13C 6-LC-MS ile İlişkili Glikoz Etiketlemesi: İkincil Metabolit Sentezinde Bitki Birincil Organlarının Tanımlanması
Summary
Sıvı kromatografisi yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile birleştirilmiş 13C6-Glikoz etiketleme yöntemi çok yönlüdür ve tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentezinde yer alan birincil organlar ve yollar ile bu ikincil metabolitlerin kapsamlı kullanımı hakkında gelecekteki çalışmaların temelini oluşturur.
Abstract
Bu makale, ikincil metabolit sentezinde yer alan birincil organları sertifikalandırmak için yeni ve etkili bir yöntem sunmaktadır. Paris’teki en önemli ikincil metabolit olarakpolyphylla var. yunnanensis (Franch.) El. (PPY), Paris saponin (PS) çeşitli farmakolojik aktivitelere sahiptir ve PPY artan talep görmektedir. Bu çalışma, Paris saponinleri VII (PS VII) sentezinde yer alan birincil organları kesin olarak sertifikalandırmak için yaprak, rizom ve kök-vasküler-demet 13C6-Glikoz besleme ve besleme dışı dört tedavi oluşturmuştur. Sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) birleştirilerek, farklı tedavilerde yaprak, rizom, gövde ve kökün 13C/12C oranları hızlı ve doğru bir şekilde hesaplandı ve dört tip PS izotopik iyon tepe noktası (M–) oranı bulundu: (M+1) –/M-, (M+2) –/M-, (M+3) –/M− ve (M+4) –/M−. Sonuçlar, kök-vasküler-demet ve rizom besleme tedavilerinin rizomlarındaki 13C/12C oranının, besleme dışı tedaviye göre anlamlı derecede yüksek olduğunu göstermiştir. Yemsiz tedavi ile karşılaştırıldığında, yapraklardaki PS VII moleküllerinin (M+2) −/M− oranı, yaprak ve gövde-vasküler-demet besleme uygulamaları altında önemli ölçüde artmıştır. Aynı zamanda, beslemesiz tedavi ile karşılaştırıldığında, köksap tedavisi altındaki yapraklardaki PS VII moleküllerinin (M + 2) – / M – oranı önemli bir fark göstermedi. Ayrıca, gövde, kök ve köksaptaki PS VII moleküllerinin (M+2) −/M− oranı dört tedavi arasında fark göstermedi. Yemsiz muamele ile karşılaştırıldığında, yaprak besleme muamelesi altındaki yapraklarda Paris saponin II (PS II) molekülünün (M+2) −/M− oranı önemli bir fark göstermedi ve yaprak besleme muamelesi altındaki yapraklarda PS II moleküllerinin (M+3) –/M– oranı daha düşüktü. Veriler, PS VII’nin sentezlenmesi için birincil organın yapraklar olduğunu doğruladı. Tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentezinde yer alan birincil organların ve yolların gelecekte tanımlanması için temel oluşturur.
Introduction
Bitkilerdeki ikincil metabolitlerin biyosentetik yolları, oldukça spesifik ve çeşitli birikim organlarını içeren karmaşık ve çeşitlidir1. Şu anda, birçok tıbbi bitkide ikincil metabolitler için spesifik sentez bölgeleri ve sorumlu organlar iyi tanımlanmamıştır. Bu belirsizlik, tıbbi materyallerin hem verimini hem de kalitesini optimize etmek için tasarlanmış yetiştirme yöntemlerinin stratejik ilerlemesi ve uygulanmasının önünde önemli bir engel teşkil etmektedir.
Moleküler biyoloji, biyokimyasal ve izotop etiketleme teknikleri, tıbbi bitkilerde 2,3,4,5 ikincil metabolitlerin sentez yollarını ve bölgelerini çözmek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bu metodolojilerin her biri, verimlilik ve doğruluktaki farklılıklar gibi benzersiz güçlü yönler ve sınırlamalar sergiler. Örneğin moleküler biyoloji yaklaşımları, biyosentetik yollar içindeki bölgeleri tam olarak belirlemede yüksek hassasiyet sunar, ancak özellikle zaman yoğundur. Faydaları, halka açık genomik dizilerden yoksun türler için daha da kısıtlanır ve bu teknikleri bu tür durumlar için daha az uygulanabilir hale getirir6. Buna karşılık, 3C / 12C, 2H / 1H ve 18O / 16O gibi izotopik oranları kullanan izotop etiketleme teknikleri, ikincil metabolitlerinsentezi, taşınması ve depolanması mekanizmalarını araştırmak için hızlı ve erişilebilir bir yol sağlar 7,8. Yapraklardaki organik bileşiklerin ve kararlı izotopların mekansal dağılımını ortaya çıkarabilirler, böylece yaprakların yaşam döngüleri boyunca deneyimledikleri çevresel koşulların yeniden yapılandırılmasına izin verirler9. Ayrıca, 13C6-Glikoz 10 ve 13C 6-Fenilalanin11 gibi harici izotopik etiketlerin uygulanması, karbon etiketli ikincil metabolitlerin üretilmesini sağlayarak bunların üretimi ve işlevi hakkındaki anlayışımızı geliştirir.
Geleneksel karbon izotop etiketleme teknikleri, biyosentetik yollarının ve taşıma mekanizmalarının son derece türe özgü doğası nedeniyle ikincil metabolitlerin sentezinden sorumlu spesifik organların belirlenmesinde zorluklarla karşılaşmaktadır. Sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS), ilaçların kimyasal sentezinde eksojen izotopların izlenmesi ve absorpsiyon, dağıtım, metabolizma ve atılım gibi in vivo süreçlerin araştırılması için sağlam bir yöntem sunarak bu alanda çok önemli bir analitik araç olarak öne çıkmıştır12. LC-MS’nin üstün hassasiyeti, basitliği ve güvenilirliği, onu bitkilerde ikincil metabolitlerin üretimini izlemek için ideal bir seçim haline getirir13. Son zamanlarda, LC-MS, farklı numuneler arasında etiketleme verimliliğinin değerlendirilmesini sağlayan harici izotop etiketleme tekniklerindeki uygulaması için giderek daha fazla tercih edilmeye başlanmıştır. Bu metodoloji, tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentezinde yer alan birincil organlar hakkında kritik bilgiler sağlar ve bu bileşiklerin sentez organlarını tanımlamak için biyolojik yöntemlere paha biçilmez bir tamamlayıcı olarak hizmet eder14,15. Sonuç olarak, bu yaklaşım sadece çeşitli örnekler arasında etiketleme verimliliklerinin karşılaştırılmasını kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda bitki ikincil metabolitlerinin oluşumunda rol oynayan kilit organlara ışık tutar ve böylece biyosentezleri hakkındaki anlayışımızı geliştirir.
Tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentezlenmesinden sorumlu birincil organları tanımlamak için karbon izotop etiketlemesini LC-MS tespiti ile birleştiren yeni bir yöntem tanıttık. Paris saponin (PS), antikanser, immünomodülasyon ve anti-inflamasyon16 gibi çeşitli farmakolojik aktivitelere sahiptir ve PPY artan talep görmektedir17. Bu nedenle, PPY fidelerini araştırma deneği olarak kullandık ve LC-MS yöntemi ile ilişkili 13C 6-Glukoz etiketlemesini kullanarak Paris saponin VII (PS VII) (Şekil 1B) sentezlemek için birincil organın yapraklar olduğunu deşifre ettik. Yaklaşımımız, yaprak, rizom ve kök-vasküler demetlere 13C6-Glikoz beslemesinin yanı sıra beslemeyen bir kontrolü içeren dört farklı tedaviyi içeriyordu. 13C6-Glikoz seçimi stratejiktir, çünkü solunum yoluyla hızlı bir şekilde asetil koenzim A’ya metabolize edilir ve bu da daha sonra PS sentezini kolaylaştırır. 13° C’nin doğal bolluğunu kullanarak, çeşitli bitki organlarındaki 13C / 12C oranlarını değerlendirmek ve PS VII ve Paris saponins II (PS II) (Şekil 1B) moleküllerindeki izotopik iyon tepe oranlarını analiz etmek için bir Gaz Kromatografisi Kararlı İzotop Oranı Kütle Spektrometresi (GC-IRMS) sistemi kullandık. 13C etiketli bitki ikincil metabolit öncüsünden ve en son kütle spektrometresi tekniklerinden yararlanan metodolojimiz, geleneksel karbon izotop etiketleme yöntemlerine daha basit ve daha doğru bir alternatif sunar. Bu yeni yaklaşım, yalnızca tıbbi bitkilerde ikincil metabolit sentezinde yer alan organlar hakkındaki anlayışımızı derinleştirmekle kalmaz, aynı zamanda bu bileşiklerin biyosentetik yollarına yönelik gelecekteki araştırmalar için sağlam bir temel oluşturur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması, bitki fizyolojik özellikleri, dokuları, organları ve ikincil metabolitleri ile ilgili kapsamlı araştırmalara bağlıdır. Protokolde özetlenen deneysel tasarım yaklaşımı, bitki ikincil metabolitlerinin biyosentetik yolaklarını araştırmak için sağlam bir temel oluşturmaktadır. Bu deneydeki kritik faktörler (1) çok yıllık fidelerin yaşının belirlenmesi ve (2) doğru izotop etiketleme-tespit zamanlamasının seçilmesidir. Tıbbi bitkiler, her b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Gençlik Programı (No. 82304670) tarafından finanse edildi.
Materials
| 0.1 % Formic acid water | Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory | 44890 | |
| 13C6-Glucose powder | MERCK | 110187-42-3 | |
| Acetonitrile | Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory | 44890 | |
| AUTOSAMPLER VIALS | Biosharp Biotechnology Company | 44866 | |
| BEH C18 column | Waters,Milfor,MA | 1.7μm,2.1*100 mm | |
| CNC ultrasonic cleaner | Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd | KQ-600DE | |
| Compound DiscovererTM software | Thermo Scientific, Fremont,CA | 3 | |
| Compound DiscovererTM software | Thermo Scientific,Fremont,CA | 3 | |
| Electric constant temperature blast drying oven | DHG-9146A | ||
| Electronic analytical balance | Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd | SOP | |
| Ethanol | Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory | 44955 | |
| Fully automatic sample rapid grinder | Shanghai Jingxin Technology | Tissuelyser-48 | |
| Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer | Thermo Fisher | Delta V Advantage | |
| Hoagland solution | Sigma-Aldrich | H2295-1L | |
| Hydroponic tank | JRD | 1020421 | |
| Isodat software | Thermo Fisher Scientific | 3 | |
| Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry | Agilent Technology | Agilent 1260 -6120 | |
| Nitrogen manufacturing instrument | PEAK SCIENTIFIC | Genius SQ 24 | |
| Organic phase filter | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd | 44890 | |
| Oxygen pump | Magic Dragon | MFL | |
| Quantum sensor | Highpoint | UPRtek | |
| Scalpel | Handskit | 11-23 | |
| Sprinkling can | CHUSHI | WJ-001 | |
| Xcalibur software | Thermo Fisher Scientific | 4.2 |
References
- Erb, M., Kliebenstein, D. J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: The blurred functional trichotomy. Plant Physiol. 184 (1), 39-52 (2020).
- Li, Y., Kong, D., Fu, Y., Sussman, M. R., Wu, H. The effect of developmental and environmental factors on secondary metabolites in medicinal plants. Plant Physiol Biochem. 148, 80-89 (2020).
- Liu, S., et al. Genetic and molecular dissection of ginseng (panax ginseng mey.) germplasm using high-density genic snp markers, secondary metabolites, and gene expressions. Front Plant Sci. 14, 1165349 (2023).
- Chen, X., Wang, Y., Zhao, H., Fu, X., Fang, S. Localization and dynamic change of saponins in cyclocarya paliurus (batal.) iljinskaja. PloS One. 14 (10), e0223421 (2019).
- Yuan, M., et al. Ex vivo and in vivo stable isotope labelling of central carbon metabolism and related pathways with analysis by lc-ms/ms. Nat Protoc. 14 (2), 313-330 (2019).
- Cavalli, F. M. G., Bourgon, R., Vaquerizas, J. M., Luscombe, N. M. Specond: A method to detect condition-specific gene expression. Genome Biol. 12 (10), 101 (2011).
- Epron, D., et al. Pulse-labelling trees to study carbon allocation dynamics: A review of methods, current knowledge and future prospects. Tree Physiology. 32 (6), 776-798 (2012).
- Varman, A. M., He, L., You, L., Hollinshead, W., Tang, Y. J. Elucidation of intrinsic biosynthesis yields using 13c-based metabolism analysis. Microb Cell Fact. 13 (1), 42 (2014).
- Meng-Meng, G., Zhen-Yu, Z., Yu, Z., Qiu-Lin, Y., Ying, W. Systematic extraction and stable isotope determination of different biomarkers from single leaf of reticulate vein plants. Journal of Shaanxi University of Science & Technology. 41 (01), 72-79 (2023).
- Zhang, H., et al. A convenient lc-ms method for assessment of glucose kinetics in vivo with d-[13c6]glucose as a tracer. Clin Chem. 55 (3), 527-532 (2009).
- Chassy, A. W., Adams, D. O., Waterhouse, A. L. Tracing phenolic metabolism in vitis vinifera berries with 13c6-phenylalanine: Implication of an unidentified intermediate reservoir. J Agric Food Chem. 62 (11), 2321-2326 (2014).
- Lozac’h, F., et al. Evaluation of cams for 14c microtracer adme studies: Opportunities to change the current drug development paradigm. Bioanalysis. 10 (5), 321-339 (2018).
- Sulyok, M., Stadler, D., Steiner, D., Krska, R. Validation of an lc-ms/ms-based dilute-and-shoot approach for the quantification of > 500 mycotoxins and other secondary metabolites in food crops: Challenges and solutions. Anal Bioanal Chem. 412 (11), 2607-2620 (2020).
- Serra, F., et al. Inter-laboratory comparison of elemental analysis and gas chromatography combustion isotope ratio mass spectrometry (gc-c-irms). Part i: Delta13c measurements of selected compounds for the development of an isotopic grob-test. J Mass Spectrom. 42 (3), 361-369 (2007).
- Jung, J. -. Y., Oh, M. -. K. Isotope labeling pattern study of central carbon metabolites using gc/ms. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 101-108 (2015).
- Ding, Y. G., et al. The traditional uses, phytochemistry, and pharmacological properties of paris l. (liliaceae): A review. J Ethnopharmacol. 278, 114293 (2021).
- Cunningham, A. B., et al. Paris in the spring: A review of the trade, conservation and opportunities in the shift from wild harvest to cultivation of paris polyphylla (trilliaceae). J Ethnopharmacol. 222, 208-216 (2018).
- Madikizela, L. M., Ncube, S., Chimuka, L. Uptake of pharmaceuticals by plants grown under hydroponic conditions and natural occurring plant species: A review. Sci Total Environ. 636, 477-486 (2018).
- Tagami, K., Uchida, S. Online stable carbon isotope ratio measurement in formic acid, acetic acid, methanol and ethanol in water by high performance liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry. Anal Chim Acta. 614 (2), 165-172 (2008).
- Li, Y., et al. The combination of red and blue light increases the biomass and steroidal saponin contents of paris polyphylla var. Yunnanensis. Ind Crops Prod. 194, 116311 (2023).
- Wang, G., et al. Tissue distribution, metabolism and absorption of rhizoma paridis saponins in the rats. J Ethnopharmacoly. 273, 114038 (2021).
- Peng, S., et al. Progress in the study of differences in the types and contents of steroidal saponins in paris. Polyphylla smith var. Chinensis (franch.) hara. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 24 (05), 2014-2025 (2022).
- Alami, M. M., et al. The current developments in medicinal plant genomics enabled the diversification of secondary metabolites’ biosynthesis. Int J Mol Sci. 23 (24), 15932 (2022).
- Wen, F., et al. The synthesis of paris saponin vii mainly occurs in leaves and is promoted by light intensity. Front Plant Sci. 14, 1199215 (2023).
- Siadjeu, C., Pucker, B. Medicinal plant genomics. BMC Genomics. 24 (1), 429 (2023).
- Tian, C., et al. Top-down phenomics of arabidopsis thaliana: Metabolic profiling by one- and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy and transcriptome analysis of albino mutants. J Biol Chem. 282 (25), 18532-18541 (2007).
- Masakapalli, S. K., et al. Metabolic flux phenotype of tobacco hairy roots engineered for increased geraniol production. Phytochemistry. 99, 73-85 (2014).
- Schwender, J., Ohlrogge, J. B., Shachar-Hill, Y. A flux model of glycolysis and the oxidative pentosephosphate pathway in developing brassica napus embryos. J Biol Chem. 278 (32), 29442-29453 (2003).
