Mesure de la longueur des télomères par PCR quantitative multiplexe monochrome

Cette recherche a été réalisée dans le respect des directives institutionnelles. Ce protocole décrit le test MMqPCR effectué à une profondeur de mesure de triples dupliqués, c’est-à-dire des mesures en trois exemplaires de chaque échantillon répétées sur des plaques dupliquées, mises en œuvre à l’aide de deux thermocycleurs simultanément pour améliorer le débit. L’utilisation de plaques dupliquées est une considération primordiale prise en compte dans la mise en œuvre de ce protocole pour obtenir une reproductibilité élevée, comme l’indiquent les ICC élevés. Bien qu’il soit possible d’utiliser moins de répétitions, l’impact sur l’ICC, et par conséquent sur la puissance et la taille de l’échantillon nécessaire, doit être soigneusement examiné et mesuré avec chaque cohorte par chaque laboratoire20,21. Si un seul thermocycleur est disponible, nous vous suggérons de maintenir la profondeur de mesure (c’est-à-dire les triples en double) et d’exécuter 2 plaques de manière séquentielle. 1. Préparation du stock et conditions de stockage Pour tous les matériaux et équipements utilisés pour ce protocole, voir le Tableau des matériaux. De plus, pour les réactifs spécifiques du mélange maître et les quantités utilisées pour le test MMqPCR, voir le tableau 1. Si vous analysez deux plaques de manière séquentielle, réduisez de moitié le volume de mélange principal tout en maintenant la concentration, en veillant à ce que les mêmes aliquotes de réactif soient utilisées sur les plaques séquentielles du même test.REMARQUE : Tous les réactifs en stock doivent être préparés à l’avance et les réactifs aliquotes doivent être complètement décongelés avant utilisation. Aliquote et conservez 1x Tris-EDTA, pH 7,6 (TE) dans des tubes de 5 mL dans des volumes de 3 mL à température ambiante jusqu’à 2 ans. Aliquote et stockage de la bétaïne 5 M dans des tubes de 5 mL dans des volumes de 1 280 μL à -20 °C pendant une période pouvant aller jusqu’à 1 an. Aliquote et stockage de SYBR Green dans des volumes de 3 μL dans des tubes de bandelettes PCR individuels à -20 °C pendant une période pouvant aller jusqu’à 2 ans, recouverts d’une feuille d’aluminium et peu exposés à la lumière. Conservez l’ADN polymérase dans les tubes d’origine à -20 °C jusqu’à 1 an. Aliquote et stockage du tampon polymérase 10x dans des tubes de 1,5 mL dans des volumes de 660 μL à -20 °C jusqu’à 1 an.Pour des dilutions de tampon 1x de tampon polymérase 10x, ajouter 9,9 μL de tampon 10x à 89,1 μL de PCR grade H2O dans des tubes de 0,5 mL ; Conserver à -20 °C jusqu’à 1 an. Aliquote et stockage de 1 M MgCl2 dans des tubes de 0,5 mL dans des volumes de 70 μL à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’à 1 an. Conservez les amorces lyophilisées oligonucléotidiques du télomère avant et inverse (T) et du gène de copie unique (S) à température ambiante à l’abri de la lumière. Les quatre séquences d’amorces d’oligonucléotides spécifiques sont présentées dans le tableau 2.REMARQUE : Le gène à copie unique dans ce protocole est l’albumine ; si l’on choisit un gène à copie unique différent, il peut être nécessaire d’ajuster les concentrations de l’amorce pour assurer une efficacité acceptable de la PCR.Reconstitution de l’amorce : Vortex chaque tube d’amorce lyophilisée pendant 10 s, puis placez les tubes dans une mini centrifugeuse pendant 5 s pour vous assurer que la pastille lyophilisée est au fond du tube avant d’ajouter 1x tampon TE. Vérifiez la concentration en nM de chaque tube d’amorce ([nM]= alpha) et réhydratez chaque tube d’amorce en ajoutant 1x TE égal à 10x de la valeur alpha en μL (par exemple, si la concentration en nM sur le tube indique 24,6 nM, ajoutez alors 246 μL de 1x TE dans le tube d’amorce) pour créer une solution de 100 μM de chaque amorce. Aliquote amorces de télomères directes et inverses séparément dans des volumes de 16 μL et amorces d’albumine directes et inverses séparément dans des volumes de 11 μL. Conservez les quatre types d’aliquotes d’apprêt à -20 °C jusqu’à 6 mois. Mélange dNTP : Vortex 4 à 8 tubes de chacun des quatre types de dNTPS de solutions mères de 25 mM (c.-à-d. 16 à 32 tubes au total) pendant 10 s, suivi d’un essorage rapide à température ambiante à l’aide d’une mini-centrifugeuse. Placez les tubes de manière uniforme dans les positions des tubes dans la mini centrifugeuse, puis fermez le couvercle pour permettre à la machine d’atteindre sa pleine vitesse, en tournant pendant environ 5 s.Dans un tube de 5 ml, ajoutez 200 à 250 μL de chaque tube, en veillant à ce que des parties égales de chacun des quatre types de dNTP soient ajoutées, et vortex le mélange de dNTP. Aliquote 210 μL de mélange dans des tubes de 0,5 mL et conserver à -20 °C jusqu’à 1 an. Stockez le DTT à -20 °C et l’acétate de sodium 3M à température ambiante.Solution DTT : Mesurez 0,1545 g de DTT dans un bateau de pesage taré sur une balance à l’aide d’une spatule en acier inoxydable.ATTENTION : Le dithiothréitol (DTT) est un réactif dangereux. La DTT est nocive en cas d’ingestion, provoque une irritation de la peau et peut causer de graves lésions oculaires. Les personnes doivent porter des gants de protection, des lunettes de protection et une protection faciale lors de la manipulation de la TNT. De plus, les individus doivent éviter de respirer les vapeurs de DTT, de travailler avec une cagoule PCR lors de la manipulation de DTT et d’éviter une exposition prolongée ou répétée. Préparez 10 ml d’acétate de sodium 0,01 M en ajoutant 33,33 μL d’acétate de sodium 3 M et 9 967 μL de PCR de grade H2O dans un tube de 15 mL et un puits de vortex. Ajouter le DTT mesuré dans le tube de 15 mL d’acétate de sodium 0,01 M. Transvaser environ 100 μL de la solution d’acétate de sodium 0,01 M dans le bateau de pesée pour recueillir le DTT résiduel. Pipetez les 100 μL dans le tube de 15 mL. Une fois que tout le DTT est dans la solution, agitez le tube jusqu’à ce qu’il se dissolve complètement. Verser le contenu du tube de 15 mL dans une auge de chargement, aspirer toute la solution dans une seringue en plastique de 10 mL à partir d’une extrémité de l’auge de chargement. Fixez un filtre stérile en acétate de cellulose de 0,2 μm à 25 mm à l’extrémité de la seringue remplie, laissez saturer complètement pendant 1 minute et versez lentement la solution dans un nouveau tube de 15 ml en poussant légèrement le piston de la seringue vers le bas, en veillant à ce que toute la solution s’écoule à travers le filtre dans le nouveau tube de 15 ml. Aliquote de la solution DTT dans des volumes de 200 μL dans des tubes de 0,5 mL et stockée à -20 °C jusqu’à 6 semaines. Tableau 1 : Volumes finaux et concentrations des réactifs. Volumes et concentrations des réactifs dans les aliquotes individuelles, les mélanges maîtres et dans les puits de PCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau. Tableau 2 : Séquences d’amorces d’oligonucléotides de télomères et de gènes à copie unique. Liste des séquences d’amorces des gènes de copie unique des télomères et de l’albumine utilisées dans la méthodologie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau. 2. Extraction de l’ADN génomique et préparation des échantillons Extraction d’échantillons analytiques : Effectuer une extraction d’ADN génomique pour les échantillons conformément aux directives du fabricant à l’aide de kits ou de méthodes établies au sein du laboratoire.Vérifiez la qualité de l’échantillon d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre et de l’ADN double brin (ADNdb) à l’aide d’un fluorimètre. Les échantillons présentant des rapports moyens inacceptables de 260/280 et 260/230 ou une concentration d’ADNdb inférieure à la détection (<0,20 ng/μL) ne devraient pas être analysés pour la concentration de TL22,23. De plus, si la concentration d’ADNdb est trop élevée pour générer une lecture à l’aide du fluorimètre (>1000 ng/μL), diluez l’échantillon et répétez le test.REMARQUE : Pour les résultats présentés ici, les valeurs acceptables pour la pureté des acides nucléiques étaient un rapport de 260/280 entre 1,6 et 2,0 et un rapport de 260/230 entre 2,0 et 2,2. Extraction d’échantillons de contrôle : Effectuer une extraction d’ADN génomique sur un échantillon de contrôle dérivé du même matériel biologique que les échantillons sujets analysés pour un projet donné. Assurez-vous d’extraire suffisamment d’ADN de contrôle pour toutes les plaques devant être analysées pour l’ensemble de la cohorte, de sorte qu’un seul étalon d’ADN soit utilisé pour tous les essais.Vérifiez la qualité de l’échantillon d’ADN de contrôle par spectrophotomètre et fluoromètre. L’échantillon témoin doit présenter des rapports moyens acceptables de 260/280 et de 260/230 et des concentrations détectables d’ADNdb22,23. Aliquote d’ADN témoin à une concentration de 2 ng/μL en quantités de 150 μL dans des tubes de 0,5 mL étiquetés avec le type d’échantillon et la date. Conservez les aliquotes d’ADN de contrôle à -20 °C jusqu’à 5 ans. Utilisez un échantillon d’ADN de contrôle pour toutes les plaques de tous les échantillons de la même cohorte ou du même projet de recherche. Préparez ces aliquotes à l’avance. Préparation des échantillons analytiques : Pour les échantillons dont la concentration initiale est de >5 ng/μL, créer des aliquotes de dilution à l’aide d’un facteur de dilution en nombre entier, en ajoutant la quantité appropriée d’échantillon d’ADN extrait (Fichier supplémentaire 1 Fiche de configuration MMqPCR, colonne F) et de PCR de grade H2O (Fichier supplémentaire 1 Feuille de configuration MMqPCR, colonne G) pour diluer la concentration entre 2,5 et 5,0 ng/μL (Fichier supplémentaire 1 Feuille de configuration MMqPCR, colonne K). Ne diluez pas les échantillons à une concentration de <5 ng/μL, mais aliquotez-vous suffisamment de volume pour doser l’échantillon 3x en utilisant ce protocole.REMARQUE : Des aliquotes de dilution doivent être effectuées lors de la préparation de l’échantillon afin que 15 ng d’ADN puissent être ajoutés au tube de bandelettes PCR correspondant à chaque échantillon. Les aliquotes d’échantillons permettent aux techniciens d’éviter que les cycles de gel-dégel inutiles n’affectent l’intégrité de l’ADN de l’échantillon de stock si l’échantillon ne répond pas aux critères de qualité et doit être réanalysé. L’exemple de modèle MMqPCR qui se trouve dans le fichier supplémentaire 1 peut aider à identifier le facteur de dilution et les volumes corrects pour préparer les aliquotes de dilution (fichier supplémentaire 1, feuille de configuration MMqPCR, colonnes E-I).Remplissez les bandelettes de PCR avec les échantillons A1 à 8 dans la bandelette de PCR A, les échantillons B1 à 8 dans la bandelette de PCR B et les échantillons C1 à 8 dans la bande de PCR C, comme indiqué dans le Fichier supplémentaire 1 de la feuille de configuration MMqPCR et répertoriés dans le tableau 3 avec des quantités d’échantillons correctement diluées (Fichier supplémentaire 1 Feuille de configuration MMqPCR, colonne L) et des quantités de PCR de grade H2O (Fichier supplémentaire 1 Feuille de configuration MMqPCR, colonne M) pour une quantité totale de 15 ng d’ADN par tube PCR et un volume total de 75 μL. Mettez-le de côté.REMARQUE : Les échantillons dans des bandelettes PCR peuvent être conservés toute la nuit à 4 °C pour être plaqués le lendemain. Préparation de la courbe standard : décongélation d’une aliquote d’ADN de contrôle, vortex pendant 30 s, centrifugeuse pendant 5 s et aspiration du volume complet (150 μL) dans le premier tube de la bande de tubes PCR de la courbe standard (SC).Pipeter 70 μL de PCR de grade H2O dans le deuxième à le huitième tube de la bandelette SC PCR. Remettez soigneusement en suspension l’ADN de contrôle dans le premier tube avant d’aspirer 70 μL et de le distribuer dans le deuxième tube PCR. Attendez 30 s, puis remettez complètement la solution en suspension dans le deuxième tube PCR avant d’aspirer 70 μL et de la distribuer dans le troisième tube PCR. Répétez cette opération pour les tubes trois à sept afin de créer une dilution en série de sept étalons. Le tube final ne doit contenir que de la PCR de grade H2O pour fonctionner comme un contrôle non matriciel (NTC). Mettez la bandelette SC PCR de côté. Tableau 3 : Organisation des échantillons et de l’étalon de contrôle en plaque. Emplacement de tous les échantillons et étalons sur une plaque de PCR à 96 puits. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau. 3. Préparation du master mix MMqPCR Rassemblez les aliquotes de réactifs du mélange maître énumérées dans le tableau 1, à l’exception de l’ADN polymérase, et laissez-les atteindre la température ambiante à l’intérieur de la hotte de PCR. Ajouter 1 μL de l’aliquote SYBR Green à l’aliquote tampon 1x.REMARQUE : Cette quantité exacte est nécessaire pour générer la concentration correcte de SYBR en raison des limites de la précision de la pipette pendant le test, donc même si une seule plaque est exécutée à la fois, cette quantité doit rester inchangée. Vortex toutes les aliquotes pendant 10 s, centrifuger pendant 5 s, puis ajouter les quantités suivantes de réactifs dans le tube de 5 mL contenant la bétaïne 5 M (maintenant le tube de mélange maître) : 1 235,2 μL de PCR de grade H2O, 640 μL du tampon 10x, 204,8 μL des dNTP, 192 μL de la DTT, 64 μL de MgCl2, 48 μL de SYBR Green / 1x tampon (à partir de l’étape 3.1), 14,4 μL des deux amorces de télomères et 9,6 μL des deux amorces d’albumine, comme indiqué dans le tableau 1. Retirer l’ADN polymérase d’un stockage à -20 °C, vortex pendant 10 s, centrifuger pendant 5 s, puis ajouter lentement 128 μL au mélange maître ; ramènera immédiatement l’ADN polymérase à -20 °C. Vortex le tube de mélange principal de 5 mL pendant 30 s. 4. Préparation de la plaque à 96 puits Placez deux plaques de 96 puits, l’auge de chargement et les pointes de pipette multicanaux à l’intérieur du capot PCR. Étiquetez chaque plaque avec le numéro de plaque (1 ou 2). Tournez la plaque 1 (la plaque P1) de 180° de sorte que les numéros des colonnes soient à l’envers. Laissez la plaque deux (P2) face au technicien. Versez le contenu du tube de mélange principal de 5 ml dans l’auge de chargement. À l’aide d’une pointe de pipette, on recueille et distribue la solution restante dans le tube. Chargez les pointes sur la pipette multicanaux, en poussant à la base de chaque pointe de pipette pour assurer une étanchéité parfaite. Vérifiez que les embouts n’ont pas de filtre dans la région de sortie où le mixage principal sera aspiré ; S’il y a un morceau de filtre, remplacez l’embout. Utilisez le pipetage inversé pour remplir les plaques avec le mélange maître visqueux, faites tourner l’auge de chargement, puis enfoncez le piston de la pipette au-delà de la première butée, en aspirant plus de 15 μL dans les pointes de la pipette, en vous assurant que les pointes se remplissent en même temps avec le même volume. Lorsque vous expulsez le mélange principal dans une colonne, appuyez sur le piston jusqu’à la première butée, en laissant le mélange principal supplémentaire dans les pointes de pipette. En laissant le piston enfoncé, replongez les pointes dans l’auge de chargement et relâchez le piston pour remplir les pointes avec 15 μL supplémentaires. Utilisez les mêmes pointes pour remplir les deux plaques.Remplissez les plaques en expulsant le mixage principal dans toutes les colonnes paires ou toutes les colonnes impaires en premier, en alternant entre les plaques (c’est-à-dire que si le technicien choisit de commencer par les numéros de colonnes impairs, la colonne 1 sur P2 sera remplie en premier, suivie de la colonne 11 sur P1, puis de la colonne 3 sur P2, etc.). Une fois que le technicien a rempli tous les puits de la série (pair ou impair) en travaillant de gauche à droite, faites l’autre série (paire ou impaire) de colonnes de la même manière. Voir la figure 2 pour un graphique de ce processus.REMARQUE : Cette méthode de remplissage des plaques fonctionne pour contrôler les effets de position sur les plaques. Vortex les quatre bandelettes de PCR fermées contenant les échantillons et la courbe standard puis essorez-les chacune dans une mini centrifugeuse pendant 5 s.Alignez les bandelettes PCR dans le support de tube PCR dans l’ordre de leur position sur la plaque. Pour P1, les 3 premières colonnes sont des échantillons (bandelette PCR A), les colonnes 4 à 6 sont l’échantillon standard (bandelette PCR S), les colonnes 7 à 9 sont des échantillons (bandelette PCR B) et les colonnes 10 à 12 sont des échantillons (bande PCR C ; voir la figure 3 et le tableau 3). Étant donné que P2 est rempli en étant tourné à 180° par rapport au technicien, les colonnes seront opposées. Tournez les deux plaques à 180° de sorte que les numéros des colonnes soient inversés par rapport au technicien pour chaque plaque (c’est-à-dire que si le technicien a déjà fait face à l’étiquette pour P2, il fera maintenant face à l’étiquette pour P1 sur le bord de la plaque). Réglez la pipette multicanaux sur 10 μL et chargez les pointes de la pipette sur la pipette multicanaux comme décrit à l’étape 4.3.À l’aide de la pipette multicanaux, les solutions sont remises en suspension, puis effectuent le pipetage inverse décrit à l’étape 4.4 pour aspirer et distribuer 10 μL d’échantillons et de solutions étalons, en commençant par la bandelette PCR A. Remplissez les 3 premières colonnes de chaque plaque à l’aide de la bande PCR A en alternant les colonnes de la même manière que le mélange maître a été placé dans la plaque (c’est-à-dire pair ou impair). Remplissez les trois colonnes suivantes à l’aide de la bande PCR de courbe standard. Pour cette bandelette, remettre en suspension le 7ème tube de dilution étalon (avant-dernier), à l’aide d’une pipette de 200 μL réglée à ~90 μL, soigneusement avant de remettre en suspension l’ensemble de la bande à l’aide de la pipette multicanaux.REMARQUE : Le volume plus important et la plus faible concentration d’ADN dans ce tube entraînent souvent des mesures variées dans les puits de la plaque PCR en raison d’un mauvais mélange. L’utilisation d’un volume plus important pour mélanger ce tube permet d’homogénéiser davantage la solution d’ADN. Remplissez les trois colonnes suivantes avec la bandelette PCR B et les trois dernières avec la bandelette PCR C. Replacez les pointes de pipette entre chaque bandelette PCR, en remplissant les 96 puits des deux plaques avec les échantillons correspondants et l’étalon de contrôle, comme indiqué à la figure 3. Une fois les plaques remplies, tapotez doucement la plaque sur le dessus de la paillasse pour vous assurer que le liquide sur les côtés des puits s’écoule vers le bas, puis couvrez le dessus des plaques à l’aide de films d’étanchéité. Du bout des doigts, appuyez sur tous les bords du film pour assurer une fermeture étanche.Mélangez les plaques en remuant sur le dessus de la hotte pendant 30 s, puis placez les plaques scellées dans la toupie pendant 2 min avec les ouvertures du puits vers le centre. Placez les plaques dans un thermocycleur, avec les numéros des colonnes des plaques dans un ordre lisible. Utilisez un mouchoir propre pour nettoyer le haut de chaque plaque avant de fermer le dessus du thermocycleur. Figure 2 : Processus de remplissage des plaques. (A) Si vous choisissez de remplir d’abord les colonnes impaires, c’est l’ordre dans lequel les puits sont remplis. (B) Si vous choisissez de remplir les colonnes paires en premier, c’est l’ordre dans lequel les puits sont remplis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Disposition des plaques. Les bandelettes de PCR A, B, C et la bande de courbe standard (SC) doivent toutes être utilisées pour remplir trois colonnes sur chaque plaque afin de produire des triplets en double de chaque échantillon et dilution de l’étalon. Ce schéma montre quelles colonnes doivent être remplies avec chaque bande. La deuxième plaque est retournée à 180° (notez que les en-têtes de colonne et de ligne sont à l’envers) avant le chargement, mais la plaque est remplie de la même manière que la première plaque, éliminant ainsi les erreurs de pipetage potentielles tout en contrôlant les effets de position sur les plaques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 5. Thermocyclage MMqPCR Pendant que les plaques tournent à l’étape 4.8.1, allumez l’ordinateur et les thermocycleurs. Ouvrez le logiciel du thermocycleur. Ce protocole décrit l’utilisation du logiciel CFX Maestro. Créez le protocole de thermocyclage TL conformément au protocole de thermocyclage MMqPCR19 (Figure 4).Ajouter une étape d’incubation pour activer l’ADN polymérase à 95 °C pendant 15 min. Pour éviter la liaison amorce-dimère, exécutez deux cycles de 94 °C pendant 15 s, 49 °C pendant 1 min, puis 3 cycles de 94 °C pendant 15 s, 59 °C pendant 15 s. Pour l’amplification des télomères, ajoutez 27 cycles de 85 °C pendant 15 s, 74 °C pendant 30 s, puis l’acquisition du signal. Pour l’amplification de l’albumine, ajouter 31 cycles de 94 °C pendant 15 s, 84 °C pendant 30 s, puis acquisition du signal. Inclure une courbe de fusion de 59 °C à 95 °C à des intervalles de 5 s pour chaque degré croissant dans le protocole de cycle thermique. Cliquez sur Démarrer l’exécution pour les deux thermocycleurs. Lorsque vous y êtes invité, donnez un titre aux fichiers d’analyse. Figure 4 : Profil de thermocyclage du test MMqPCR. Protocole MMqPCR créé dans le logiciel conformément au protocole de thermocyclage d’origine19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 6. Analyse des données MMqPCR Une fois le thermocyclage terminé, analysez les données de la manière suivante pour produire des valeurs TL pour les échantillons qui ont été traités. Dans le logiciel, sélectionnez la fonction Configuration de la plaque . Dans le menu déroulant, cliquez sur Afficher/Modifier la plaque.Mettez en surbrillance tous les puits et cliquez sur Sélectionner des fluorophores, puis cochez la case SYBR et décochez toutes les autres cases. Cliquez sur OK. Bien que tous les puits soient toujours en surbrillance, à côté du mot Load, cochez la case en regard de SYBR. Maintenant, tous les puits devraient avoir SYBR écrit dessus. Ensuite, mettez en surbrillance les trois puits NTC en haut ou en bas de la dilution en série de contrôle standard et sélectionnez NTC dans le menu des types d’échantillon à droite. Les trois puits devraient maintenant être jaunes et s’appeler NTC. La figure 5A montre quels puits doivent être sélectionnés pour P1 et la figure 5B montre quels puits doivent être sélectionnés pour P2.REMARQUE : P2 sera inversé à partir de P1, de sorte que le NTC sera en bas des colonnes 4-6 pour P1 et en haut des colonnes 7-9 pour P2. Mettez en surbrillance les 21 puits de la dilution en série de contrôle standard et sélectionnez Standard dans le menu des types d’échantillon. Ces puits doivent être verts. Pendant que ces puits sont toujours en surbrillance, cliquez sur Réplication technique. Sélectionnez 3 dans le menu Taille de réplication, puis sélectionnez Horizontal > Appliquer. Ces puits doivent être étiquetés par groupes de trois de Std-1 à Std-7. Bien que la norme soit toujours en surbrillance, faites défiler vers le bas et sélectionnez Série de dilution. Dans le champ Facteur de dilution, entrez 2, puis tapez la concentration de départ et la directionnalité de la dilution selon le numéro de plaque, comme décrit dans les étapes suivantes. Pour la plaque P1, entrez 2.00E-03 dans le champ de concentration de départ, cochez la case Dégressif, puis sélectionnez Appliquer. Les valeurs dans les 21 puits doivent avoir les valeurs de concentration écrites dans chaque puits, allant de 2.00E-03 à 3.13E-05 de haut en bas. Pour la plaque P2, entrez 3.13E-5 dans le champ de concentration de départ, cochez la case Augmentation , puis sélectionnez Appliquer. Les valeurs dans les 21 puits doivent avoir les valeurs de concentration écrites dans chaque puits allant de 3,13E-05 à 2,00E-03 de haut en bas. Pour les échantillons, mettez en surbrillance les colonnes de la bandelette PCR A (1-3 pour P1 et P2), sélectionnez Inconnu dans le menu du type d’échantillon, puis sélectionnez Réplication technique. Sélectionnez 3 dans le menu Taille de réplication , puis sélectionnez Horizontal > Appliquer. Les puits de ces colonnes doivent être bleus et étiquetés par ligne par ensembles de 3 de Unk-1 à Unk-8.Répétez l’étape 6.3 pour les colonnes de la bandelette PCR B (colonnes 7-9 pour P1 et 4-6 pour P2). Ils devraient être étiquetés Unk-9 à Unk-16. Répétez l’étape 6.3 pour les colonnes de la bande PCR C (colonnes 10-12 pour P1 et P2). Ils devraient être étiquetés Unk-17 à Unk-24. Lorsque les étapes 6.2 à 6.3.2 sont terminées, les fenêtres de configuration de la plaque doivent ressembler à celles de la figure 5A, B. Sélectionnez OK en bas à droite de la fenêtre de l’éditeur de plaques. Cliquez sur Oui pour appliquer les modifications lorsque vous y êtes invité. Pour le contrôle de la qualité au niveau du test, assurez-vous que les courbes de l’onglet de quantification sont appropriées (p. ex., pas de courbes d’amplification inversées) pour les étapes 9 et 12 du profil de thermocyclage, qui correspondent respectivement aux amplicons des télomères et de l’albumine. Les courbes sont accessibles par le menu déroulant situé au milieu à droite de la fenêtre du logiciel. Les figures 6A et B montrent les courbes appropriées.S’assurer que l’efficacité de la PCR indiquée à l’étape 9 et à l’étape 12 se situe entre 90 % et 110 % et que ces deux efficacités ne diffèrent pas l’une de l’autre de plus de 10 % (c.-à-d. que 92,4 % pour l’étape 9 et 98 % pour l’étape 12 sont appropriés, mais que 92,4 % pour l’étape 9 et 108 % pour l’étape 12 ne sont pas appropriés). De plus, assurez-vous que la courbe R2 standard est de >0,995. Si P1 ou P2 ne répond pas à ces critères, les plaques doivent être refaites. Pour P1, sélectionnez l’étape 9 et mettez en surbrillance les 21 puits correspondant à la courbe standard, comme le montre la figure 6A,B. Copiez les valeurs Cq dans le coin inférieur droit de la fenêtre du logiciel. Ouvrez le modèle de feuille de données des télomères disponible en tant que fichier supplémentaire 1 et collez ces valeurs dans la feuille standard 1, colonne B. Sélectionnez Étape 12, puis copiez ces valeurs Cq. Collez ces valeurs dans la feuille standard 1, colonne I.Identifiez la valeur de pente à l’étape 9 et saisissez-la dans la cellule C4 de la feuille standard 1. Identifiez la valeur de pente à l’étape 12 et saisissez-la dans la cellule J4 de la feuille standard 1.REMARQUE : Le système calcule le pourcentage d’efficacité des amorces à l’aide des pentes de la courbe standard identifiée à l’étape 6.6.1. Le pourcentage d’efficacité peut être calculé manuellement à l’aide de la formule suivante : S’assurer que le coefficient de variation (CV) de chaque trilot de dilution standard est inférieur à 0,1. S’ils sont supérieurs ou égaux à 0,1, exclure jusqu’à trois puits individuels au total de toutes les concentrations d’échantillons témoins inclus dans la courbe de dilution en série standard à 7 points sur la plaque. Un seul puits doit être exclu d’un ensemble en trois exemplaires.REMARQUE : L’exclusion des points standard de l’analyse sur le logiciel modifiera la pente, R, l’ordonnée à l’origine et l’efficacité des deux amorces. Ainsi, une fois qu’un puits étalon a été retiré de l’analyse, les étapes 6.5.1 à 6.6.1 doivent être répétées. Répétez les étapes 6.6.1 à 6.6.2 pour le fichier d’analyse P2 et la feuille standard 2 correspondante. Ce n’est que lorsque les feuilles standard 1 et standard 2 sont remplies avec des CV acceptables que les données d’échantillon individuelles sont collectées à partir des fichiers d’analyse. Assurez-vous que les ajustements du CQ sont déclarés dans la colonne L de la feuille P1 par rapport à la colonne P2, p. ex., combien de puits ont été exclus dans le fichier d’analyse P1. Assurez-vous que seuls les 72 puits d’échantillonnage du fichier d’analyse P1 sont mis en surbrillance en bleu dans l’onglet Quantification, comme indiqué dans Graphique 7A,B. Choisir Étape 9. Copiez les valeurs Cq et SQ dans le coin inférieur droit de la fenêtre du logiciel. Collez ces valeurs dans la feuille P1 de l’échantillon, en commençant par la cellule D3. Choisir Étape 12 puis copiez ces valeurs Cq et SQ, et collez-les dans la feuille P1 des échantillons, en commençant par la cellule F3.Répétez cette étape pour les échantillons du fichier d’analyse P2 et de la feuille P2 correspondante. Les rapports télomères/copies simples (T/S) (colonne H) sont calculés automatiquement, mais peuvent être calculés manuellement à l’aide de la formule suivante :Où ET/S est l’efficacité de l’amplification exponentielle pour les réactions ciblant respectivement le gène des télomères ou des copies uniques, et CqT/S est le cycle auquel une réplique donnée ciblant le contenu télomérique ou le gène à copie unique atteint le seuil critique de quantification de la fluorescence. Les rapports T/S moyens (colonne I) sont calculés sur six mesures par échantillon.REMARQUE : Les numéros d’identification de l’échantillon en CFX ne correspondent pas au même échantillon biologique sur les deux plaques. Le modèle de fiche technique des télomères tient compte de cette différence et alignera les triplets en double appropriés. Dans CFX Maestro, vérifiez que les valeurs Cq de tous les échantillons analytiques se situent entre la valeur Cq la plus basse et la valeur Cq la plus élevée de la courbe standard, comme le montre la figure 7B. Si un échantillon se trouve en dehors de la plage comme le montre la figure 7A, il devra être analysé à nouveau après ajustement de la concentration. Un échantillon dont la valeur Cq est inférieure à l’étalon de concentration le plus élevé doit être dilué par un facteur approximatif au nombre de cycles d’amplification où il est hors de portée, et un échantillon dont la valeur Cq est supérieure à l’étalon de concentration le plus bas devrait être concentré par un facteur approximatif au nombre de cycles d’amplification au-delà du seuil.REMARQUE : Une grande variation de la concentration des échantillons analytiques introduit un niveau potentiel supplémentaire de variation et doit être effectuée avec prudence. S’assurer que la concentration initiale dans le NTC était inférieure à 5 % de la quantité moyenne d’ADN présente dans les puits d’échantillons. Cela peut être vérifié en visualisant le pourcentage de contamination de l’eau sur les feuilles des échantillons P1 et P2 du MMqPCR. Si le NTC indique une contamination, relancez les plaques.REMARQUE : En raison de la sensibilité du test MMqPCR, une contamination mineure incontrôlable peut occasionnellement provoquer une amplification des puits NTC. Cependant, cette amplification doit être mineure et se produire plusieurs cycles après l’amplification du gène à copie unique à l’étape 12 du protocole de thermocyclage. Pour le contrôle de la qualité au niveau de l’échantillon, examinez les écarts-types (ET) (colonne J) et les CV (colonne K) dans les échantillons P1 et les exemples de feuilles P2. S’assurer que les CV intraplaques sur les rapports T/S triples de l’échantillon sont inférieurs à 0,10 (10 %). Pour corriger tout CV intraplaque supérieur à 0,1, un rapport T/S d’un ensemble de triplets peut être exclu.REMARQUE : Une seule répétition totale des six mesures par échantillon peut être exclue, c’est-à-dire qu’une répétition pour le même échantillon ne peut pas être exclue à la fois sur P1 et P2. Vérifiez que les CV interplaques de chaque échantillon dans la feuille P1 v P2, colonne G, sont inférieurs à 0,05 (5%). Pour corriger tout CV supérieur à 0,05, effectuez l’exclusion d’un rapport T/S des six mesures par échantillon sur les deux plaques. Exclure les échantillons après inspection visuelle sur les triplets intraplaques et les six mesures si nécessaire.REMARQUE : Seuls les échantillons satisfaisant à ces critères de CQ, CV intraplaque < 10 % et CV interplaque < 5 %, peuvent être inclus dans les résultats finaux de TL. Sinon, l’échantillon doit être exclu des fiches techniques P1 v P2 et ICC pour cette analyse, et l’échantillon doit être réévalué lors d’un deuxième test MMqPCR. Pour le contrôle de la qualité au niveau de la plaque, vérifiez que la variation intraplaque moyenne entre tous les échantillons de chaque plaque, située au bas des feuilles des échantillons P1 et P2, est inférieure à 0,05 (5 %). Pour un contrôle de la qualité supplémentaire au niveau de la plaque, vérifiez que la variation globale entre les plaques dans la feuille P1 par rapport à la feuille P2, cellule G29, est inférieure à 0,06 (6 %). Assurez-vous que les échantillons qui n’ont pas réussi le CQ sont retirés du calcul du CV interplaque dans la cellule G30.REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec des groupes d’échantillons associés (par exemple, des membres de la famille, des points temporels différents, etc.), tous les échantillons d’un groupe doivent être analysés sur la même plaque. Par conséquent, si un échantillon du groupe ne satisfait pas aux critères de contrôle qualité, tous les échantillons du groupe doivent être réanalysés. Dans un fichier de données global de cohorte ou d’expérience distinct, enregistrez les données finales de CQ pour chaque échantillon qui a réussi le CQ (feuille P1 v P2, colonne I), les calculs ICC pour chaque échantillon qui a réussi le CQ (feuille de données ICC, colonnes E-K) et les données finales du test QC de la feuille P1 v P2 (colonnes J-L) Utilisez le fichier supplémentaire 2 créé par le Telomere Research Network (TRN) pour calculer l’ICC pour le projet20. Enfin, pour améliorer la comparabilité entre les études TL, transformez les données TL finales pour chaque échantillon de la cohorte globale distincte ou du fichier de données d’expérience en scores Z à l’aide de l’équation suivante où le rapport T/S moyen pour tous les échantillons de la cohorte est soustrait du rapport T/S de l’échantillon individuel, puis divisé par l’ET pour tous les échantillons de la cohorte. Figure 5 : Configuration logicielle de la plaque. (A) Configuration logicielle d’une plaque P1 après avoir terminé les étapes 6.2 à 6.4. (B) Configuration logicielle d’une plaque P2 après avoir terminé les étapes 6.2 à 6.4. Les ID d’échantillon et de norme ne sont pas alignés entre les deux plaques CFX en raison de la façon dont le logiciel attribue les ID d’échantillon en fonction de la position du puits (c’est-à-dire que l’échantillon CFX 1 sur P1 est l’échantillon CFX 24 sur P2). Le modèle Excel fourni dans le fichier supplémentaire 1 en tient compte, en veillant à ce que les mesures interplaques effectuées sur le même échantillon biologique soient correctement alignées les unes par rapport aux autres. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Courbes standard pour les amplicons del’élomère et de l’albumine. (A) Cette courbe standard provient de l’amplicon du télomère P1 de l’ensemble de données de résultats représentatifs. Une norme a été supprimée parce qu’elle ne répondait pas aux critères de CQ. (B) Cette courbe standard provient de l’amplicon d’albumine P2 de l’ensemble de données de résultats représentatifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 7 : Amplicons de télomères et de gènes à copie unique. (A) Amplification des télomères et (B) amplification du gène de l’albumine d’échantillons rapportés dans des résultats représentatifs affichés dans le logiciel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 7. Communication des données MMqPCR Lorsque vous rapportez les résultats de la recherche à l’aide des données TL créées à partir du MMqPCR, assurez-vous de déclarer les éléments décrits dans les directives minimales de déclaration TRN. Ces lignes directrices se trouvent sur le site Web du RRT (https://trn.tulane.edu/resources/reporting-guidelines/) et un modèle de déclaration de ces informations est fourni dans le dossier supplémentaire 3. Citez ce protocole et d’autres directives et ressources TRN, le cas échéant.