モノクロマルチプレックス定量的PCRテロメア長さ測定

この研究は、機関のガイドラインに準拠して実施されました。このプロトコルは、重複するトリプリケートの測定深度、すなわち、各サンプルを重複するプレート間で繰り返されるトリプリケート測定で実施するMMqPCRアッセイを、スループットを向上させるために2つのサーモサイクラーを同時に使用して実装するものです。重複プレートの使用は、高いICCで示される高い再現性を達成するために、このプロトコルの実装において最も重要な考慮事項です。より少ない反復を使用することは可能であるが、ICCへの影響、ひいては検出力および必要なサンプルサイズへの影響は、各検査室20,21による各コホートで慎重に検討され、測定される必要がある。サーモサイクラーが1つしかない場合は、測定深度を維持し(つまり、重複するトリプリケート)、2つのプレートを順番に実行することをお勧めします。 1. ストックの調製および保管条件 このプロトコルに使用されるすべての材料と機器については、 材料の表を参照してください。さらに、MMqPCRアッセイに使用した特定のマスターミックス試薬および量については、 表1を参照してください。2つのプレートを連続して分析する場合は、濃度を維持しながらマスターミックスの量を半分にし、同じアッセイの連続したプレート間で同じ試薬アリコートが使用されるようにします。注:すべてのストック試薬は事前に準備し、分注した試薬は完全に解凍してから使用する必要があります。 1x Tris-EDTA、pH 7.6 (TE) を 5 mL チューブに入れ、室温 3 mL で最大 2 年間分注して保存します。 5 M Betaine を 5 mL チューブに入れ、1,280 μL 容量、-20 °C で最大 1 年間分注して保存します。 SYBR Greenを3 μLの容量で個々のPCRストリップチューブに-20°Cで最大2年間分注し、ホイルで覆い、光への曝露を最小限に抑えて保存します。 DNAポリメラーゼを元のチューブに-20°Cで最大1年間保存します。 10x ポリメラーゼバッファーを 1.5 mL チューブに入れ、660 μL の容量で -20 °C で最大 1 年間分注して保存します。10xポリメラーゼバッファーを1倍バッファー希釈する場合は、0.5 mLチューブ中の89.1 μLのPCRグレードH2Oに9.9 μLの10xバッファーを添加します。-20°Cで最大1年間保管してください。 1 M MgCl2 を0.5 mLチューブに70 μLの容量で分注し、光から4°C離して最大1年間保存します。 フォワードテロメアおよびリバーステロメア(T)およびシングル(S)コピー遺伝子オリゴヌクレオチド凍結乾燥プライマーは、光から離れた室温で保存してください。4つの特異的オリゴヌクレオチドプライマー配列を 表2に示します。注:このプロトコルの単一コピー遺伝子はアルブミンです。異なるシングルコピー遺伝子を選択する場合、許容可能なPCR効率を確保するためにプライマー濃度を調整する必要がある場合があります。プライマーの再構成:凍結乾燥プライマーチューブを各チューブに10秒間ボルテックスし、次にチューブをミニ遠心分離機に5秒間入れて、凍結乾燥ペレットがチューブの底にあることを確認してから、1x TEバッファーを添加します。 各プライマーチューブのnM濃度([nM]= α)を確認し、各プライマーチューブにα値の10倍に等しい1x TEをμLで追加して再水和します(たとえば、チューブのnM濃度が24.6 nMを示している場合は、プライマーチューブに246 μLの1x TEを添加して、各プライマーの100 μM溶液を作成します)。 フォワードテロメアプライマーとリバーステロメアプライマーは16 μL容量で別々に、フォワードおよびリバースアルブミンプライマーは11 μL容量で別々にアリコートします。4種類のプライマーアリコートはすべて、-20°Cで最大6ヶ月間保存してください。 dNTP混合物:4種類のdNTPSタイプの25 mMストック溶液(つまり、合計16〜32本のチューブ)のそれぞれを4〜8本のチューブで10秒間ボルテックスした後、ミニ遠心分離機を使用して室温ですばやくスピンダウンします。ミニ遠心分離機のチューブ位置にチューブを均等に配置し、蓋を閉めて機械が全速力に達し、約5秒間回転します。5 mLのチューブに、各チューブから200〜250 μLを加え、4つのdNTPタイプのそれぞれを均等に追加し、dNTP混合物をボルテックスします。 210 μLの混合物を0.5 mLチューブに分注し、-20°Cで最大1年間保存します。 ストックDTTは-20°Cで保存し、3 M酢酸ナトリウムは室温でストックします。DTTソリューション:ステンレス製のヘラを使用して、はかりで風袋を塗った計量ボートで0.1545 gのDTTを測定します。注意:ジチオスレイトール(DTT)は危険な試薬です。DTTは、飲み込むと有害で、皮膚の炎症を引き起こし、深刻な眼の損傷を引き起こす可能性があります。DTTを取り扱うときは、保護手袋、目の保護具、顔の保護具を着用する必要があります。さらに、DTT蒸気の呼吸を避け、DTTを取り扱うときはPCRフードで作業し、長時間または繰り返しの曝露を避ける必要があります。 15 mLチューブに33.33 μLの3 M酢酸ナトリウムと9,967 μLのPCRグレードH2Oを加えて、0.01 M酢酸ナトリウム10 mLを調製し、ボルテックスウェルでウェルします。測定したDTTを0.01 M酢酸ナトリウムの15 mLチューブに加えます。0.01 M酢酸ナトリウム溶液の約100 μLを計量ボートに移し、残留DTTを回収します。100 μLをピペットで15 mLチューブに戻します。すべてのDTTが溶液中に入ったら、チューブが完全に溶解するまでチューブをボルテックスします。 15 mLチューブの内容物をローディングトラフに注ぎ、ローディングトラフの一方の端から溶液全体を10 mLプラスチックシリンジに吸引します。滅菌済みの0.2μmの酢酸セルロースシリンジフィルターを充填したシリンジの端に25mm取り付け、1分間完全に飽和させた後、シリンジプランジャーを軽く押し下げて新しい15mLチューブに溶液をゆっくりと滴下し、溶液全体がフィルターを通って新しい15mLチューブに滴下されるようにします。 200 μLの容量のDTT溶液を0.5 mLチューブに分注し、-20°Cで最大6週間保存します。 表1:試薬の最終容量と濃度。 個々のアリコート、マスターミックス、およびPCRウェル中の試薬の量と濃度。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 表2:テロメアおよびシングルコピー遺伝子オリゴヌクレオチドプライマー配列。 方法論で使用されるテロメアおよびアルブミンシングルコピー遺伝子プライマー配列のリスト。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 2. ゲノムDNAの抽出とサンプル調製 分析サンプルの抽出:キットまたはラボ内で確立された方法を使用して、メーカーのガイドラインに従ってサンプルのゲノムDNA抽出を行います。分光光度計でDNAサンプルの品質を確認し、蛍光光度計で二本鎖DNA(dsDNA)を確認します。許容できない平均比 260/280 および 260/230 のサンプル、または検出を下回る dsDNA 濃度 (<0.20 ng/μL) のサンプルは、TL22,23 について分析しないでください。さらに、dsDNA濃度が高すぎて蛍光光度計を使用して読み取り値を生成できない場合は(>1000 ng/μL)、サンプルを希釈してアッセイを繰り返します。注:ここで提示された結果について、核酸の純度の許容値は、1.6〜2.0の260/280比と2.0〜2.2の260/230比でした。 コントロールサンプルの抽出:特定のプロジェクトでアッセイされている対象サンプルと同じ生物学的材料から得られたコントロールサンプルに対してゲノムDNA抽出を実行します。すべてのアッセイで単一のDNA標準が利用されるように、コホート全体で実行することが予想されるすべてのプレートに対して十分なコントロールDNAを抽出するようにしてください。分光光度計と蛍光光度計でコントロールDNAサンプルの品質を確認します。対照サンプルは、許容可能な平均 260/280 および 260/230 の比率と、dsDNA22,23 の検出可能な濃度を持っている必要があります。 サンプルタイプと日付を標識した0.5 mLチューブに、150 μL量で2 ng/μLの濃度のアリコートコントロールDNA。コントロールDNAアリコートは-20°Cで最大5年間保存してください。同じコホートまたは研究プロジェクトから得られたすべてのサンプルのすべてのプレートに対して、1つのコントロールDNAサンプルを使用します。これらのストックアリコートを事前に準備してください。 分析サンプルの調製:開始濃度が>5 ng/μLのサンプルの場合、整数希釈係数を使用して希釈アリコートを作成し、抽出したDNAサンプル(Supplementary File 1 MMqPCR Set Up Sheet、カラムF)とPCRグレードH2O(Supplementary File 1 MMqPCRセットアップシート、カラムG)を添加して、濃度を2.5〜5.0 ng/μLに希釈します(Supplementary File 1 MMqPCRセットアップシート、列K)。<5 ng/μLの濃度でサンプルを希釈しないでください、ただし、このプロトコルを使用してサンプルを3倍アッセイするのに十分な量を分注してください。注:希釈アリコートは、各サンプルの対応するPCRストリップチューブに15 ngのDNAを添加できるように、サンプル調製中に作成する必要があります。サンプルアリコートにより、技術者は、サンプルが品質基準を満たさず、再実行が必要な場合に、ストックサンプルDNAの完全性に影響を与える不必要な凍結融解サイクルを回避できます。 補足ファイル1にあるサンプルMMqPCRテンプレートは、希釈アリコートを調製するための正しい希釈係数と容量を特定するのに役立ちます(補足ファイル1、MMqPCRセットアップシート、列E-I)。PCRストリップに、PCRストリップAのサンプルAにA1-8、PCRストリップBにサンプルB1-8、およびPRCストリップCにサンプルC1-8を、 補足ファイル1 のMMqPCRセットアップシートに詳述され、 表3 にリストされているように、適切に希釈されたサンプル量(補足ファイル1MMqPCR セットアップシート、カラムL)およびPCRグレードH2Oの量(補足ファイル1 )を充填しますMMqPCR Set Up Sheet、カラム M) で、PCR チューブあたり合計 15 ng の DNA と総量 75 μL の場合、脇に置きます。注:PCRストリップ内のサンプルは、4°Cで一晩保存し、翌日に播種することができます。 標準曲線の準備:コントロールDNAアリコートを解凍し、ボルテックスで30秒間、遠心分離機で5秒間遠心分離し、全容量(150μL)を標準曲線(SC)PCRチューブストリップの最初のチューブに吸引します。70 μL の PCR グレード H2O を SC PCR ストリップの 2 本目から 8 本目のチューブにピペットで挿入します。コントロールDNAを1本目のチューブに再懸濁してから、70 μLを吸引し、2本目のPCRチューブに分注します。30 秒待ってから、溶液を 2 番目の PCR チューブに完全に再懸濁してから、70 μL を吸引して 3 番目の PCR チューブに分注します。これをチューブ 3 から 7 に対して繰り返して、7 つの標準試料を 2 倍に段階希釈します。最終的なチューブには、非テンプレートコントロール(NTC)として機能するために、PCRグレードH2Oのみが含まれている必要があります。SC PCRストリップを脇に置きます。 表3:プレート内のサンプルと管理基準の整理。 96ウェルPCRプレート上のすべてのサンプルと標準の位置。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 3. MMqPCRマスターミックスの調製 表1にリストされているマスターミックス試薬アリコート(DNAポリメラーゼを除く)を収集し、PCRフード内で室温に戻します。1 μL の SYBR Green 分注を 1x バッファー分注に加えます。注:この正確な量は、アッセイ中のピペットの精度の制限により、SYBRの正しい濃度を生成するために必要ですので、一度に1つのプレートのみを実行する場合でも、この量は変更しないままにする必要があります。 すべてのアリコートを10秒間ボルテックスし、5秒間遠心分離した後、5 Mベタインを保持している5 mLチューブ(現在のマスターミックスチューブ)に次の量の試薬を加えます:1,235.2 μLのPCRグレードH2O、640 μLの10xバッファー、204.8 μLのdNTP、192 μLのDTT、 表1に記載されているように、MgCl2 64 μL、SYBR Green / 1x バッファー (ステップ 3.1 から) 48 μL、両方のテロメア プライマー 14.4 μL、および両方のアルブミン プライマー 9.6 μL です。 DNAポリメラーゼを-20°Cで保存し、ボルテックスで10秒間、遠心分離して5秒間遠心分離し、マスターミックスに128μLをゆっくりと加えます。直ちにDNAポリメラーゼを-20°Cに戻します。 5 mLマスターミックスチューブを30秒間ボルテックスします。 4. 96ウェルプレートの作製 2つの96ウェルプレート、ローディングトラフ、およびマルチチャンネルピペットチップをPCRフード内に置きます。各プレートにプレート番号(1または2)のラベルを付けます。プレート1(P1プレート)を180°回して、列の番号が逆さまになるようにします。プレート2(P2)を技術者に向けて残します。 5 mLマスターミックスチューブの内容物をローディングトラフに注ぎます。ピペットチップを使用して、チューブに残っている溶液を収集して分注します。 チップをマルチチャンネルピペットにロードし、各ピペットチップの基部を押して密閉します。チップに、マスターミックスが吸引される出力領域内にフィルターがないことを確認します。フィルターがある場合は、チップを交換してください。 リバースピペッティングを使用してプレートに粘性マスターミックスを充填し、ローディングトラフを旋回させてから、ピペットプランジャーを最初のストップを超えて押し下げ、ピペットチップに15μL以上を吸引し、チップが同じ容量で同時に満たされるようにします。マスターミックスをカラムに排出するときは、プランジャーを最初のストップまで押し下げ、余分なマスターミックスをピペットチップに残します。プランジャーを押したまま、チップをローディングトラフに戻し、プランジャーを解放してチップをさらに15μL充填します。マスターミックスを最初にすべての偶数列またはすべての奇数列に排出し、プレート間で交互にプレートを充填します(つまり、技術者が奇数の列番号から開始することを選択した場合、P2の列1が最初に充填され、次にP1の列11、次にP2の列3が充填されます)。技術者が左から右に動作する系列 (奇数または偶数) のすべてのウェルを埋めたら、同じ方法で列の他の系列 (偶数または奇数) の列を実行します。このプロセスのグラフについては、 図 2 を参照してください。注:このプレート充填方法は、プレート全体の位置効果を制御するために機能します。 サンプルと検量線を含む4つの閉じたPCRストリップをボルテックスし、ミニ遠心分離機でそれぞれを5秒間回転させます。PCRチューブラックにPCRストリップをプレートにどのように配置するかの順に並べます。P1の場合、最初の3つのカラムはサンプル(PCRストリップA)、カラム4〜6は標準(PCRストリップS)、カラム7〜9はサンプル(PCRストリップB)、カラム10〜12はサンプル(PCRストリップC; 図3 および 表3を参照)です。P2は技術者に対して180°回転させながら充填されるため、カラムは逆になります。 両方のプレートを180°回転させて、各プレートの技術者に対して列の番号が反転します(つまり、技術者が以前にP2のラベルに面していた場合、プレートの端でP1のラベルに面するようになります)。 マルチチャンネルピペットを10 μLに設定し、手順4.3の説明に従ってピペットチップをマルチチャンネルピペットにロードします。マルチチャンネルピペットを使用して溶液を再懸濁し、ステップ4.4で説明した逆ピペッティングを行い、PCRストリップAから始めて、10 μLのサンプルと標準溶液を吸引して分注します。 PCRストリップAを使用して、マスターミックスをプレートに入れたのと同様の方法(すなわち、偶数または奇数)でカラムを交互に使用して、各プレートの最初の3カラムを充填します。 次の 3 列を標準曲線 PCR ストリップで埋めます。このストリップでは、~90 μL に設定した 200 μL ピペットを使用して 7番目の 標準希釈チューブ (最後から 2 番目) を再懸濁し、マルチチャンネルピペットを使用してストリップ全体を再懸濁します。注:このチューブ内の容量が大きく、DNA濃度が小さいため、混合が不十分なため、PCRプレートウェル全体の測定値が頻繁に異なります。このチューブを混合するためにより大きな容量を使用すると、DNA溶液がより均一化されます。 次の3つのカラムにPCRストリップBを、最後の3カラムにPCRストリップCを充填し、各PCRストリップの間にピペットチップを交換し、 図3に示すように、両方のプレート上のすべての96ウェルに対応するサンプルとコントロール標準液を充填します。 プレートが充填されたら、ベンチトップのプレートを軽くたたいて、ウェルの側面の液体が底に流れ込むことを確認してから、シーリングフィルムでプレートの上部を覆います。指先を使ってフィルムのすべての端を押し下げ、しっかりと密閉します。フードトップで30秒間渦巻いてプレートを混合し、次に密封されたプレートをウェル開口部を中央に向けてプレートスピナーに2分間置きます。 プレートをサーモサイクラーに置き、プレートの列番号を読みやすい順序で並べます。サーモサイクラートップを閉じる前に、清潔なティッシュを使用して各プレートの上部を清掃します。 図2:プレートを充填するプロセス。 (A) 奇数列を最初に埋めることを選択した場合、これがウェルが埋められる順序です。(B)最初に偶数列を埋めることを選択した場合、これがウェルが埋められる順序です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:プレートレイアウト。 PCR ストリップ A、ストリップ B、ストリップ C、および標準曲線(SC)ストリップをすべて使用して、各プレートの 3 つのカラムを充填し、各サンプルと標準希釈液の重複トリプリケートを生成する必要があります。この図は、各ストリップで埋める列を示しています。プレート2はロード前に180°反転します(列と行のヘッダーが逆さまになっていることに注意してください)が、プレートはプレート1と同じように充填されるため、プレート全体の位置効果を制御しながら、潜在的なピペッティングエラーを排除します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 5. MMqPCRサーモサイキング 手順4.8.1でプレートが回転している間に、コンピューターとサーモサイクラーの電源を入れます。サーモサイクラーソフトウェアを開きます。このプロトコルは、CFX Maestro ソフトウェアの使用を説明しています。 MMqPCR サーモサイクリング プロトコル 19 に従って TL サーモサイクリング プロトコルを作成します19（図 4)。インキュベーションステップを追加して、DNAポリメラーゼを95°Cで15分間活性化します。 プライマーとダイマーの結合を避けるため、94°Cで15秒間、49°Cで1分間、次いで94°Cで15秒間、59°Cで15秒間のサイクルを3サイクル実行します。 テロメア増幅には、85 °C で 15 秒、74 °C で 30 秒の 27 サイクルを加えてから、シグナル取得を行います。 アルブミン増幅の場合は、94°Cで15秒間、84°Cで30秒間の31サイクルを加えてから、シグナル取得を行います。 熱サイクルプロトコルの度数が増加するごとに、59°Cから95°Cまでの5秒間隔の溶融曲線を含めます。 両方のサーモサイクラーの [実行開始 ]をクリックします。プロンプトが表示されたら、分析ファイルのタイトルを入力します。 図4:MMqPCRアッセイのサーモサイクリングプロファイル。 元の熱サイクリングプロトコル19に従ってソフトウェアで作成されたMMqPCRプロトコル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 6. MMqPCRデータ解析 サーモサイクリングが完了したら、次の方法でデータを分析して、処理されたサンプルのTL値を生成します。 ソフトウェアで、 プレートセットアップ 機能を選択します。ドロップダウンメニューで、[ View/Edit Plate] をクリックします。すべてのウェルをハイライト表示して [Select Fluorophores]をクリックし、[ SYBR ]というラベルの付いたボックスにチェックを入れ、他のすべてのボックスのチェックを外します。 [OK] をクリックします。 すべてのウェルが強調表示されたままで、[ Load] という単語の横にある [SYBR] の横にあるチェックボックスをオンにします。これで、すべての井戸にSYBRが書かれているはずです。 次に、標準コントロール連続希釈の上部または下部にある3つのNTCウェルを強調表示し、右側のサンプルタイプメニューから NTC を選択します。これで、3つの井戸が黄色になり、NTCと呼ばれるようになります。 図 5A は P1 に選択すべきウェルを示し、 図 5B は P2 に選択すべきウェルを示しています。注: P2 は P1 から反転されるため、NTC は P1 の列 4 から 6 の下部に、P2 の列 7 から 9 の上部に表示されます。 スタンダードコントロール連続希釈の21ウェルをハイライトし、サンプルタイプメニューから スタンダード を選択します。これらの井戸は緑色でなければなりません。これらのウェルがまだハイライト表示されている間に、[ Technical Replicate] をクリックします。「Replicate Size」メニューから「 3 」を選択し、「 Horizontal > Apply」を選択します。これらのウェルには、Std-1 から Std-7 までの 3 つのセットでラベルを付ける必要があります。 標準試料がハイライト表示されたまま、下にスクロールして [Dilution Series]を選択します。「Dilution Factor」フィールドに 2 を入力し、次の手順で説明するように、プレート番号に従って希釈開始濃度と方向性を入力します。 P1プレートの場合、開始濃度フィールドに2.00E-03と入力し、 減少 のボックスにチェックを入れて、 適用を選択します。21 のウェルの値には、各ウェルに 2.00E-03 から 3.13E-05 までの濃度値が上から下に書かれている必要があります。 P2プレートの場合、開始濃度フィールドに3.13E-5と入力し、 増加 のチェックボックスをオンにして、 適用を選択します。21 のウェルの値には、各ウェルに 3.13E-05 から 2.00E-03 までの濃度値が上から下に書かれている必要があります。 サンプルについて、PCR ストリップ A の列 (P1 と P2 の 1-3) を強調表示し、サンプルタイプメニューから Unknown を選択し、Technical Replicate を選択します。「Replicate Size」メニューから「3」を選択し、「Horizontal > Apply」を選択します。これらの列のウェルは青色で、Unk-1 から Unk-8 までの 3 つのセットで行ごとにラベル付けする必要があります。PCR ストリップ B のカラム(P1 のカラム 7-9 と P2 のカラム 4-6)について、ステップ 6.3 を繰り返します。Unk-9 から Unk-16 のラベルを付ける必要があります。 PCR ストリップ C のカラム(P1 と P2 のカラム 10 から 12)について、ステップ 6.3 を繰り返します。Unk-17 から Unk-24 のラベルを付ける必要があります。手順6.2〜6.3.2が完了すると、プレートセットアップウィンドウは 図5A、Bのようになります。 プレート エディター ウィンドウの右下にある OK を選択します。「 はい 」をクリックして、プロンプトが表示されたら変更を適用します。 アッセイレベルのQCでは、サーモサイクリングプロファイルのステップ9とステップ12の両方で、それぞれテロメアとアルブミンアンプリコンに対応する定量タブの曲線が適切であることを確認してください(例:逆増幅曲線がない)。カーブには、ソフトウェアウィンドウの右中央にあるドロップダウンメニューからアクセスします。 図6A、B は適切な曲線を示しています。ステップ9とステップ12の両方で報告されたPCR効率が90%から110%の間であり、これら2つの効率が互いに10%以上差がないことを確認してください(つまり、ステップ9の92.4%とステップ12の98%は適切ですが、ステップ9の92.4%とステップ12の108%は適切ではありません)。さらに、標準の R2 曲線が >0.995 であることを確認します。P1またはP2のいずれかがこれらの基準を満たさない場合は、プレートを再実行する必要があります。 P1 では、 ステップ 9 を選択し、 図 6A、B に示すように、標準曲線に対応する 21 個のウェルを強調表示します。ソフトウェアウィンドウの右下隅にあるCq値をコピーします。 補足ファイル1として入手可能なテロメアデータシートテンプレートを開き、これらの値を標準の1シートの列Bに貼り付けます。 ステップ12 を選択してから、これらのCq値をコピーします。これらの値を標準の 1 シートの列 I に貼り付けます。ステップ 9 で勾配値を特定し、これを標準 1 シートのセル C4 に入力します。ステップ 12 で傾き値を特定し、これを標準 1 シートのセル J4 に入力します。注:システムは、ステップ6.6.1で特定した標準曲線の傾きを使用して、プライマーの効率パーセントを計算します。効率のパーセントは、次の式を使用して手動で計算できます。 各標準希釈トリプリケートの変動係数(CV)が0.1未満であることを確認してください。0.1 以上の場合は、プレート上の 7 ポイント標準段階希釈曲線に含まれるすべての濃度のコントロールサンプルから、合計で最大 3 つの個々のウェルを除外します。1つのウェルのみをトリプリケートセットから除外する必要があります。注:ソフトウェア上の解析から標準点を除外すると、両方のプライマーで報告される傾き、R、y切片、および効率が変更されます。したがって、標準ウェルを分析から除外した後、ステップ 6.5.1 から 6.6.1 を繰り返す必要があります。 P2解析ファイルと対応する標準2シートについて、手順6.6.1〜6.6.2を繰り返します。 標準1と標準2の両方のシートが許容可能なCVで完成した場合にのみ、分析ファイルから個々のサンプルデータを収集します。QC調整がP1 v P2シート列Lで報告されていることを確認します(P1分析ファイルで除外されたウェルの数など)。 P1 解析ファイル内の 72 個のサンプルウェルのみが [Quantification] タブで青色で強調表示されていることを確認します。 図7A、B.選ぶ ステップ 9.ソフトウェアウィンドウの右下隅にあるCq値とSQ値をコピーします。これらの値をサンプル P1 シートのセル D3 から貼り付けます。選ぶ ステップ 12 次に、これらの Cq 値と SQ 値をコピーし、セル F3 から始まるサンプル P1 シートに貼り付けます。P2 解析ファイルおよび対応するサンプル P2 シート内のサンプルに対して、この手順を繰り返します。テロメアとシングルコピー(T/S)の比率(カラムH)は自動的に計算されますが、次の式を使用して手動で計算することもできます。ここで、ET/S はテロメアまたはシングルコピー遺伝子をそれぞれ標的とする反応の指数増幅の効率であり、CqT/S は、テロメア含有量またはシングルコピー遺伝子を標的とする特定の複製が蛍光定量の臨界閾値に達するサイクルです。平均T/S比(列I)は、サンプルごとに6回の測定値にわたって計算されます。注:CFXのサンプルID番号は、2つのプレート間で同じ生物学的サンプルに対応していません。テロメアのデータシートテンプレートは、この違いを考慮し、適切な重複する三重を整列させます。 CFX Maestro で、 図 7B に示すように、すべての分析サンプルの Cq 値が標準曲線の最低 Cq 値と最高 Cq 値の間にあることを確認します。 サンプルが図7Aに示すように範囲外にある場合は、濃度調整後に再分析する必要があります。最高濃度標準試料よりも低いCq値を持つサンプルは、範囲外にある増幅サイクル数に近似する係数で希釈する必要があり、最低濃度標準試料よりも高いCq値を持つ試料は、閾値を超える増幅サイクル数に近似する係数で濃縮する必要があります。注:分析サンプルの濃度に大きなばらつきがあると、潜在的なばらつきがさらに大きくなるため、注意して行う必要があります。 NTC の開始濃度が、サンプルウェルに存在する DNA の平均量の 5% 未満であることを確認してください。これは、MMqPCRのサンプルP1およびサンプルP2シートの水質汚染率を表示することで確認できます。NTCが汚染を示している場合は、プレートを再実行してください。注:MMqPCRアッセイの感度により、制御不能な軽微な汚染により、NTCウェルが増幅することがあります。しかし、この増幅は軽微であり、サーモサイクリングプロトコルのステップ12で単一コピー遺伝子増幅の数サイクル後に発生するはずです。 サンプルレベルのQCでは、サンプルP1およびサンプルP2シートの標準偏差(SD)(カラムJ)およびCV(カラムK)を確認します。サンプルのトリプリケートT/S比全体のプレート内CVが0.10(10%)未満であることを確認してください。0.1 を超えるプレート内 CV を補正するには、トリプリケートのセットから 1 つの T/S 比を除外できます。注:サンプルごとに6回の測定値で合計1回の複製のみを除外できます。つまり、同じサンプルの複製をP1とP2の両方で除外することはできません。 P1 v P2 シートの列 G の個々のサンプルプレート間 CV が 0.05 (5%) 未満であることを確認します。0.05 を超える CV を補正するには、両方のプレートでサンプルごとに 6 つの測定値から 1 つの T/S 比を除外します。プレート内トリプリケートと必要に応じて6つの測定すべてにわたる目視検査後にサンプルを除外します。注:これらのQC基準、プレート内CV<10%およびプレート間CV5%<合格したサンプルのみが最終TL結果に含まれる場合があります。そうでない場合は、この分析でサンプルをP1 vs P2およびICCのデータシートから除外し、サンプルを2回目のMMqPCRアッセイで再評価する必要があります。 プレートレベルのQCでは、サンプルP1およびサンプルP2シートの下部にある各プレート上のすべてのサンプルの平均プレート内変動が0.05(5%)未満であることを確認してください。追加のプレートレベルのQCについては、P1 v P2シート(セルG29)の全体的なプレート間変動が0.06(6%)未満であることを確認してください。QCに合格しなかったサンプルがセルG30のプレート間CV計算から削除されていることを確認します。注:関連するサンプルグループ(家族、異なるタイムポイントなど)で作業する場合、グループ内のすべてのサンプルを同じプレートで分析する必要があります。したがって、グループの1つのサンプルがQC基準に合格しなかった場合は、グループ内のすべてのサンプルを再実行する必要があります。 QCに合格した各サンプルの最終TLデータ(P1 v P2シート、列I)、QCに合格した各サンプルのICC計算(ICCデータシート、列E-K)、およびP1 v P2シートの最終アッセイ実行QCデータ(列J-L)を別々の全体コホートまたは実験データファイルに記録します。 テロメア研究ネットワーク(TRN)によって作成された 補足ファイル2 を使用して、プロジェクト20のICCを計算します。 最後に、TL研究間の比較可能性を向上させるために、コホート内のすべてのサンプルの平均T/S比を個々のサンプルのT/S比から差し引き、コホート内のすべてのサンプルのSDで除算する次の式を使用して、個別の全体コホートまたは実験データファイルの各サンプルの最終TLデータをZスコアに変換します。 図5:ソフトウェアベースのプレートセットアップ。 (A)手順1-6.2を完了した後のP6.4プレートのソフトウェアベースのプレートセットアップ。(B)手順2-6.2を完了した後のP6.4プレートのソフトウェアベースのプレートセットアップ。サンプルIDと標準IDは、ソフトウェアがウェル位置に基づいてサンプルIDを割り当てる方法(P1のCFXサンプル1がP2のCFXサンプル24である)のため、2つのCFXプレート間で整列されません。補足ファイル1で提供されているExcelテンプレートは、これを考慮しており、同じ生物学的サンプルに対して行われたプレート間測定が互いに適切に位置合わせされていることを確認しています。 図6:tエロメアアンプリコンとアルブミンアンプリコンの標準曲線。(A)この標準曲線は、代表結果データセットのP1テロメアアンプリコンからのものです。1つの標準は、QC基準を満たさなかったため、削除されました。(B)この標準曲線は、代表結果データセットのP2アルブミンアンプリコンからのものです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図7:テロメアおよびシングルコピー遺伝子アンプリコン (A)テロメア増幅および(B)ソフトウェアに表示される代表的な結果で報告されたサンプルのアルブミン遺伝子増幅。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 7. MMqPCRデータレポーティング MMqPCRから作成したTLデータを用いて研究結果を報告する場合は、TRN Minimum Reporting Guidelinesに記載されている項目の報告を確実に行ってください。これらのガイドラインはTRNのウェブサイト(https://trn.tulane.edu/resources/reporting-guidelines/)にあり、この情報を報告するためのテンプレートは補足ファイル3に記載されています。必要に応じて、このプロトコルとその他のTRNガイドラインとリソースを引用してください。