13C6-وسم الجلوكوز المرتبط ب LC-MS: تحديد الأعضاء الأولية للنبات في تخليق الأيض الثانوي
Summary
الطريقة المطورة لوضع العلامات على الجلوكوز 13C6-جنبا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي عالي الدقة للكروماتوغرافيا السائلة متعددة الاستخدامات وتضع الأساس للدراسات المستقبلية حول الأعضاء والمسارات الأولية المشاركة في تخليق المستقلبات الثانوية في النباتات الطبية ، وكذلك الاستخدام الشامل لهذه المستقلبات الثانوية.
Abstract
تقدم هذه الورقة طريقة جديدة وفعالة لاعتماد الأعضاء الأولية المشاركة في تخليق الأيض الثانوي. كأهم مستقلب ثانوي في باريسبوليفيلا فار يونانينسيس (فرانش.) يد. -Mzt. (PPY) ، باريس سابونين (PS) لديها مجموعة متنوعة من الأنشطة الدوائية و PPY في زيادة الطلب. أنشأت هذه الدراسة حزمة الأوراق والجذور والأوعية الدموية الجذعية 13C6-تغذية الجلوكوز وعدم التغذية بأربعة علاجات للتصديق بدقة على الأعضاء الأولية المشاركة في تخليق باريس سابونين السابع (PS VII). من خلال الجمع بين قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS) ، تم حساب نسب 13C / 12C للأوراق والجذور والساق والجذر في معالجات مختلفة بسرعة وبدقة ، وتم العثور على أربعة أنواع من نسب ذروة الأيونات النظيرية PS (M−): (M + 1) – / M − ، (M + 2) – / M − ، (M + 3) – / M − و (M + 4) – / M−. أظهرت النتائج أن نسبة 13درجة مئوية / 12درجة مئوية في جذور حزمة الساق والأوعية الدموية وعلاجات تغذية الجذور كانت أعلى بكثير من تلك الموجودة في العلاج غير التغذوي. بالمقارنة مع المعالجة غير التغذوية ، زادت نسبة جزيئات PS VII (M + 2) – / M − في الأوراق بشكل ملحوظ تحت معالجات تغذية الأوراق والأوعية الدموية الجذعية. في الوقت نفسه ، مقارنة بالمعالجة غير المغذية ، لم تظهر نسبة جزيئات PS VII (M + 2) – / M − في الأوراق تحت معالجة جذمور أي فرق كبير. علاوة على ذلك ، لم تظهر نسبة جزيئات PS VII (M + 2) – / M − في الساق والجذر والجذمور أي اختلافات بين العلاجات الأربعة. بالمقارنة مع المعالجة غير المغذية ، لم تظهر نسبة جزيء باريس سابونين II (PS II) (M + 2) – / M − في الأوراق تحت معالجة تغذية الأوراق أي فرق كبير ، وكانت نسبة (M + 3) – / M − لجزيئات PS II في الأوراق تحت معالجة تغذية الأوراق أقل. أكدت البيانات أن العضو الأساسي لتوليف PS VII هو الأوراق. إنه يضع الأساس لتحديد الأعضاء والمسارات الأولية المشاركة في تخليق المستقلبات الثانوية في النباتات الطبية في المستقبل.
Introduction
مسارات التخليق الحيوي للمستقلبات الثانوية في النباتات معقدة ومتنوعة ، وتشمل أعضاء تراكم محددة ومتنوعة للغاية1. في الوقت الحاضر ، لم يتم تحديد مواقع التوليف المحددة والأجهزة المسؤولة عن المستقلبات الثانوية في العديد من النباتات الطبية بشكل جيد. يشكل هذا الغموض عقبة كبيرة أمام التقدم الاستراتيجي وتنفيذ طرق الزراعة المصممة لتحسين كل من إنتاجية وجودة المواد الطبية.
يتم استخدام البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية وتقنيات وضع العلامات على النظائر على نطاق واسع لكشف مسارات التوليف ومواقع المستقلبات الثانوية في النباتات الطبية2،3،4،5 ، وتظهر كل من هذه المنهجيات نقاط قوة وقيود فريدة ، مثل الاختلافات في الكفاءة والدقة. تقدم مناهج البيولوجيا الجزيئية ، على سبيل المثال ، دقة عالية في تحديد المواقع داخل مسارات التخليق الحيوي ولكنها تستغرق وقتا طويلا بشكل ملحوظ. ففائدتها مقيدة بشكل أكبر بالنسبة للأنواع التي تفتقر إلى التسلسلات الجينومية المتاحة للجمهور ، مما يجعل هذه التقنيات أقل قابلية للتطبيق في مثل هذه الحالات6. وعلى النقيض من ذلك، توفر تقنيات توسيم النظائر، التي تستخدم نسب نظائر مثل 3C/12 C،و2 H/1H، و18O/16O، وسيلة سريعة وسهلة المنال للتحقيق في آليات تخليق ونقل وتخزين المستقلبات الثانوية 7,8. يمكن أن تكشف عن التوزيع المكاني للمركبات العضوية والنظائر المستقرة في الأوراق ، مما يسمح بإعادة بناء الظروف البيئية التي تمر بها الأوراق طوال دورة حياتها9. وعلاوة على ذلك، فإن تطبيق العلامات النظيرية الخارجية، مثل 13C6-Glucose 10 و 13C6-Phenylalanine 11، يمكن من توليد مستقلبات ثانوية موسومة بالكربون، مما يعزز فهمنا لإنتاجها ووظيفتها.
تواجه التقنيات التقليدية لوضع العلامات على نظائر الكربون تحديات في تحديد الأعضاء المحددة المسؤولة عن تخليق المستقلبات الثانوية بسبب الطبيعة الخاصة بالأنواع لمسارات التخليق الحيوي وآليات النقل. برز قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) كأداة تحليلية محورية في هذا المجال ، حيث يقدم طريقة قوية لتتبع النظائر الخارجية في التخليق الكيميائي للأدوية والتحقيق في العمليات في الجسم الحي مثل الامتصاص والتوزيع والتمثيل الغذائي والإفراز12. إن الحساسية الفائقة والاستقامة والموثوقية ل LC-MS تجعله خيارا مثاليا لمراقبة إنتاج المستقلبات الثانوية في النباتات13. في الآونة الأخيرة ، أصبح LC-MS مفضلا بشكل متزايد لتطبيقه في تقنيات وضع العلامات على النظائر الخارجية ، مما يتيح تقييم كفاءة وضع العلامات عبر عينات مختلفة. توفر هذه المنهجية رؤى نقدية للأعضاء الأولية المشاركة في تخليق المستقلبات الثانوية في النباتات الطبية ، حيث تعمل كمكمل لا يقدر بثمن للطرق البيولوجية لتحديد أعضاء التوليف لهذه المركبات14,15. وبالتالي ، فإن هذا النهج لا يسهل مقارنة كفاءات وضع العلامات بين العينات المختلفة فحسب ، بل يلقي الضوء أيضا على الأعضاء الرئيسية المتورطة في توليد المستقلبات الثانوية النباتية ، وبالتالي تعزيز فهمنا لتخليقها الحيوي.
قدمنا طريقة جديدة تجمع بين وضع العلامات على نظائر الكربون واكتشاف LC-MS لتحديد الأعضاء الأولية المسؤولة عن توليف المستقلبات الثانوية في النباتات الطبية. يحتوي باريس سابونين (PS) على مجموعة متنوعة من الأنشطة الدوائية مثل مضاد السرطان ، والتعديل المناعي ، ومضاد الالتهاب16 ، ويزداد الطلب على PPY17. لذلك ، استخدمنا شتلات PPY كمواضيع بحثية وفككنا شفرة أن الأوراق هي العضو الأساسي لتجميع باريس سابونين السابع (PS VII) (الشكل 1B) باستخدام ملصق 13C6-Glucose المرتبط بطريقة LC-MS. تضمن نهجنا أربعة علاجات مختلفة تتضمن تغذية 13C6-Glucose لحزم الأوراق والجذور والأوعية الدموية الجذعية ، بالإضافة إلى التحكم في عدم التغذية. يعد اختيار 13C6-Glucose استراتيجيا ، حيث يتم استقلابه بسرعة إلى أنزيم الأسيتيل A عن طريق التنفس ، مما يسهل بعد ذلك تخليق PS. باستخدام الوفرة الطبيعية ل 13درجة مئوية ، استخدمنا نظام مطياف كتلة نسبة النظائر المستقرة (GC-IRMS) لتقييم نسب 13C / 12C عبر أعضاء النبات المختلفة ولتحليل نسب ذروة الأيونات النظيرية في جزيئات PS VII و Paris saponins II (PS II) (الشكل 1B). تقدم منهجيتنا ، التي تستفيد من 13من سلائف الأيض الثانوي للنبات الموسومة C وتقنيات قياس الطيف الكتلي المتطورة ، بديلا أبسط وأكثر دقة لطرق وضع العلامات التقليدية على نظائر الكربون. هذا النهج الجديد لا يعمق فهمنا للأعضاء المشاركة في تخليق الأيض الثانوي في النباتات الطبية فحسب ، بل يضع أيضا أساسا متينا للاستكشافات المستقبلية في مسارات التخليق الحيوي لهذه المركبات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتوقف التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول على البحث الشامل في الخصائص الفسيولوجية للنبات والأنسجة والأعضاء والمستقلبات الثانوية. يضع نهج التصميم التجريبي المبين في البروتوكول أساسا قويا للتحقيق في مسارات التخليق الحيوي للمستقلبات الثانوية النباتية. العوامل الحاسمة في هذه التجربة هي (1) تحد?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية لبرنامج الشباب الصيني (رقم 82304670).
Materials
| 0.1 % Formic acid water | Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory | 44890 | |
| 13C6-Glucose powder | MERCK | 110187-42-3 | |
| Acetonitrile | Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory | 44890 | |
| AUTOSAMPLER VIALS | Biosharp Biotechnology Company | 44866 | |
| BEH C18 column | Waters,Milfor,MA | 1.7μm,2.1*100 mm | |
| CNC ultrasonic cleaner | Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd | KQ-600DE | |
| Compound DiscovererTM software | Thermo Scientific, Fremont,CA | 3 | |
| Compound DiscovererTM software | Thermo Scientific,Fremont,CA | 3 | |
| Electric constant temperature blast drying oven | DHG-9146A | ||
| Electronic analytical balance | Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd | SOP | |
| Ethanol | Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory | 44955 | |
| Fully automatic sample rapid grinder | Shanghai Jingxin Technology | Tissuelyser-48 | |
| Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer | Thermo Fisher | Delta V Advantage | |
| Hoagland solution | Sigma-Aldrich | H2295-1L | |
| Hydroponic tank | JRD | 1020421 | |
| Isodat software | Thermo Fisher Scientific | 3 | |
| Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry | Agilent Technology | Agilent 1260 -6120 | |
| Nitrogen manufacturing instrument | PEAK SCIENTIFIC | Genius SQ 24 | |
| Organic phase filter | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd | 44890 | |
| Oxygen pump | Magic Dragon | MFL | |
| Quantum sensor | Highpoint | UPRtek | |
| Scalpel | Handskit | 11-23 | |
| Sprinkling can | CHUSHI | WJ-001 | |
| Xcalibur software | Thermo Fisher Scientific | 4.2 |
References
- Erb, M., Kliebenstein, D. J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: The blurred functional trichotomy. Plant Physiol. 184 (1), 39-52 (2020).
- Li, Y., Kong, D., Fu, Y., Sussman, M. R., Wu, H. The effect of developmental and environmental factors on secondary metabolites in medicinal plants. Plant Physiol Biochem. 148, 80-89 (2020).
- Liu, S., et al. Genetic and molecular dissection of ginseng (panax ginseng mey.) germplasm using high-density genic snp markers, secondary metabolites, and gene expressions. Front Plant Sci. 14, 1165349 (2023).
- Chen, X., Wang, Y., Zhao, H., Fu, X., Fang, S. Localization and dynamic change of saponins in cyclocarya paliurus (batal.) iljinskaja. PloS One. 14 (10), e0223421 (2019).
- Yuan, M., et al. Ex vivo and in vivo stable isotope labelling of central carbon metabolism and related pathways with analysis by lc-ms/ms. Nat Protoc. 14 (2), 313-330 (2019).
- Cavalli, F. M. G., Bourgon, R., Vaquerizas, J. M., Luscombe, N. M. Specond: A method to detect condition-specific gene expression. Genome Biol. 12 (10), 101 (2011).
- Epron, D., et al. Pulse-labelling trees to study carbon allocation dynamics: A review of methods, current knowledge and future prospects. Tree Physiology. 32 (6), 776-798 (2012).
- Varman, A. M., He, L., You, L., Hollinshead, W., Tang, Y. J. Elucidation of intrinsic biosynthesis yields using 13c-based metabolism analysis. Microb Cell Fact. 13 (1), 42 (2014).
- Meng-Meng, G., Zhen-Yu, Z., Yu, Z., Qiu-Lin, Y., Ying, W. Systematic extraction and stable isotope determination of different biomarkers from single leaf of reticulate vein plants. Journal of Shaanxi University of Science & Technology. 41 (01), 72-79 (2023).
- Zhang, H., et al. A convenient lc-ms method for assessment of glucose kinetics in vivo with d-[13c6]glucose as a tracer. Clin Chem. 55 (3), 527-532 (2009).
- Chassy, A. W., Adams, D. O., Waterhouse, A. L. Tracing phenolic metabolism in vitis vinifera berries with 13c6-phenylalanine: Implication of an unidentified intermediate reservoir. J Agric Food Chem. 62 (11), 2321-2326 (2014).
- Lozac’h, F., et al. Evaluation of cams for 14c microtracer adme studies: Opportunities to change the current drug development paradigm. Bioanalysis. 10 (5), 321-339 (2018).
- Sulyok, M., Stadler, D., Steiner, D., Krska, R. Validation of an lc-ms/ms-based dilute-and-shoot approach for the quantification of > 500 mycotoxins and other secondary metabolites in food crops: Challenges and solutions. Anal Bioanal Chem. 412 (11), 2607-2620 (2020).
- Serra, F., et al. Inter-laboratory comparison of elemental analysis and gas chromatography combustion isotope ratio mass spectrometry (gc-c-irms). Part i: Delta13c measurements of selected compounds for the development of an isotopic grob-test. J Mass Spectrom. 42 (3), 361-369 (2007).
- Jung, J. -. Y., Oh, M. -. K. Isotope labeling pattern study of central carbon metabolites using gc/ms. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 101-108 (2015).
- Ding, Y. G., et al. The traditional uses, phytochemistry, and pharmacological properties of paris l. (liliaceae): A review. J Ethnopharmacol. 278, 114293 (2021).
- Cunningham, A. B., et al. Paris in the spring: A review of the trade, conservation and opportunities in the shift from wild harvest to cultivation of paris polyphylla (trilliaceae). J Ethnopharmacol. 222, 208-216 (2018).
- Madikizela, L. M., Ncube, S., Chimuka, L. Uptake of pharmaceuticals by plants grown under hydroponic conditions and natural occurring plant species: A review. Sci Total Environ. 636, 477-486 (2018).
- Tagami, K., Uchida, S. Online stable carbon isotope ratio measurement in formic acid, acetic acid, methanol and ethanol in water by high performance liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry. Anal Chim Acta. 614 (2), 165-172 (2008).
- Li, Y., et al. The combination of red and blue light increases the biomass and steroidal saponin contents of paris polyphylla var. Yunnanensis. Ind Crops Prod. 194, 116311 (2023).
- Wang, G., et al. Tissue distribution, metabolism and absorption of rhizoma paridis saponins in the rats. J Ethnopharmacoly. 273, 114038 (2021).
- Peng, S., et al. Progress in the study of differences in the types and contents of steroidal saponins in paris. Polyphylla smith var. Chinensis (franch.) hara. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 24 (05), 2014-2025 (2022).
- Alami, M. M., et al. The current developments in medicinal plant genomics enabled the diversification of secondary metabolites’ biosynthesis. Int J Mol Sci. 23 (24), 15932 (2022).
- Wen, F., et al. The synthesis of paris saponin vii mainly occurs in leaves and is promoted by light intensity. Front Plant Sci. 14, 1199215 (2023).
- Siadjeu, C., Pucker, B. Medicinal plant genomics. BMC Genomics. 24 (1), 429 (2023).
- Tian, C., et al. Top-down phenomics of arabidopsis thaliana: Metabolic profiling by one- and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy and transcriptome analysis of albino mutants. J Biol Chem. 282 (25), 18532-18541 (2007).
- Masakapalli, S. K., et al. Metabolic flux phenotype of tobacco hairy roots engineered for increased geraniol production. Phytochemistry. 99, 73-85 (2014).
- Schwender, J., Ohlrogge, J. B., Shachar-Hill, Y. A flux model of glycolysis and the oxidative pentosephosphate pathway in developing brassica napus embryos. J Biol Chem. 278 (32), 29442-29453 (2003).
