehirngewebes zu minimieren. Trennen Sie den Kopf der Maus mit einer Schere vom restlichen Körper. Schneiden Sie die Haut oberhalb des Schädels mit einer kleinen Schere entlang der rostro-kaudalen Achse, bis der Schädel vollständig freigelegt ist. Legen Sie das Gehirn frei, indem Sie zunächst den Schädel entlang der sagittalen Naht mit einer kleinen Schere durchtrennen und dann die Knochen mit einer feinen Pinzette entfernen. Achten Sie darauf, dass das Hirngewebe unter dem Schädel bei diesem Schritt nicht beschädigt wird. Entnehmen Sie das Gehirn vorsichtig mit einem Spatel aus dem Schädel und legen Sie es in eine 12-Well-Platte mit kaltem DPBS. Halten Sie die Platte auf Eis, bis die Sektion abgeschlossen ist. Übertragen Sie das gesamte Gehirn auf das Silikonpad, wo die Dissektion stattfinden wird, und tragen Sie einige Tropfen kaltes DPBS auf das Gehirn auf (Abbildung 1A). Verwenden Sie ein Skalpell, um den OB am rostralen Ende des Gehirns und das Kleinhirn im kaudalen Teil zu entfernen, während der zentrale Teil des Gehirns, der beide lateralen Ventrikel enthält, erhalten bleibt (Abbildung 1B). Teilen Sie das Gehirn entlang der Längsfissur in zwei Hemisphären und fahren Sie dann mit der Dissektion beider Hemisphären getrennt fort (Abbildung 1C). Wenn Sie mit einer Hemisphäre arbeiten, richten Sie sie so aus, dass der mediale Bereich nach oben zeigt. Öffnen Sie das Gehirn entlang der Linie des Corpus callosum, trennen Sie den Kortex und das Striatum vom Hippocampus, dem Septum und dem Zwischenhirn, wodurch die lateralen Ventrikel freigelegt werden (Abbildung 1D).HINWEIS: Die SVZ befindet sich zwischen der Höhle des Ventrikels und dem Striatum, so dass die nachfolgenden Schritte darauf abzielen, die SVZ so genau wie möglich vom umgebenden Gewebe zu isolieren. Entfernen Sie den Hippocampus, das Septum und das Zwischenhirn entlang der ventralen Grenze der Ventrikel (Abbildung 1E,F), das Gewebe jenseits der rostralen und kaudalen Enden der SVZ (Abbildung 1G) und den Kortex entlang des Corpus callosum (Abbildung 1H,I). Kippen Sie das Gewebe so, dass die SVZ zur Seite zeigt (Abbildung 1J), so dass das striatale Gewebe unter der SVZ (Abbildung 1K) entfernt werden kann, um ein dünnes Stück Gewebe zu erhalten, das die NSCs enthält (Abbildung 1L). Lagern Sie beide präparierten SVZs derselben Maus in einer 12-Well-Platte mit kaltem, sterilem DPBS, bis die Gewebeverarbeitung beginnt.HINWEIS: Die Dissektion beider SVZs aus einem Gehirn sollte 10 Minuten dauern. Eine längere Zeit kann die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen. Wenn eine erhöhte Ausbeute der Kulturen benötigt wird, können SVZs von mehreren Mäusen gleichen Alters, Geschlechts, genetischen Hintergrunds und Genotyps gepoolt werden. Isolierung und Seeding von NSCsSchneiden Sie jedes SVZ in 4-5 kleine Stücke, um die Disaggregation des Gewebes zu erleichtern.HINWEIS: Ab diesem Schritt muss der gesamte Eingriff unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Übertragen Sie die gehackten SVZs mit einer sterilen Pasteurpipette aus Kunststoff in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Fragmente mehr in der Platte befinden. Lassen Sie das Gewebe am Boden des Röhrchens sedimentieren und entfernen Sie das restliche DPBS. Geben Sie 500 μl gefilterte Papain-haltige enzymatische Mischung pro Gehirn (2 SVZs) hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen in einem Wasserbad bei 37 °C für 30 Minuten. Nach der Inkubation werden jeder Probe 5 ml auf 37 °C vorgewärmtes Kontrollmedium zugesetzt. Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 x g für 5 min. Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand mit einer Mikropipette oder einer Vakuumpumpe. Geben Sie 1 ml Kontrollmedium hinzu und disaggregieren Sie das Pellet vorsichtig mechanisch, indem Sie es 10x bis 20x mit einer feuerpolierten Pasteur-Glaspipette auf und ab pipettieren, bis eine homogene Zellsuspension erhalten ist.ACHTUNG: Dies ist einer der kritischsten Schritte im Protokoll, da sich entweder eine übermäßige oder unzureichende Disaggregation negativ auf die Ausbeute der Kulturen auswirkt. Fügen Sie 4 ml Kontrollmedium hinzu und mischen Sie es durch Inversion, um die Zellen zu waschen. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie dann den Überstand. Fügen Sie 1 ml vollständiges Medium hinzu und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie 10x auf und ab pipettieren, um die Zellsuspension zu homogenisieren. Zählen Sie die Zellsuspension mit einer Neubauer-Kammer unter dem Mikroskop, nachdem Sie 1/2 eines Aliquots der Zellsuspension mit Trypanblau verdünnt haben, oder verwenden Sie einen automatischen Zellzähler. Stellen Sie sicher, dass die Kulturen auf Einzelzellebene disaggregiert werden. Sobald die Zellsuspension hergestellt ist, säen Sie die erhaltenen Zellen gleichmäßig in 8 Vertiefungen einer 48-Well-Platte in einem Endvolumen von 500 μl vollständigem Medium aus.HINWEIS: In der Regel erhalten wir 20.000 Zellen aus zwei SVZs, was zu einer endgültigen Aussaatdichte von ca. 2.500 Zellen/ml führt, um die maximale Ausbeute in Kulturen zu erreichen. Bildung von NeurosphärenInkubieren Sie die Zellen 5 bis 7 Tage lang in vitro (DIV) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2. Unter diesen Bedingungen sterben differenzierte Zellen ab, während NSCs und Vorläuferzellen als Reaktion auf mitogene Stimulation proliferieren und klonale Aggregate bilden, die als primäre Neurosphären erkannt werden.HINWEIS: Entweder EGF oder bFGF können verwendet werden, um die Bildung von Neurosphären zu induzieren. Diese beiden Wachstumsfaktoren sind jedoch nicht vollständig substituierbar. Überprüfen Sie die Größe der Neurosphären mit einer inversen, mikroskopgekoppelten Kamera, und sobald die Neurosphären einen Größenbereich von 50 bis 100 μm erreicht haben, zählen Sie alle primären Neurosphären, die sich in der Vertiefung bei 10-facher Vergrößerung gebildet haben. Die Gesamtzahl der gebildeten primären Neurosphären dient als Schätzung der Anzahl der in der SVZ-Nische vorhandenen NSCs. Entnehmen Sie nach einem Zeitraum von 10 Tagen das Nährmedium aus jeder Vertiefung, um mit der Passage zu beginnen. Führen Sie die anschließende Passage nach 5 bis 7 DIV durch, obwohl es erwähnenswert ist, dass Primärkugeln eine etwas längere Dauer benötigen, um die ideale Größe für die Subkultur (etwa 100 μm) zu erreichen. Tabelle 1: Nährmedienlösungen. Die Rezeptur des Kontrollmediums wird beschrieben. Es wird eine vorgemischte Hormonmischlösung hergestellt. Stammhormonlösungen können wie angegeben im Voraus zubereitet und bei -20 °C gelagert werden. Vor der Zellkultur ist das Kontrollmedium mit EGF und bFGF zu ergänzen, um das vollständige Medium herzustellen. Für jede Komponente werden Lagerspezifikationen, Lagerbestände und Arbeitskonzentrationen angegeben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen. 2. Ausbreitung der Neurosphärenkulturen Passage der NeurosphärenSammeln Sie das Medium mit den Neurosphären von den Multiwell-Platten und geben Sie es in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Stellen Sie sicher, dass so viele Zellen wie möglich zurückgewonnen werden, indem Sie die Wells mit einigen Millilitern DPBS spülen. Zentrifugieren Sie die Neurosphären für 5 min bei 300 x g. Entfernen Sie dann den Überstand. Geben Sie 200 μl enzymatische Lösung (siehe Materialtabelle) zum Pellet und klopfen Sie vorsichtig auf den Boden des Röhrchens, um es zu lösen. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Dissoziation der Neurosphären zu erleichtern. Fügen Sie 1 ml Kontrollmedium hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen, und dissoziieren Sie Neurosphären mechanisch mit einer P1000-Mikropipette, indem Sie 10x bis 20x auf und ab pipettieren. Geben Sie ein zusätzliches Volumen von 4 mL des Kontrollmediums hinzu und mischen Sie es durch Inversion, um die Zellen zu waschen. Zentrifugieren Sie die Zellen 5 min lang bei 300 x g. Entfernen Sie dann den Überstand. Fügen Sie 1 ml des vollständigen Mediums hinzu und resuspendieren Sie das Pellet, um die zelluläre Suspension zu homogenisieren, indem Sie 10x auf und ab pipettieren.HINWEIS: Wenn die ursprüngliche Anzahl und Größe der Neurosphären zu hoch sind, fügen Sie vollständigeres Medium hinzu, um die Zellsuspension zu verdünnen, um eine zuverlässige Zellzahl zu gewährleisten. Zählen Sie die Zellsuspension mit einer Neubauer-Kammer, nachdem Sie 1/2 eines Aliquots der Zellsuspension mit Trypanblau verdünnt haben, oder verwenden Sie einen automatischen Zellzähler. Zur Erweiterung der Zellkultur werden Zellen mit einer Dichte von 10.000 Zellen/cm2 unter Verwendung eines vollständigen Mediums in einer geeigneten Kulturplatte oder einem geeigneten Kolben gesät (siehe Tabelle 2). Die Zellen werden für 5 bis 7 DIV in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 für jeden Durchgang inkubiert.HINWEIS: Neurosphärenkulturen können durch wiederholte Subkultivierung von nicht mehr als 10 Passagen konsistent erweitert und vermehrt werden, ohne ihre Proliferationskapazitäten zu verändern. Für die Kultivierung kann entweder EGF oder bFGF verwendet werden; Eine langfristige Ausbreitung der Kulturen kann jedoch nur in Anwesenheit von EGF erreicht werden. Selbsterneuerungs-AssayNach dem Passieren von Neurosphärenkulturen werden 1.000 einzelne Zellen in einer 96-Well-Platte auf ein Endvolumen von 200 μl mit vollständigem Medium vervollständigt, was zu einer endgültigen Zelldichte der Kulturen von 5 Zellen/μl führt.HINWEIS: Die Anzahl der gesetzten Zellen muss so genau wie möglich sein. Bereiten Sie bei Bedarf Zwischenverdünnungen vor, um ein zuverlässiges Zellsuspensionsvolumen vor der Beschichtung zu gewährleisten. Darüber hinaus wird empfohlen, 4 bis 5 Wiederholungen pro Bedingung zu erstellen, um die technische Variabilität zu reduzieren. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator für 5 Tage oder bis die Neurosphären eine ausreichende Größe (60 bis 100 μm) erreicht haben. Vermeiden Sie es, die Multiwell-Platte zu bewegen oder zu schütteln, um eine Aggregation der Neurosphäre zu verhindern. Zählen Sie nach der Bildung der Neurosphären die Anzahl der Neurosphären, die sich in jeder Vertiefung gebildet haben, mit einem inversen Phasenkontrastmikroskop, das mit einer angebrachten Kamera ausgestattet ist. Der Selbsterneuerungstest kann separat mit EGF oder bFGF durchgeführt werden. Kryokonservierung von NSC-KulturenHINWEIS: Neurosphärenkulturen können für die zukünftige Verwendung kryokonserviert werden, wodurch die Anzahl der erforderlichen Mäuse minimiert wird. Wir empfehlen, die Zellen bis zur Passage 10 zu konservieren.Um Zellen zu kryokonservieren, übertragen Sie 1 ml der Zellsuspension in vollständigem Medium in ein ordnungsgemäß markiertes Kryoröhrchen. Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Endkonzentration von 10 % in die Zellsuspension geben und vorsichtig mischen, indem die Röhrchen umgedreht werden.HINWEIS: DMSO dient als Kryoprotektivum, kann aber für Zellen toxisch sein, daher sollte dieser Schritt schnell durchgeführt werden. Legen Sie die Röhrchen in einen -80 °C-Gefrierschrank mit einem Gefrierbehälter, der eine allmähliche Temperaturabsenkung auf 1 °C/min ermöglicht. Dieser allmähliche Gefrierprozess verhindert Zellschäden, die durch die Bildung von Eiskristallen während der Kryokonservierung verursacht werden. Für die Langzeitlagerung bewahren Sie die Röhrchen in einem Flüssigstickstofftank bei -196 °C auf. Auftauen von NSC-KulturenHINWEIS: Bei Bedarf können Zellen aufgetaut und Kulturen für Experimente wieder expandiert werden.Nehmen Sie die Kryoröhrchen mit gefrorenen NSCs aus dem Vorratsbehälter für flüssigen Stickstoff und legen Sie sie sofort in ein 37 °C heißes Wasserbad, bis sie vollständig aufgetaut sind, ca. 5 Minuten.ACHTUNG: Es ist wichtig, die Badezeit zu minimieren, da DMSO giftig ist und die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen kann. Übertragen Sie aufgetaute Zellen schnell in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 5 mL vorgewärmtem Kontrollmedium. Zellen bei 300 x g für 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen. Fügen Sie 1 ml vollständiges Medium hinzu und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie es vorsichtig 10x auf und ab pipettieren, um die Zellsuspension vor der Aussaat zu homogenisieren.HINWEIS: Auftauen kann die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen; Daher wird empfohlen, die Zellen mindestens einmal zu passagen, bevor sie für neue Experimente ausgesät werden. Mykoplasmen-TestsHINWEIS: Eine Kontamination mit Mykoplasmen kann die Zellgesundheit beeinträchtigen und die Wachstumsraten beeinträchtigen. Daher sind Mykoplasmentests von entscheidender Bedeutung, um die Integrität und Zuverlässigkeit der Experimente zu gewährleisten.DNA-ExtraktionSammeln Sie mindestens 100 μl der Zellkultur für die DNA-Extraktion. Sowohl der Überstand als auch das Zellpellet können für die DNA-Extraktion verwendet werden. Dieses Aliquot bis zur Extraktion bei -20 °C lagern. Den Tubendeckel durchstechen und das Aliquot bei 99 °C 15 min mit einem Thermoblock kochen.HINWEIS: Durch das Durchstechen der Röhrchendeckel wird verhindert, dass sich die Röhrchen während des Siedens bei hohen Temperaturen öffnen. 5 min bei 16.900 x g zentrifugieren. Übertragen Sie den Überstand mit der DNA in ein neues Röhrchen. Lagern Sie das Röhrchen mit der DNA bei -20 °C bis zur PCR-Testung. PCR zum Nachweis von MykoplasmenBereiten Sie den PCR-Mix mit den folgenden Komponenten vor: 8,9 μl nukleasefreies Wasser, 3 μl 5x Reaktionspuffer, 1,2 μl 25 mM MgCl2, 0,25 μl 2,5 mM dNTPs, 0,15 μl Taq-Polymerase und 0,25 μl jedes mykoplasmenspezifischen Primers in einer Konzentration von 10 μM (Vorwärts, Fw: 5’GATGTTTAGCCGGGTCGAGAG3′ und Rückwärts, Rv: 5’GATGTCAAGAGTGGGTAAGGTT3′). Fügen Sie 1 μl genomisch extrahierte DNA hinzu. Bereiten Sie den PCR-Mix in einer Laminar-Flow-Haube vor, um eine DNA-Kontamination zu vermeiden. Die Reaktion wird in einem Thermocycler wie folgt inkubiert: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 5 min, gefolgt von 35 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 s, Glühen bei 53 °C für 1 min, Verlängerung bei 72 °C für 30 s und eine abschließende Verlängerung bei 72 °C für 5 min. Um die Größe der resultierenden Bande (ca. 500 bp) zu bestimmen, laden Sie 15 μl des DNA-PCR-Produkts gemischt mit 3 μl 6x Ladefarbstofflösung auf ein 2%iges Agarosegel und führen Sie die Elektrophorese für 40 bis 50 Minuten bei 100 V durch. Tabelle 2: Platten und Kolben, die für den Anbau verwendet werden. Es werden die Abmessungen und Volumina der am häufigsten verwendeten Säplatten und Kolben angegeben. Die Tabelle enthält den Durchmesser, die Wachstumsfläche und das mittlere Volumen, die für jedes Gefäß verwendet werden, sowie ein Beispiel für die Anzahl der NSCs, die unter Expansionsbedingungen ausgesät werden sollen (10.000 Zellen/cm2). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen. 3. Nukleofektion von Neurosphärenkulturen Vorbereitung der ReagenzienDNA-VorbereitungBereiten Sie 25 μl kompetente E. coli DH5α-Zellen in einem 1,5-ml-Röhrchen für die Transformation vor. Geben Sie 1 μl des interessierenden Plasmids (bei 100 bis 200 ng/μl) in die Zellen und setzen Sie sie 45 s lang einem Temperaturschock bei 42 °C aus. Hier werden ein Plasmid verwendet, das eine kurze Hairpin (sh)RNA zur Stummschaltung der Snrpn-Expression enthält, und ein Kontrollplasmid shSCRAMBLE.HINWEIS: Halten Sie kompetente Zellen während des gesamten Eingriffs auf Eis, um die Wirksamkeit der Transformation zu erhalten. Die transformierten Zellen werden auf LB-Agarplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum bekleidet und 18 h lang bei 37 °C inkubiert. Halten Sie die Petrischalen umgedreht, um Tröpfchenbildung durch Kondensation zu verhindern, die die Bakterienkolonien stören könnte.HINWEIS: Geben Sie geeignete Antibiotika in das LB-Kulturmedium, um ausschließlich das Wachstum transformierter Bakterien zu ermöglichen. Entnehmen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze einzelne Bakterienkolonien und geben Sie sie in einen Erlenmeyerkolben, der zuvor mit 250 mL LB gefüllt wurde, um eine Flüssigkultur zu initiieren. Vermeiden Sie es, kleine Satellitenkolonien auszuwählen, die um die größeren Zielkolonien herum positioniert sind, da sie möglicherweise nicht das gewünschte Plasmid enthalten haben. Der Kolben wird über Nacht auf einem Orbitalschüttler bei 37 °C kräftig geschüttelt. Verwenden Sie ein endotoxinfreies Maxiprep-Kit und extrahieren Sie reine Plasmid-DNA aus den Bakterienkulturen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Rekonstituieren Sie die DNA in dem entsprechenden Volumen endotoxinfreiem Wasser, um eine Plasmidkonzentration von 1 bis 2 μg/μl zu erhalten.HINWEIS: Die maximale Ausbeute hängt vom Wachstum der Kultur ab. In der Regel führt die Resuspendierung des Plasmid-DNA-Pellets in einem Volumen von 200 μl zu der gewünschten DNA-Konzentration. Lagern Sie das Röhrchen mit der Plasmid-DNA bis zur Verwendung bei -20 °C. Bereiten Sie ein 1,5-ml-Röhrchen mit einem Endvolumen von 5 μl vor, das 2 bis 6 μg der Plasmid-DNA enthält, die für die Nukleofektion bestimmt ist. MaterialaufbereitungBereiten Sie die Nukleofektionslösung vor. Wenn Sie das empfohlene Kit verwenden (siehe Materialtabelle), bereiten Sie 95 μl der Nukleofektionslösung in einem 1,5-ml-Röhrchen für jede gewünschte Nukleofektion vor. Pipetten und Küvetten sind in der Regel im Kit enthalten. Bereiten Sie für jede Nukleofektionserkrankung eines vor. Bereiten Sie einen T25-Kolben vor, der mit 4 ml vorgewärmtem Alleinmedium pro Bedingung gefüllt ist, und bewahren Sie ihn bis zur Verwendung im Inkubator auf. Nukleofektion von NSCsVerwenden Sie 1 bis 2 x 10 x6 einzelne Zellen pro Bedingung zur Bewertung. Die Zellen werden 5 min lang bei 300 x g zentrifugiert, dann wird der Überstand entfernt. Fügen Sie 1 ml DPBS hinzu und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie es 10x auf und ab pipettieren, um eine homogene zelluläre Suspension zu gewährleisten. Wiederholen Sie die Zentrifugation (Schritt 2.1.6) für eine zweite Wäsche und resuspendieren Sie das Pellet schließlich in 95 μl Nukleofektionslösung.HINWEIS: Waschschritte sind entscheidend, um Antibiotika aus dem Kontrollmedium zu entfernen und eine effektive Nukleofektion zu gewährleisten. Kombinieren Sie die 95 μl Zellen mit einer vorgemischten Lösung, die 5 μl jedes Plasmids (insgesamt 2 μg) enthält, das für die Nukleofektion ausgewählt wurde. Übertragen Sie diese Lösung mit einer P200-Mikropipette in eine Küvette und geben Sie sie in das Nukleofektorgerät. Nukleofect der Zellen mit den gewünschten Plasmiden unter Verwendung des optimierten NSC-Programms des Nukleofector-Systems. Nach Abschluss der Elektroporation mit den im Kit enthaltenen Pasteur-Pipetten vorsichtig warmes vollständiges Medium in die Küvette einführen. Anschließend wird der Inhalt der Küvette in einen zuvor vorbereiteten T25-Kolben überführt, der das vorgewärmte vollständige Medium enthält. Nach der Elektroporation kann es zum Zelltod, zur DNA-Ausfällung und zur Bildung eines viskosen Aggregats kommen. Vermeiden Sie es, dies in den T25-Kolben zu übertragen, da dies das Überleben der Zellen verringern könnte.HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend und sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, um eine hohe Ausbeute an Nukleofektion und das anschließende Überleben der Kultur zu gewährleisten. Inkubieren Sie nukleofectierte Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator für 3 bis 5 Tage. Selektion der nukleofectierten ZellenStrategie A: Durchflusszytometrische Selektion durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)Nach 3 bis 5 Tagen der Nukleofektion werden die nukleofectierten Kulturen gemäß Schritt 2.1 durchlaufen und alle erhaltenen individualisierten Zellen gesammelt. Filtrieren Sie Proben durch ein 40-μm-Zellsieb, um Zellaggregate zu entfernen und mit dem Zellsortierer Durchflusszytometer zu analysieren.HINWEIS: Es ist wichtig, in jeder Bedingung die gleiche Anzahl von Zellen zu sortieren, um Vergleichsergebnisse zu erhalten. Mit der Software des Zytometers können lebende Zellen auf der Grundlage von zwei Messungen geschleust werden: Vorwärtsstreulicht (FSC-A), das der Zellgröße entspricht, und seitliches Streulicht (SSC-A), das der intrazellulären Komplexität entspricht. Wählen Sie die Population lebender Zellen aus, die sich durch einen hohen FSC-A- und einen hohen SSC-A-Wert auszeichnen.HINWEIS: Optional können Sie vor dem Sortieren 0,1 μg/ml 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) zur Zellsuspension hinzufügen. Dies ermöglicht es, tote Zellen und apoptotische Körper aus dem Gating zu entfernen. Verwerfen Sie Zelldubletten und Tripletts, indem Sie die Parameter FSC-A und FSC-H plotten. Wählen Sie die Ereignisse aus, die in der Diagonale des Diagramms enthalten sind und Singuletts darstellen.HINWEIS: Wenn Zellen den Laser passieren, erkennt das Zytometer Spannungsänderungen im Laufe der Zeit. FSC-A steht für den Signalbereich und FSC-H für die Peakhöhe. Singuletts zeigen eine proportionale Beziehung zwischen FSC-A und FSC-H (die sich an der Diagonale des Diagramms befinden), während Zellaggregate aufgrund eines längeren Signals eine größere FSC-A relativ zu FSC-H aufweisen. Wählen Sie nukleofisierte Zellen basierend auf der Fluoreszenzintensität des Reportergens aus, das von dem verwendeten Plasmid kodiert wird. Bei der Verwendung von GFP+ können Zellen beispielsweise auf der Grundlage von FITC-A-Fluoreszenzwerten im Vergleich zu SSC-A-Diagrammen ausgewählt werden. Isolieren Sie für jede Bedingung die gewünschte Anzahl von Zielzellen und sammeln Sie sie direkt in einem Sammelröhrchen, das mit vollständigem Medium gefüllt ist. Seed-nukleofectierte NSCs mit einer Dichte von 10.000 Zellen/cm2. Inkubieren Sie die sortierten Zellkulturen bei 37 °C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator. Strategie B: Selektion anhand von Antibiotikaresistenzen, die im Plasmid kodiert sindNach 48 Stunden Nukleofektion fügen Sie die entsprechende Antibiotikakonzentration hinzu, um resistente Zellen auszuwählen.HINWEIS: Bevor Sie beginnen, wird empfohlen, mehrere Konzentrationen des Antibiotikums an nicht nukleofekten Zellen zu testen. Die optimale Antibiotikakonzentration ist die geringste Menge, bei der alle nicht resistenten Zellen eliminiert werden. Zum Beispiel haben wir eine optimale Konzentration von 4 μg/ml antibiotischem Blasticidin für NSC-Kulturen bestimmt. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator für 48 h. Nach 48 Stunden Antibiotikabehandlung werden die nukleofectierten Zellen gemäß Schritt 2.1 subkultiviert. Wenn die Neurosphären klein bleiben, entfernen Sie das Antibiotikum durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min aus dem Nährmedium. Die Zellen werden resuspendiert und in einem Kolben kultiviert, wobei nur vollständiges Medium verwendet wird. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator, bis sie nach Schritt 2.1 expandiert werden können.

Representative Results

Optimale Kulturbedingungen ermöglichen die Isolierung und Expansion von adulten SVZ-abgeleiteten NSCs in vitroKulturen von NSCs, die aus der adulten SVZ stammen, haben sich als wertvolle in vitro-Methode erwiesen, um die molekularen Mechanismen und Nischensignale zu untersuchen, die NSCs in ihrer spezifischen Mikroumgebung regulieren. Der in diesem Manuskript beschriebene Neurosphären-Assay wurde verwendet, um die NSC-Zahl innerhalb der erwachsenen SVZ zu untersuchen. SVZ-Gewebe wurde aus den Gehirnen von 3 Monate alten Mäusen isoliert, dissoziiert und in vollständigem NSC-Medium kultiviert, das sowohl mit EGF als auch mit bFGF oder jeweils separat ergänzt wurde. Nach 10 Tagen in vitro (DIV) wurde die Gesamtzahl der primären Kugeln, die unter diesen drei unterschiedlichen Kulturbedingungen gebildet wurden, mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie quantifiziert (Abbildung 2A,B). Bemerkenswerterweise zeigen unsere Ergebnisse, dass das Vorhandensein von EGF zu einer maximalen Bildung primärer Sphären führte, was sich in der reduzierten Anzahl primärer Sphären zeigt, die in Kulturen mit nur bFGF beobachtet wurden (Abbildung 2A,B). Um die Selbsterneuerungsfähigkeit von NSCs unter verschiedenen Medienbedingungen zu bewerten, wurden Zellen subkultiviert und bei niedriger Dichte (5 Zellen/μl) in Medien plattiert, die mit den oben genannten Kombinationen von Mitogenen ergänzt wurden. Die Quantifizierung der Sekundärsphären zeigte, dass SVZ-NSCs mindestens EGF benötigen, um sich effizient selbst zu erneuern, und dass die Kombination von EGF und bFGF die Selbsterneuerungsfähigkeit der Zellen verbessert (Abbildung 2B). Darüber hinaus wurde für eine detaillierte Analyse der Wachstumsdynamik unter verschiedenen Medienbedingungen die Anzahl der Zellen aufgezeichnet, die in 7 Passagen ausgesät und gewonnen wurden. Wachstumskurven aus verschiedenen Medienbedingungen bestätigten, dass Kulturen, die allein oder in Kombination mit bFGF supplementiert wurden, eine verbesserte Wachstumsdynamik aufwiesen als Kulturen, die ausschließlich mit bFGF supplementiert wurden (Abbildung 2C). Zusammengenommen untermauern diese Ergebnisse, dass die gleichzeitige Anwendung von EGF und bFGF den NSC-Zuchtertrag in vitro erhöht. Um die NSC-Zahl innerhalb der SVZ über verschiedene postnatale Altersgruppen hinweg zu untersuchen und den Einfluss der Alterung von Mäusen auf die Effizienz der Neurosphärenkultur zu bewerten, wurde SVZ-Gewebe von Mäusen im Alter von 1 Monat bis 12 Monaten präpariert. Bemerkenswert ist, dass unsere Ergebnisse einen signifikanten Rückgang der Anzahl der primären Kugeln mit zunehmendem Alter zeigten, was die maximale Effizienz bei der Kugelzählung im Alter von etwa 2 bis 4 Monaten zeigte (Abbildung 2D). Um die Selbsterneuerungsfähigkeit von NSCs während der Subkultivierung zu bewerten, wurden NSCs von Mäusen im Alter von 2 bis 4 Monaten subkultiviert und mit klonaler Dichte (5 Zellen/μl) in vollständigem Medium ausgesät. Die Quantifizierung der Anzahl der Sekundärkugeln in den nachfolgenden Passagen deutete auf eine erhebliche Abnahme der Kultureffizienz im Laufe der Passagen hin (Abbildung 2E). Basierend auf all diesen Beobachtungen wird die Durchführung von Selbsterneuerungs-Assays während der frühen Passagen empfohlen, um die NSC-Kulturbedingungen weiter zu optimieren. Die Nukleofektion ist eine hocheffiziente Technik zur Manipulation der Genexpression in adulten NSCsAngesichts der Tatsache, dass NSCs nicht leicht transfizierbar sind, um die Genexpression zu manipulieren, stellen wir hier ein Protokoll der Nukleofektion mit einer höheren Rate erfolgreicher Genübertragung vor, ohne dass eine virale Transduktion erforderlich ist. Nach der Sektion und Kultivierung einzelner SVZs von 2 bis 4 Monate alten Mäusen wurden die NSCs wie beschrieben mit einem GFP-tragenden Plasmid nukleofisiert (Abbildung 3A). Der Nachweis von GFP-positiven Zellen 2 Tage nach der Nukleofektion ergab eine Effizienz zwischen 30 % und 50 %, was mit der bisherigen Literatur übereinstimmt28. Um erfolgreich nukleofektionierte NSCs spezifisch zu isolieren, wurden die Zellen 3 bis 5 Tage nach der Nukleofektion anhand der GFP-Fluoreszenzintensität nach FACS sortiert (Abbildung 3A-C). Etwa 40 % der prä-FACS-analysierten Zellen wiesen hohe GFP-Fluoreszenzwerte auf und wurden anschließend durch Sortierung ausgewählt (Abbildung 3C). Die Nachsaat von sortierten GFP+-NSCs zeigte, dass alle Zellen GFP-positiv waren, was die auf Nukleofektion basierende Zellisolationsmethode validierte (Abbildung 3D). Bemerkenswert ist, dass nukleofektierte NSCs ihre Lebensfähigkeit über nachfolgende Passagen hinweg beibehielten, was die Machbarkeit der Nukleofektion für adulte NSCs bestätigt. Diese Ergebnisse unterstreichen die Wirksamkeit der Kombination von Nukleofektion und FACS, um eine Reinkultur modifizierter NSCs zu etablieren. Als Beispiel für die Genmodulation in adulten NSCs wurde die Genabschwächung über die Short Hairpin (sh) RNA-Nukleofektion verwendet. Konkret wurde eine shRNA, die auf das Snrpn-Gen (Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N) abzielt und einen CAG-GFP-Reporter (shSNRPN) trägt, in NSC-Kulturen nukleofektiert, die von 2 Monate alten Mäusen stammen. Die Herunterregulierung von Snrpn wurde durch qPCR und Immunzytochemie in Zellen bestätigt, die mit dem shSNRPN-Plasmid nukleofisiert wurden, jedoch nicht für das Kontrollplasmid shSCRAMBLE (Abbildung 3E,F)29. Um die Auswirkungen der Snrpn-Herunterregulierung auf die Selbsterneuerungskapazität von NSC aufzuklären, wurde ein Assay mit niedriger Dichte in nukleofekten Zellen durchgeführt (Abbildung 3F,G). Die Quantifizierung sekundärer Neurosphären in nukleofekten Kulturen zeigte eine erhöhte Neurosphärenbildungskapazität nach Herunterregulierung des Snrpn (Abbildung 3G). Dieser Assay unterstreicht die Fähigkeit der Nukleofektion, die Genexpression in adulten NSCs zu manipulieren, und identifiziert insbesondere die Rolle von Snrpn bei der Aufrechterhaltung der Stammzellen in adulten NSCs. Abbildung 1: Detaillierte Beschreibung der SVZ-Dissektion. (A) Nach der Entnahme des Mausgehirns wird das gesamte Gehirn mit DPBS auf ein Silikonpad zur Dissektion übertragen. (B) OB und Kleinhirn werden mit einem Skalpell aus dem Gehirn entfernt. (C) Das Gehirn wird in zwei Hemisphären unterteilt, um mit der Dissektion getrennt fortzufahren. (D) Das Gehirn wird entlang der Linie des Corpus callosum geöffnet, wodurch der Kortex und das Striatum vom Hippocampus, dem Septum und dem Zwischenhirn getrennt werden, wodurch die lateralen Ventrikel freigelegt werden. (E-F) Der Hippocampus, das Septum und das Zwischenhirn werden entlang der ventralen Grenze der Ventrikel entfernt. (G-I) Das Gewebe jenseits des rostralen und kaudalen Endes der SVZ und der Hirnrinde wird nach dem Corpus callosum entfernt. (J-K) Das Gewebe wird so gekippt, dass die SVZ zur Seite zeigt, wodurch das striatale Gewebe unter der SVZ entnommen werden kann. (L) Es wird ein dünnes Stück Gewebe gewonnen, das die SVZ enthält. Schwarze gestrichelte Linien zeigen die Schnittstelle an. Schwarze gepunktete Linien zeigen die Position der SVZ bei jedem Schritt an. Abkürzungen: OB = Riechkolben; CB = Kleinhirn. Maßstabsleiste in A-H: 5 mm; in I-L: 3 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Die beiden Mitogene EGF und bFGF sind für eine optimale Kultivierung und Expansion von NSCs in vitro notwendig. (A) Phasenkontrastmikroskopische Bilder von primären und sekundären Neurosphärenkulturen in NSC-Medium, ergänzt mit EGF und bFGF oder jedem Mitogen separat. (B) Anzahl der pro Maus und pro Vertiefung gewonnenen Primärkugeln, basierend auf der Mitogenzusammensetzung des Kulturmediums: keine Mitogene (grau, n=9), EGF+bFGF (blau, n=33), nur EGF (grün, n=20) oder nur bFGF (rosa, n=19; linkes Bild). Anzahl der sekundären Neurosphären, die bei geringer Dichte (5 Zellen/μl) pro Vertiefung gebildet werden, basierend auf der Mitogenzusammensetzung des Kulturmediums): keine Mitogene (grau, n=11), bFGF (rosa, n=18), EGF (grün, n=18) oder EGF+bFGF (blau, n=37; rechtes Bild). Zum Einsatz kam der Kruskal-Wallis-Test mit der Post-hoc-Analyse von Dunn. (C) Wachstumskurven, die die Gesamtzahl der Zellen zeigen, die nach 8 Passagen in verschiedenen Neurosphärenkulturen gebildet wurden, entsprechend den im Kulturmedium vorhandenen Mitogenen: bFGF (rosa, n=5), EGF (grün, n=5) oder EGF+bFGF (blau, n=10). Es wurde eine lineare Regressionsanalyse verwendet. (D) Die Anzahl der primären Neurosphären, die von einzelnen Mäusen stammen, die in verschiedenen postnatalen Entwicklungsstadien von Tieren seziert und disaggregiert wurden. Es wurde eine lineare Regressionsanalyse verwendet. n in Klammern angegeben. (E) Die Anzahl der sekundären Neurosphären, die bei geringer Dichte (5 Zellen/μl) durch nachfolgende Passagen in vitro gebildet wurden, um ihre Selbsterneuerungsfähigkeit zu beurteilen. Es wurde der Kruskal-Wallis-Test verwendet, und die p-Werte sind enthalten: *: p<0,05; **: S<0,01; : S<0,001; : S<0.0001. n.s: Nicht signifikant. Die Fehlerbalken stellen das REM dar. Der Maßstabsbalken in A beträgt 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Schematische Darstellung des Nukleofektionsprozesses und der FACS-basierten Zellselektion von nukleofektionierten Zellen. (A) Überblick über den Nukleofektionsprozess und die FACS-basierte Zellselektion von nukleofektionierten Zellen. 1) Die Plasmid-DNA-Lösung wird mit der Nukleofektionslösung kombiniert und den Zellen zugesetzt. Dieses Gemisch wird dann zur Nukleofektion in eine Küvette überführt. 2) Die Küvette, die die DNA und die Zellen enthält, wird in den Nukleofektor eingeführt, wo ein elektrischer Schock angewendet wird. Für Neurosphärenkulturen, die aus der adulten SVZ isoliert wurden, empfehlen wir die Verwendung des A-031 NSC-Programms. 3) Nach der Nukleofektion werden die Zellen in einen Kolben mit vollständigem Medium überführt, das mit EGF und bFGF versetzt wird. 4) Die Zellen werden nach FACS sortiert, basierend auf der Expression des in der Plasmid-DNA enthaltenen Reporters. 5) Die sortierten Zellen werden für nachfolgende Experimente weiter kultiviert. (B) FACS-basierte Selektionsstrategie und Gating für nukleofektive NSCs. Zuerst werden lebende Zellen auf der Grundlage eines hohen FSC-A- und eines hohen SSC-A-Gehalts ausgewählt (linke Grafik), und dann werden Zelldubletten und Tripletts durch Analyse der FSC-A- und FSC-H-Parameter eliminiert (rechte Grafik). (C) FACS-Gating für nukleofaktierte Zellen basierend auf ihrer GFP-Expression (SSC-A versus FITC-A-Fluoreszenz). (D) Phasenkontrastmikroskopie und GFP-Fluoreszenzbilder von nukleofaktierten NSCs vor (n=3) und nach (n=4) FACS-Auswahl (linkes Bild). Der Prozentsatz der nukleofectierten GFP+ -Zellen ist vor und nach der FACS-Selektion dargestellt (rechtes Bild). Es wurde der t-Test verwendet. (E) Quantitative PCR (qPCR): Analyse der Snrpn-Expression in proliferierenden NSCs, die mit Snrpn-spezifischer shRNA (n=4) nukleofisiert wurden. Als Kontrolle diente die Nukleofektion mit einem shRNA-SCRAMBLE (n=4). Es wurde der t-Test verwendet. (F) Immunzytochemische Bilder, die SNRPN (in rot) in NSCs 7 Tage nach der shRNA-Nukleofektion zeigen (äußere Ausschnitte). DAPI wurde verwendet, um DNA gegenzufärben. Repräsentative Bilder, die Neurosphären darstellen, die von NSCs unter shSNRPN- und shSCRAMBLE-Bedingungen abgeleitet wurden (mittlere Felder). (G) Quantifizierung der Anzahl der Neurosphären, die in NSC-Kulturen nach Nukleofektion mit shSNRPN (n=8) oder shSCRAMBLE (n=8) gebildet wurden. Es wurde der t-Test verwendet. p-Werte sind enthalten: *: p<0,05; **: S<0,01; : S<0,001; : S<0.0001. n.s: Nicht signifikant. Fehlerbalken stellen das REM dar. Maßstabsbalken in D, 10 μm; in F, 100 μm (Bilder mit hoher Vergrößerung in F, 7 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Aufgrund des Mangels an definitiven Markern zur Identifizierung der NSC-Population in vivo basierte die Analyse von NSCs in erster Linie auf der Beobachtung des Verhaltens von Zellen, die aus neurogenen Nischen isoliert wurden, unter ex vivo-Bedingungen . Die Pionierarbeit von Reynolds und Weiss legte den Grundstein, indem sie präzise Kulturbedingungen etablierten, die die Isolierung und Expansion einzelner Zellen aus SVZ-Gewebe junger Erwachsener (2 Monate alt) aus Mäusen unter nicht-adhäsiven Bedingungen ermöglichten. Diese Zellen werden in der Regel in einem serumfreien Medium vermehrt, das EGF und bFGF enthält, Bedingungen, die die Differenzierung in Neuronen und Gliazellen vollständig verhindern und gleichzeitig die Proliferation fördern. Tatsächlich sterben unter diesen Kulturbedingungen9 die meisten Zellen in den ersten Tagen der Kultur ab, aber eine kleine Untergruppe beginnt sich zu teilen und bildet hauptsächlich schwebende Neurosphären9. Die enzymatische Dissoziation und Subkultur dieser Zellaggregate erleichtern die Vermehrung der Kultur und demonstrieren die Selbsterneuerungsfähigkeit dieser Kulturen.

Bemerkenswert ist, dass Neurosphärenkulturen ein Expansionspotenzial aufweisen, wenn nur EGF hinzugefügt wird, während NSCs, die in einem Medium gezüchtet werden, das nur bFGF enthält, keine langfristige Zellproliferation aufweisen30. Beide Beweise deuten darauf hin, dass EGF das primäre NSC-Selbsterneuerungsmitogen ist. Nichtsdestotrotz verbessert das Vorhandensein von EGF und bFGF im Kulturmedium die Selbsterneuerungsfähigkeit von NSCs31 und trägt dazu bei, das Differenzierungspotenzial in Astrozyten, Neuronen und Oligodendrozytenauszugleichen 32,33,34,35. Darüber hinaus gewährleistet die Verwendung einer definierten Mischung aus Hormonen und Faktoren anstelle von kommerziellen Alternativen zur Ergänzung des Mediums die hohe Qualität und Reproduzierbarkeit der NSC-Kulturen. Unter diesen Bedingungen können NSC-Kulturen der Maus als stabile Zelllinien fortbestehen, ohne dass sie immortalisiert werden. Nichtsdestotrotz ist ein Problem in Neurosphärenkulturen das Potenzial proliferativer Zellpopulationen, genetische Transformationen zu durchlaufen, die Regulationsmechanismen des Zellzyklus umgehen und zu einem immortalisierten Phänotyp führen. Obwohl Neurosphärenkulturen hochgradig erweiterbar sind, werden Kulturen über 10 In-vitro-Passagen hinaus in der Regel für Studien verworfen, da sie replikativ altern können und Zellen mit abnormalem Chromosomengehalt oder unregelmäßiger Wachstumsdynamik entstehen können. Darüber hinaus muss die Nutzung von langjährig etablierten Neurosphärenkulturen kontinuierlich überwacht werden. Neurosphärenkulturen bieten auch die Möglichkeit, ihre Eigenschaften und ihr Potenzial in einer kontrollierten Umgebung zu untersuchen, und bieten eine präzisere und anpassbarere Einstellung, die genauer moduliert und überwacht werden kann als in vivo. Durch klonogene oder Populationsanalysen in vitro ist es möglich, die Selbsterneuerungs- und Proliferationskapazitäten dieser Zellen zu quantifizieren, was die Identifizierung der zugrunde liegenden Mechanismen erleichtert, die diesen Eigenschaften zugrunde liegen.

Trotz der großen Liste von Vorteilen der Arbeit mit NSCs in vitro stellen die Art dieses Kultivierungsprotokolls und die Empfindlichkeit der NSCs eine Herausforderung auf diesem Gebiet dar. Zum Beispiel kann die Anzahl der primären Neurosphären, die während einer typischen Dissektion erzeugt werden, je nach Geschicklichkeit und Präzision des Experimentators erheblich variieren. Die Ergebnisse der primären Neurosphäre verdeutlichen diese Variabilität in der Anzahl der primären Neurosphären, die aus der SVZ von 2 Monate alten Mäusen gewonnen wurden, und zwar zwischen 500 und 3000 Neurosphären. Verschiedene Faktoren können zu dieser Variabilität beitragen. Erstens minimiert die Präzision der Dissektion unerwünschtes Parenchymgewebe, was die Bildung der primären Kugel hemmt. Zweitens ermöglicht die Erzeugung kleiner SVZ-Gewebestücke eine effiziente enzymatische Verdauung und Verreibung, wodurch der Zellverlust reduziert wird. Dies unterstreicht die Notwendigkeit einer ausreichenden vorherigen Übung des Dissektionsprotokolls und einer fein abgestimmten Entwicklung der Gewebeverarbeitung während der Etablierung der Neurosphärenkulturen.

Eine weitere Einschränkung dieser Kulturen liegt in der Tatsache, dass Neurosphären sowohl NSCs als auch Vorläuferzellen umfassen können, was es schwierig macht, zwischen diesen beiden Populationen innerhalb von Primärkulturen zu unterscheiden. Es wurde zwar berichtet, dass verschiedene Marker wie GFAP, Nestin, Musashi und SOX2 von NSCs exprimiert werden8, aber keiner von ihnen wurde ausschließlich mit NSCs in Verbindung gebracht. Neue FACS-Techniken, die auf der Expression von Zelloberflächenantigenen basieren, haben die Isolierung von NSCs und ihren Nachkommen ermöglicht. Diese Studien haben gezeigt, dass transitverstärkende Vorläuferzellen nicht in der Lage sind, Neurosphären nach der Passage zu bilden25,36. Während also die Beziehung zwischen SVZ-Zellen und Neurosphären-initiierenden Zellen weiter verfeinert werdenmuss 18,19,20,21,22,23, könnte die Fähigkeit von Neurosphären, über einen längeren Zeitraum seriell durchlaufen zu werden, das Vorhandensein von NSCs in den Kulturen widerspiegeln.

Dieses Neurosphären-Kultursystem diente als robustes Modell für die Untersuchung des Einflusses von Signalwegen und Genexpression auf die Aufrechterhaltung der Selbsterneuerungsfähigkeit von NSC in vitro15,29. Ein Ansatz, um diese Aspekte zu erforschen, besteht darin, NSCs zu transfizieren, um bestimmte Gene entweder zu überexprimieren oder auszuschalten. Dies kann durch verschiedene Techniken erreicht werden, einschließlich viraler und nicht-viraler Methoden. Virale Vektoren erreichen zwar oft eine hohe Effizienz des Gentransfers, weisen aber wichtige Einschränkungen auf, wie z. B. die hohen Sicherheitsanforderungen und die zeitaufwändige Vektorproduktion26. Umgekehrt erreichen klassische Transfektionsmethoden wie Lipofektion und Elektroporation sehr niedrige Transfektionsraten, was sie für schwer zu transfizierende Zellen undurchführbar macht. Die Nukleofektionstechnologie bietet einen benutzerfreundlichen Ansatz, indem sie zelltypspezifische Nukleofektionslösungen mit einzigartigen elektrischen Parametern für jeden Zelltypkombiniert 37,38. Dadurch wird ein DNA-Transfer direkt in den Zellkern39 gewährleistet, wodurch der DNA-Einbau unabhängig vom Zellzyklus möglich ist. Folglich erweist sich die Nukleofektion als eine praktikable Technik für die Transfektion schwer zu transfizierender Zellen wie Maus-NSCs28,40.

Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass für jede Nukleofektion mindestens 2 x 106 Zellen empfohlen und erforderlich sind, obwohl unter optimalen Bedingungen eine geringere Anzahl von Zellen pro einzelner Nukleofektion verwendet werden kann (d. h. 5 × 105 Zellen). Ein weiterer Nachteil der Methode besteht darin, dass die Qualität und Konzentration der für die Nukleofektion verwendeten DNA die Effizienz des Gentransfers erheblich beeinflussen. Die Verwendung von endotoxinfrei präparierter DNA wird dringend empfohlen, um eine erhöhte Zellsterblichkeit aufgrund des Vorhandenseins von Endotoxinen zu verhindern. Darüber hinaus kann die Verwendung von mehr als 6 μg Gesamt-DNA für die Nukleofektion sowohl die Effizienz des Gentransfers als auch die Zellviabilität erheblich reduzieren. Schließlich ist die Verabreichung von elektrischen Impulsen auch entscheidend für das Überleben von kernhaltigen Zellen.

In dieser Arbeit haben wir die Manipulation der Snrpn-Genexpression veranschaulicht, indem wir eine Strategie anwandten, die die Herunterregulierung der Expression mit episomalen Plasmiden beinhaltet. Diese Plasmide sind nicht in das Genom der Zellen integriert, und da sich die NSCs in vitro weiter vermehren, wird die eingeführte DNA anschließend bei der Zellteilung verdünnt und verliert somit den Effekt der genetischen Manipulation. Daher ist diese Strategie wertvoll, um die Wirkung einer akuten Veränderung in kurzer Zeit zu untersuchen oder Zellen in vitro zur Geburt zu bringen. Es gibt einige Alternativen, um einen länger anhaltenden Effekt der Genstörung zu bewerten. So könnte beispielsweise ein integratives System wie das Transposon-basierte piggyBAC zum Einsatz kommen. Dieses System besteht darin, die gewünschte kodierende Sequenz, die in dem Plasmid enthalten ist, flankiert von transponierbaren Sequenzen, einzuführen und die Zellen mit einem Plasmid, das die Sequenz für das Enzym Transposase41 enthält, co-nukleofect zu führen. Alternativ könnten Transposons oder die CRISPR/Cas-Systeme verwendet werden.

Die Weiterentwicklung von Transfektionstechnologien wird ein wichtiger Schritt in Richtung Hochdurchsatz-Assays sein, um die Rolle verschiedener Gene in der Physiologie adulter neuraler Stammzellen zu bewerten. In Kombination mit immer ausgefeilteren Reinigungs- und Expansionsmethoden werden diese Studien das Verständnis der in vitro-Biologie adulter NSCs und den Vergleich der biologischen Unterschiede zwischen schwebenden Neurosphären und NSCs in vivo ermöglichen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Ministerio de Ciencia e Innovación und der Agencia Estatal de Investigación (MCIN/AEI) unterstützt (PID2019-110045GB-I00; PID2022-142734OB-I00 und EUR2023-143479) an SRF. EJV (FPU20/00795) und DSL (FPU22/03797) werden durch das spanische Stipendienprogramm Formación de Profesorado Universitario (FPU) finanziert. LLC (PRE2020-094137) und JDM (PREP2022-000680) werden durch das Stipendienprogramm der spanischen Formación de Personal Investigador (FPI) finanziert. CMM (CIACIF/2022/366) wird von der Generalitat Valenciana finanziert. MIL (CPI-22-481) wird durch das Programa INVESTIGO Stipendium (Next Generation EU) finanziert. Open-Access-Förderung durch das Ministerio de Ciencia e Innovación.

Materials

0.22 μm pore-filter bottles (250 mL) VWR 514-0330P
0.22 μm pore-filter bottles (500 mL) VWR 514-0332P
12-well plate LabClinics PLC30012
15 mL tube Fisher 10738771
24-well plate LabClinics PLC30024
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) BioWest L0180-100
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma D9542
48-well plate ThermoFisher 150687
6-well plate LabClinics PLC30006
96-well plate Labclinics PLC30096
Accutase solution Sigma A6964-100ML Referred as enzymatic solution
Amaxa Mouse Neural Stem Cell Nucleofector Kit Lonza VPG-1004
Amaxa Nucleofector Iib Lonza 10700807
Antibiotic/Antimitotic (A/A) Sigma A5955
Apo-t-Transferrine Sigma T2252-1G
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Sigma F0291
Blasticidin Sigma 203350
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma B4287-25MG
Cell strainer 40 μm LabClinics PLC93040
Deoxynucleotide triphosphate (dNTPs) NZYTech MB08701
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418
Dulbecco’s Phosphate Saline Buffer (DPBS) Gibco 14080-055
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) F12 1:1 Gibco 11320-074
E. coli DH5α Competent Cells ThermoFisher EC0112
Earles's Balanced Salt Solution (EBSS) Gibco 24010-043
Epidermal Growth Factor – Human recombinant (EGF) Gibco 53003-018
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E-6511
Fine Forceps Fine Science Tools 11274-20
Fine Scissors Sharp Fine Science Tools 14060-09
Glucose Sigma G-7021
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase Promega M7805 Kit includes reagents for PCR
Heparin Sigma H-3149
Insuline Sigma I6634
LB agar (Lennox) LabKem AGLB-00P-500
LB broth (Lennox) LabKem LBBR-00P-500
L-Cysteine Sigma C-8277
L-Glutamine Gibco 25030-024
Neubauer chamber Blaubrand BR718620
Nuclease free water Labbox WATR-00A-10K
NZYMaxiprep Endotoxin Free Kit NZYTech MB39901
Papain Lyophilized Worthington LS003119
Progesterone Sigma P-6149
Putrescine Sigma P-7505
Scalpel Fine Science Tools 10316-14
shSCRAMBLE Mission (Sigma) SHC003
shSNRPN Mission (Sigma) TRCN0000109285
Sodium Selenite Sigma S-9133
Spatula Fine Science Tools 10090-17
Sterile PES Syringe Filters (0.22 μm pore-filter) Epica SFPE-22E-050
T12.5 cm2 Flask Biofil TCF012025
T25 cm2 Flask LabClinics PLC70025
T75 cm2 Flask LabClinics PLC70075
Tweezers Fine Science Tools 91150-20
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References

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Jiménez-Villalba, E., Lázaro-Carot, L., Mateos-Martínez, C. M., Díaz-Moncho, J., Samper-Llavador, D., Igual-López, M., Planells, J., Ferrón, S. R. Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone. J. Vis. Exp. (208), e66651, doi:10.3791/66651 (2024).
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