Medición de la longitud de los telómeros de PCR cuantitativa multiplex monocromática

Esta investigación se realizó de acuerdo con los lineamientos institucionales. Este protocolo describe el ensayo MMqPCR realizado a una profundidad de medición de triplicados duplicados, es decir, mediciones triplicadas de cada muestra repetidas a través de placas duplicadas, implementadas utilizando dos termocicladores simultáneamente para mejorar el rendimiento. El uso de placas duplicadas es una de las principales consideraciones que se tienen en cuenta en la implementación de este protocolo para lograr una alta reproducibilidad, como lo indican los altos ICC. A pesar de que es posible utilizar menos repeticiones, el impacto en el ICC y, posteriormente, en la potencia y el tamaño de muestra necesario, deben ser cuidadosamente considerados y medidos con cada cohorte por cada laboratorio20,21. Si solo hay un termociclador disponible, sugerimos mantener la profundidad de medición (es decir, duplicar triplicados) y hacer funcionar 2 placas secuencialmente. 1. Condiciones de preparación y almacenamiento de las existencias Para conocer todos los materiales y equipos utilizados para este protocolo, consulte la Tabla de materiales. Además, para conocer los reactivos y las cantidades específicos de la mezcla maestra utilizados para el ensayo MMqPCR, consulte la Tabla 1. Si se ejecutan dos placas secuencialmente, reduzca a la mitad el volumen de la mezcla maestra mientras se mantiene la concentración, lo que garantiza que se utilicen las mismas alícuotas de reactivo en las placas secuenciales del mismo ensayo.NOTA: Todos los reactivos madre deben prepararse con anticipación y los reactivos alícuotas deben descongelarse por completo antes de su uso. Alícuota y almacene 1x Tris-EDTA, pH 7,6 (TE) en tubos de 5 mL en volúmenes de 3 mL a temperatura ambiente durante un máximo de 2 años. Alicube y almacene betaína 5 M en tubos de 5 mL en volúmenes de 1.280 μL a -20 °C durante un máximo de 1 año. Alicuota y almacene SYBR Green en volúmenes de 3 μL en tubos individuales de tiras de PCR a -20 °C durante un máximo de 2 años, cubiertos con papel de aluminio y mínimamente expuestos a la luz. Almacene la ADN polimerasa en los tubos originales a -20 °C durante un máximo de 1 año. Alicuone y almacene tampón polimerasa 10x en tubos de 1,5 ml en volúmenes de 660 μl a -20 °C durante un máximo de 1 año.Para diluciones de tampón 1x de tampón polimerasa 10x, agregue 9,9 μL de tampón 10x a 89,1 μL de PCR grado H2O en tubos de 0,5 mL; almacenar a -20 °C hasta por 1 año. Alícuota y almacene 1 M de MgCl2 en tubos de 0,5 mL en volúmenes de 70 μL a 4 °C lejos de la luz durante un máximo de 1 año. Almacene los cebadores liofilizados con oligonucleótidos de genes de copia directa e inversa (T) y de un solo gen (S) a temperatura ambiente, lejos de la luz. Las cuatro secuencias específicas de cebadores de oligonucleótidos se presentan en la Tabla 2.NOTA: El gen de copia única en este protocolo es la albúmina; si se elige un gen de copia única diferente, es posible que sea necesario ajustar las concentraciones del cebador para garantizar una eficiencia de PCR aceptable.Reconstitución del cebador: Agite cada tubo de cebador liofilizado durante 10 s y luego coloque los tubos en una mini centrífuga durante 5 s para asegurarse de que el pellet liofilizado esté en el fondo del tubo antes de agregar 1x tampón TE. Verifique la concentración de nM en cada tubo de cebador individual ([nM]= alfa) y rehidrate cada tubo de cebador agregando 1x TE igual a 10x del valor alfa en μL (por ejemplo, si la concentración de nM en el tubo es de 24.6 nM, luego agregue 246 μL de 1x TE al tubo de cebador) para crear una solución de 100 μM de cada cebador. Cebadores de telómeros hacia adelante y hacia atrás alícuotas por separado en volúmenes de 16 μL y cebadores de albúmina hacia adelante e hacia atrás por separado en volúmenes de 11 μL. Almacene los cuatro tipos de alícuotas de imprimación a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Mezcla de dNTP: Vórtice de 4 a 8 tubos de cada uno de los cuatro tipos de dNTPS de soluciones madre de 25 mM (es decir, 16 a 32 tubos en total) durante 10 s seguido de un centrifugado rápido a temperatura ambiente utilizando una mini centrífuga. Coloque los tubos en una distribución uniforme en las posiciones de los tubos en la mini centrífuga y luego cierre la tapa para permitir que la máquina alcance la velocidad máxima, girando durante unos 5 s.En un tubo de 5 mL, agregue 200-250 μL de cada tubo, asegurándose de que se agreguen partes iguales de cada uno de los cuatro tipos de dNTP y agite la mezcla de dNTP. Alícuota 210 μL de mezcla en tubos de 0,5 mL y almacenar a -20 °C hasta por 1 año. Almacene el DTT a -20 °C y el acetato de sodio 3 M a temperatura ambiente.Solución DTT: Mida 0,1545 g de DTT en un bote de pesaje tarado en una báscula con una espátula de acero inoxidable.PRECAUCIÓN: El ditiotreitol (DTT) es un reactivo peligroso. La TDT es dañina si se ingiere, causa irritación de la piel y puede causar daños oculares graves. Las personas deben usar guantes protectores, protección para los ojos y protección facial cuando manipulen DTT. Además, las personas deben evitar respirar los vapores de DTT, trabajar en una campana de PCR cuando manipulen DTT y evitar la exposición prolongada o repetida. Prepare 10 mL de acetato de sodio 0.01 M agregando 33.33 μL de acetato de sodio 3 M y 9,967 μL de PCR grado H2O en un tubo de 15 mL y pocillo de vórtice. Añada el DTT medido en el tubo de 15 mL de acetato de sodio 0,01 M. Transfiera aproximadamente 100 μL de la solución de acetato de sodio 0,01 M al recipiente de pesaje para recoger el DTT residual. Pipetee los 100 μL de nuevo en el tubo de 15 mL. Una vez que todo el DTT esté en la solución, vórtice el tubo hasta que se disuelva por completo. Vierta el contenido del tubo de 15 mL en un canal de carga, aspire toda la solución en una jeringa de plástico de 10 mL desde un extremo del canal de carga. Coloque un filtro de jeringa estéril de acetato de celulosa de 0,2 μm de 25 mm en el extremo de la jeringa llena, deje que se sature completamente durante 1 minuto y gotee lentamente la solución en un nuevo tubo de 15 ml empujando ligeramente el émbolo de la jeringa hacia abajo, asegurándose de que toda la solución gotee a través del filtro hacia el nuevo tubo de 15 mL. Solución alícuota de TDT en volúmenes de 200 μL en tubos de 0,5 mL y almacenamiento a -20 °C durante un máximo de 6 semanas. Tabla 1: Volúmenes finales y concentraciones de reactivos. Volúmenes y concentraciones de reactivos en alícuotas individuales, mezcla maestra y en pocillos de PCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 2: Secuencias de telómeros y oligonucleótidos de genes de copia única. Lista de las secuencias de cebadores de genes de copia única de telómeros y albúmina utilizadas en la metodología. Haga clic aquí para descargar esta tabla. 2. Extracción de ADN genómico y preparación de muestras Extracción de muestras analíticas: Realice una extracción de ADN genómico para muestras de acuerdo con las pautas del fabricante utilizando kits o métodos establecidos dentro del laboratorio.Compruebe la calidad de la muestra de ADN con un espectrofotómetro y el ADN bicatenario (dsDNA) con un fluorómetro. Las muestras con proporciones medias inaceptables de 260/280 y 260/230 o una concentración de dsDNA por debajo de la detección (<0,20 ng/μL) no deben analizarse para TL 22,23. Además, si la concentración de dsDNA es demasiado alta para generar una lectura utilizando el fluorímetro (>1000 ng/μL), diluya la muestra y repita el ensayo.NOTA: Para los resultados presentados aquí, los valores aceptables para la pureza de los ácidos nucleicos fueron una relación de 260/280 entre 1,6 y 2,0 y una relación de 260/230 entre 2,0 y 2,2. Extracción de muestras de control: Realizar una extracción de ADN genómico en una muestra de control derivada del mismo material biológico que las muestras objeto de ensayo para un proyecto determinado. Asegúrese de extraer suficiente ADN de control para todas las placas que se espera que se ejecuten para toda la cohorte, de modo que se utilice un único estándar de ADN para todos los ensayos.Verifique la calidad de la muestra de ADN de control mediante espectrofotómetro y fluorómetro. La muestra de control debe tener proporciones medias aceptables de 260/280 y 260/230 y concentraciones detectables de dsDNA 22,23. ADN de control alícuota a una concentración de 2 ng/μL en cantidades de 150 μL en tubos de 0,5 mL marcados con el tipo de muestra y la fecha. Almacene las alícuotas de ADN de control a -20 °C durante un máximo de 5 años. Utilice una muestra de ADN de control para todas las placas de todas las muestras de la misma cohorte o proyecto de investigación. Prepare estas alícuotas de stock con anticipación. Preparación de muestras analíticas: Para muestras que tienen una concentración inicial de >5 ng/μL, cree alícuotas de dilución utilizando un factor de dilución de número entero, agregando la cantidad adecuada de muestra de ADN extraída (Archivo Suplementario 1 Hoja de Configuración de MMqPCR, Columna F) y grado de PCR H2O (Archivo Suplementario 1 Hoja de Configuración de MMqPCR, Columna G) para diluir la concentración entre 2,5 y 5,0 ng/μL (Archivo Suplementario 1 Hoja de configuración de MMqPCR, columna K). No diluya muestras con una concentración <5 ng/μL, sin embargo, alícuota un volumen suficiente para analizar la muestra 3 veces utilizando este protocolo.NOTA: Se deben realizar alícuotas de dilución durante la preparación de la muestra para que se puedan agregar 15 ng de ADN al tubo de tira de PCR correspondiente a cada muestra. Las alícuotas de la muestra permiten a los técnicos evitar que los ciclos innecesarios de congelación y descongelación afecten la integridad del ADN de la muestra en stock si la muestra no cumple con los criterios de calidad y debe repetirse. La plantilla de MMqPCR de muestra que se encuentra en el Archivo Complementario 1 puede ayudar a identificar el factor de dilución y los volúmenes correctos para preparar alícuotas de dilución (Archivo Suplementario 1, Hoja de configuración de MMqPCR, Columnas E-I).Llene las tiras de PCR con las muestras A1-8 en la tira de PCR A, las muestras B1-8 en la tira de PCR B y las muestras C1-8 en la tira C de PRC, como se detalla en la hoja de configuración de MMqPCR del archivo complementario 1 y se enumeran en la tabla 3 con cantidades de muestra adecuadamente diluidas (hoja de configuración del archivo complementario 1 MMqPCR, columna L) y cantidades de PCR de grado H2O (archivo complementario 1 Hoja de configuración de MMqPCR, columna M) para una cantidad total de 15 ng de ADN por tubo de PCR y un volumen total de 75 μL. Déjelo a un lado.NOTA: Las muestras en tiras de PCR se pueden almacenar durante la noche a 4 °C para ser sembradas al día siguiente. Preparación de la curva estándar: descongele una alícuota de ADN de control, un vórtice durante 30 s, una centrífuga durante 5 s y aspire el volumen completo (150 μL) en el primer tubo de la tira de tubo de PCR de curva estándar (SC).Pipetear 70 μL de PCR grado H2O en los tubos segundo a octavo de la tira de PCR SC. Vuelva a suspender completamente el ADN de control en el primer tubo antes de aspirar 70 μL y dispensarlo en el segundo tubo de PCR. Espere 30 s y, a continuación, vuelva a suspender completamente la solución en el segundo tubo de PCR antes de aspirar 70 μL y dispensarla en el tercer tubo de PCR. Repita esto para los tubos tres a siete para crear una dilución en serie de 2 veces de siete estándares. El tubo final solo debe contener PCR grado H2O para funcionar como un control sin plantilla (NTC). Deje la tira de PCR SC a un lado. Tabla 3: Organización de las muestras y patrón de control en placa. Ubicación de todas las muestras y patrones en una placa de PCR de 96 pocillos. Haga clic aquí para descargar esta tabla. 3. Preparación de la mezcla maestra MMqPCR Reúna las alícuotas de los reactivos de la mezcla maestra enumeradas en la Tabla 1, excepto la ADN polimerasa, y deje que alcancen la temperatura ambiente dentro de la campana de PCR. Añada 1 μL de la alícuota SYBR Green a la alícuota tampón 1x.NOTA: Esta cantidad exacta es necesaria para generar la concentración correcta de SYBR debido a las limitaciones de la precisión de la pipeta durante el ensayo, por lo que incluso si solo se ejecuta una placa a la vez, esta cantidad debe permanecer sin cambios. Agite todas las alícuotas durante 10 s, centrifugue durante 5 s, luego agregue las siguientes cantidades de reactivos al tubo de 5 mL que contiene la betaína 5 M (ahora el tubo de mezcla maestra): 1,235.2 μL de PCR grado H2O, 640 μL del tampón 10x, 204.8 μL de los dNTP, 192 μL de la TDT, 64 μL de MgCl2, 48 μL de SYBR Green / 1x tampón (del paso 3.1), 14,4 μL de ambos cebadores de telómeros y 9,6 μL de ambos cebadores de albúmina, como se indica en la Tabla 1. Saque la ADN polimerasa del almacenamiento a -20 °C, vórtice durante 10 s, centrifugue durante 5 s, luego agregue lentamente 128 μL a la mezcla maestra; mover inmediatamente la ADN polimerasa de vuelta al almacenamiento de -20 °C. Agite el tubo de mezcla maestra de 5 mL durante 30 s. 4. Preparación de la placa de 96 pocillos Coloque dos placas de 96 pocillos, un canal de carga y puntas de pipeta multicanal dentro de la cubierta de PCR. Etiquete cada plato con el número de placa (1 o 2). Gire la placa uno (la placa P1) 180° para que los números de las columnas queden al revés. Deje la placa dos (P2) mirando hacia el técnico. Vierta el contenido del tubo de mezcla maestra de 5 ml en el canal de carga. Utilice una punta de pipeta para recoger y dispensar cualquier solución que quede en el tubo. Cargue las puntas en la pipeta multicanal, empujando la base de cada punta de pipeta para garantizar un sellado hermético. Compruebe que las puntas no tengan ningún filtro dentro de la región de salida donde se aspirará la mezcla maestra; Si hay un trozo de filtro, reemplace la punta. Utilice el pipeteo inverso para llenar las placas con la mezcla maestra viscosa, gire el canal de carga y, a continuación, presione el émbolo de la pipeta más allá del primer tope, aspirando más de 15 μL en las puntas de la pipeta, asegurándose de que las puntas se llenen al mismo tiempo con el mismo volumen. Al expulsar la mezcla maestra en una columna, presione el émbolo hasta el primer tope, dejando la mezcla maestra adicional en las puntas de pipeta. Dejando el émbolo presionado, sumerja las puntas de nuevo en el canal de carga y suelte el émbolo para llenar las puntas con otros 15 μL. Utilice las mismas puntas para llenar ambas placas.Llene las placas expulsando primero la mezcla maestra en todas las columnas pares o en todas las impares, alternando entre placas (es decir, si el técnico elige comenzar con números de columna impares, la columna 1 en P2 se llenará primero, seguida de la columna 11 en P1, luego la columna 3 en P2, etc.). Después de que el técnico haya llenado todos los pozos de la serie (pares o impares) trabajando de izquierda a derecha, haga las otras series (pares o impares) de columnas de la misma manera. Consulte la Figura 2 para ver un gráfico de este proceso.NOTA: Esta forma de llenado de placas funciona para controlar los efectos de posición a través de las placas. Agite las cuatro tiras de PCR cerradas que contienen las muestras y la curva estándar y, a continuación, haga girar cada una en una mini centrífuga durante 5 s.Alinee las tiras de PCR en la gradilla de tubos de PCR en el orden en que se colocarán en la placa. Para P1, las primeras 3 columnas son muestras (tira de PCR A), las columnas 4-6 son el estándar (tira de PCR S), las columnas 7-9 son muestras (tira de PCR B) y las columnas 10-12 son muestras (tira de PCR C; ver Figura 3 y Tabla 3). Dado que P2 se llena mientras se gira 180° con respecto al técnico, las columnas serán lo contrario. Gire ambas placas 180° para que los números de las columnas se inviertan en relación con el técnico de cada placa (es decir, si el técnico miraba hacia la etiqueta para P2 anteriormente, ahora mirará hacia la etiqueta para P1 en el borde de la placa). Ajuste la pipeta multicanal a 10 μL y cargue las puntas de pipeta en la pipeta multicanal como se describe en el paso 4.3.Utilice la pipeta multicanal para resuspender las soluciones y, a continuación, realice el pipeteo inverso como se describe en el paso 4.4 para aspirar y dispensar 10 μL de las muestras y soluciones estándar, empezando por la tira de PCR A. Llene las primeras 3 columnas de cada placa con la tira de PCR A alternando las columnas de manera similar a como se colocó la mezcla maestra en la placa (es decir, par o impar). Rellene las tres columnas siguientes con la tira de PCR de curva estándar. Para esta tira, vuelva a suspender el7º tubo de dilución estándar (penúltimo), utilizando una pipeta de 200 μL ajustada a ~90 μL, a fondo antes de volver a suspender toda la tira con la pipeta multicanal.NOTA: El mayor volumen y la menor concentración de ADN en este tubo con frecuencia dan como resultado mediciones variadas en los pocillos de la placa de PCR debido a una mezcla deficiente. El uso de un volumen mayor para mezclar este tubo homogeneiza mejor la solución de ADN. Llene las tres columnas siguientes con la tira de PCR B y las tres últimas con la tira de PCR C. Reemplace las puntas de pipeta entre cada tira de PCR, llenando los 96 pocillos de ambas placas con las muestras correspondientes y el estándar de control como se describe en la Figura 3. Una vez que las placas estén llenas, golpee suavemente la placa en la parte superior de la mesa para asegurarse de que el líquido en los lados de los pocillos corra hasta el fondo y luego cubra la parte superior de las placas con películas de sellado. Use las yemas de los dedos para presionar todos los bordes de la película para asegurar un sellado hermético.Mezcle las placas girándolas en la parte superior de la campana durante 30 s, luego coloque las placas selladas en la rueda giratoria de placas durante 2 minutos con las aberturas del pozo hacia el centro. Coloque las placas en un termociclador, con los números de las columnas de las placas en orden legible. Use un pañuelo de papel limpio para limpiar la parte superior de cada placa antes de cerrar la tapa del termociclador. Figura 2: Proceso de llenado de placas. (A) Si elige llenar primero las columnas impares, este es el orden en que se llenan los pozos. (B) Si elige llenar primero las columnas pares, este es el orden en que se llenan los pozos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Disposición de las placas. La tira de PCR A, la tira B, la tira C y la tira de curva estándar (SC) deben usarse para llenar tres columnas en cada placa para producir triplicados duplicados de cada muestra y dilución estándar. Este diagrama muestra cuál de las columnas debe llenarse con cada tira. La placa dos se gira 180° (tenga en cuenta que los encabezados de columna y fila están al revés) antes de cargarla, pero la placa se llena de manera idéntica a la placa uno, lo que elimina posibles errores de pipeteo y al mismo tiempo controla los efectos de posición en las placas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 5. Termociclado MMqPCR Mientras las placas giran en el paso 4.8.1, encienda la computadora y los termociclistas. Abra el software del termociclador. Este protocolo describe el uso del software CFX Maestro. Cree el protocolo de termociclado TL de acuerdo con el protocolo de termociclado MMqPCR19 (Figura 4).Añadir un paso de incubación para activar la ADN polimerasa a 95 °C durante 15 min. Para evitar la unión del cebador y el dímero, ejecute dos ciclos de 94 °C durante 15 s, 49 °C durante 1 min, luego 3 ciclos de 94 °C durante 15 s, 59 °C durante 15 s. Para la amplificación de los telómeros, agregue 27 ciclos de 85 °C durante 15 s, 74 °C durante 30 s y luego la adquisición de la señal. Para la amplificación de la albúmina, agregue 31 ciclos de 94 °C durante 15 s, 84 °C durante 30 s y luego la adquisición de la señal. Incluya una curva de fusión de 59 °C a 95 °C a intervalos de 5 s por cada grado creciente en el protocolo de ciclo térmico. Haga clic en Iniciar ejecución para ambos termociclistas. Cuando se le solicite, proporcione un título para los archivos de análisis. Figura 4: Perfil de termociclado del ensayo MMqPCR. Protocolo MMqPCR creado en el software de acuerdo con el protocolo de termociclado original19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 6. Análisis de datos MMqPCR Una vez finalizado el termociclado, analice los datos de la siguiente manera para producir valores TL para las muestras que se han procesado. En el software, seleccione la función Configuración de placas . En el menú desplegable, haga clic en Ver/Editar placa.Resalte todos los pocillos y haga clic en Seleccionar fluoróforos, luego marque la casilla etiquetada SYBR y desmarque todas las demás casillas. Haga clic en Aceptar. Mientras todos los pozos siguen resaltados, junto a la palabra Cargar, marque la casilla junto a SYBR. Ahora todos los pozos deben tener SYBR escrito en ellos. A continuación, resalte los tres pocillos NTC en la parte superior o inferior de la dilución en serie de control estándar y seleccione NTC en el menú de tipo de muestra a la derecha. Los tres pozos ahora deberían ser amarillos y llamarse NTC. La Figura 5A muestra qué pozos deben seleccionarse para P1 y la Figura 5B muestra qué pozos deben seleccionarse para P2.NOTA: P2 se invertirá de P1, por lo que el NTC estará en la parte inferior de las columnas 4-6 para P1 y en la parte superior de las columnas 7-9 para P2. Resalte los 21 pocillos de la dilución en serie de control estándar y seleccione Estándar en el menú de tipo de muestra. Estos pozos deben ser verdes. Mientras estos pozos aún están resaltados, haga clic en Replicación técnica. Seleccione 3 en el menú Tamaño de réplica y, a continuación, seleccione Horizontal > Aplicar. Estos pozos deben estar etiquetados en grupos de tres desde Std-1 hasta Std-7. Mientras el estándar aún está resaltado, desplácese hacia abajo y seleccione Serie de dilución. En el campo Factor de dilución, introduzca 2 y, a continuación, escriba la concentración inicial de dilución y la direccionalidad según el número de placa, tal como se describe en los pasos siguientes. Para la placa P1, ingrese 2.00E-03 en el campo de concentración inicial y marque la casilla de Disminución y luego seleccione Aplicar. Los valores en los 21 pozos deben tener los valores de concentración escritos en cada pozo que van desde 2.00E-03 hasta 3.13E-05 de arriba a abajo. Para la placa P2, introduzca 3.13E-5 en el campo de concentración inicial y marque la casilla Creciente y, a continuación, seleccione Aplicar. Los valores en los 21 pozos deben tener los valores de concentración escritos en cada pozo que van desde 3.13E-05 a 2.00E-03 de arriba a abajo. Para las muestras, resalte las columnas de la tira de PCR A (1-3 para P1 y P2), seleccione Desconocido en el menú de tipo de muestra y, a continuación, seleccione Réplica técnica. Seleccione 3 en el menú Tamaño de réplica y, a continuación, seleccione Horizontal > Aplicar. Los pozos para estas columnas deben ser azules y etiquetados por fila en grupos de 3 desde Unk-1 hasta Unk-8.Repita el paso 6.3 para las columnas de la tira de PCR B (columnas 7-9 para P1 y 4-6 para P2). Deben estar etiquetados como Unk-9 a Unk-16. Repita el paso 6.3 para las columnas de la tira de PCR C (columnas 10-12 para P1 y P2). Deben estar etiquetados como Unk-17 a Unk-24. Cuando se completan los pasos 6.2-6.3.2, las ventanas de configuración de la placa deben parecerse a la Figura 5A,B. Seleccione Aceptar en la parte inferior derecha de la ventana del editor de placas. Haga clic en Sí para aplicar los cambios cuando se le solicite. Para el control de calidad a nivel de ensayo, asegúrese de que las curvas de la pestaña de cuantificación sean adecuadas (por ejemplo, sin curvas de amplificación invertidas) para el paso 9 y el paso 12 del perfil de termociclado, que corresponden a los amplicones de telómero y albúmina respectivamente. Se accede a las curvas mediante el menú desplegable en el lado central derecho de la ventana del software. La figura 6A,B muestra las curvas apropiadas.Asegúrese de que las eficiencias de PCR informadas tanto en el Paso 9 como en el Paso 12 estén entre el 90 % y el 110 % y que estas dos eficiencias no difieran entre sí más del 10 % (es decir, 92,4 % para el Paso 9 y 98 % para el Paso 12 es apropiado, pero 92,4 % para el Paso 9 y 108 % para el Paso 12 no es apropiado). Además, asegúrese de que la curva R2 estándar sea de >0,995. En caso de que P1 o P2 no cumplan con estos criterios, es necesario volver a ejecutar las placas. Para P1, seleccione el Paso 9 y resalte los 21 pozos correspondientes a la curva estándar como se ve en la Figura 6A,B. Copie los valores de Cq en la esquina inferior derecha de la ventana del software. Abra la plantilla de hoja de datos de telómeros disponible como Archivo complementario 1 y pegue estos valores en la hoja estándar 1, columna B. Seleccione el paso 12 y, a continuación, copie estos valores Cq. Pegue estos valores en la hoja estándar 1, columna I.Identifique el valor de la pendiente en el paso 9 y escríbalo en la celda C4 de la hoja estándar 1. Identifique el valor de la pendiente en el paso 12 y escríbalo en la celda J4 de la hoja estándar 1.NOTA: El sistema calcula el porcentaje de eficiencia de los cebadores utilizando las pendientes de la curva estándar identificada en el paso 6.6.1. El porcentaje de eficiencia se puede calcular manualmente utilizando la siguiente fórmula: Asegúrese de que el coeficiente de variación (CV) para cada triplicado de dilución estándar sea inferior a 0,1. Si es mayor o igual a 0.1, excluya hasta tres pozos individuales en total de todas las concentraciones de muestras de control incluidas en la curva de dilución serial estándar de 7 puntos en la placa. Solo se debe excluir un pocillo de cualquier conjunto por triplicado.NOTA: La exclusión de puntos estándar del análisis en el software cambiará la pendiente informada, R, la intersección con el eje y y la eficiencia de ambos cebadores. Por lo tanto, después de que cualquier pozo estándar se elimina del análisis, se deben repetir los pasos 6.5.1-6.6.1. Repita los pasos 6.6.1 – 6.6.2 para el archivo de análisis P2 y la hoja estándar 2 correspondiente. Solo cuando las hojas estándar 1 y estándar 2 se completen con CV aceptables, recoja datos de muestra individuales de los archivos de análisis. Asegúrese de que los ajustes de control de calidad se informen en la columna L de la hoja P1 v P2, por ejemplo, cuántos pozos se excluyeron en el archivo de análisis P1. Asegúrese de que solo los 72 pozos de muestra en el archivo de análisis P1 estén resaltados en azul en la pestaña Cuantificación, como se ve en Figura 7A,B. Escoger Paso 9. Copie los valores Cq y SQ en la esquina inferior derecha de la ventana del software. Pegue estos valores en la hoja P1 de muestras, comenzando en la celda D3. Escoger Paso 12 a continuación, copie estos valores Cq y SQ, y péguelos en la hoja P1 de muestras, empezando por la celda F3.Repita este paso para las muestras del archivo de análisis P2 y la hoja de muestras P2 correspondiente. Las proporciones de telómeros a copia única (T/S) (columna H) se calculan automáticamente, pero se pueden calcular manualmente utilizando la siguiente fórmula:Donde ET/S es la eficiencia de la amplificación exponencial para reacciones dirigidas al telómero o al gen de copia única, respectivamente, y CqT/S es el ciclo en el que un contenido telomérico dirigido a una réplica dada o al gen de copia única alcanza el umbral crítico de cuantificación de fluorescencia. Las relaciones T/S promedio (Columna I) se calculan a través de seis mediciones por muestra.NOTA: Los números de identificación de la muestra en CFX no corresponden a la misma muestra biológica en las dos placas. La plantilla de la hoja de datos de los telómeros tiene en cuenta esta diferencia y alineará los triplicados duplicados adecuados. En CFX Maestro, verifique que los valores de Cq para todas las muestras analíticas se encuentren entre el valor de Cq más bajo y el más alto de la curva estándar, como se ve en la Figura 7B. Si una muestra está fuera del rango como se ve en la Figura 7A, será necesario volver a ejecutarla después del ajuste de concentración. Una muestra con un valor de Cq inferior al estándar de concentración más alto debe diluirse por un factor aproximado al número de ciclos de amplificación que está fuera del rango, y una muestra con un valor de Cq superior al estándar de concentración más bajo tendría que concentrarse por un factor aproximado al número de ciclos de amplificación más allá del umbral.NOTA: La amplia variación en la concentración de las muestras analíticas introduce un nivel potencial adicional de variación y debe hacerse con precaución. Asegúrese de que la concentración inicial en el NTC sea inferior al 5% de la cantidad promedio de ADN presente en los pocillos de muestra. Esto se puede comprobar visualizando el % de contaminación del agua en las hojas de las muestras P1 y P2 de la MMqPCR. Si el NTC indica contaminación, vuelva a encender las placas.NOTA: Debido a la sensibilidad del ensayo MMqPCR, una contaminación incontrolable menor puede ocasionalmente hacer que los pocillos de NTC se amplifiquen. Sin embargo, esta amplificación debe ser menor y ocurrir varios ciclos después de la amplificación del gen de copia única en el Paso 12 del protocolo de termociclado. Para el control de calidad a nivel de muestra, revise las desviaciones estándar (DE) (columna J) y las CV (columna K) en las muestras P1 y las hojas de muestras P2. Asegúrese de que los CV intraplaca a través de las relaciones T/S triplicadas de la muestra sean inferiores a 0,10 (10%). Para corregir cualquier CV intraplaca superior a 0,1, se puede excluir una relación T/S de un conjunto de triplicados.NOTA: Solo se puede excluir una réplica total en las seis mediciones por muestra, es decir, no se puede excluir una réplica para la misma muestra tanto en P1 como en P2. Compruebe que las CV de la placa interplaca de muestra individual en la hoja P1 v P2, columna G, sean inferiores a 0,05 (5%). Para corregir cualquier CV mayor que 0,05, realice la exclusión de una relación T/S de las seis mediciones por muestra en ambas placas. Excluya las muestras después de la inspección visual a través de los triplicados intraplaca y las seis mediciones según sea necesario.NOTA: Solo las muestras que superen estos criterios de control de calidad, CV intraplaca < 10% y CV entre placas < 5%, pueden incluirse en los resultados finales de TL. De lo contrario, la muestra debe excluirse de las hojas de datos P1 v P2 e ICC para esta ejecución, y la muestra debe volver a evaluarse en un segundo ensayo MMqPCR. Para el control de calidad a nivel de placa, compruebe que la variación media dentro de la placa en todas las muestras de cada placa, situada en la parte inferior de las muestras P1 y las hojas de las muestras P2, sea inferior a 0,05 (5%). Para el control de calidad adicional a nivel de placa, compruebe que la variación general entre placas en la hoja P1 v P2, celda G29, sea inferior a 0,06 (6%). Asegúrese de que las muestras que no pasaron el control de calidad se eliminen del cálculo de CV entre placas en la celda G30.NOTA: Cuando se trabaja con grupos de muestras relacionados (por ejemplo, miembros de la familia, diferentes puntos de tiempo, etc.), todas las muestras de un grupo deben ejecutarse en la misma placa. Por lo tanto, si una muestra del grupo no supera los criterios de control de calidad, se deben volver a ejecutar todas las muestras del grupo. En un archivo de datos de cohorte o experimento general separado, registre los datos finales de TL para cada muestra que pasó el control de calidad (hoja P1 v P2, columna I), los cálculos de ICC para cada muestra que pasó el control de calidad (hoja de datos ICC, columnas E-K) y los datos de control de calidad de la ejecución del ensayo final de la hoja P1 v P2 (columnas J-L) Utilice el Archivo Suplementario 2 creado por la Red de Investigación de Telómeros (TRN) para calcular el ICC para el proyecto20. Por último, para mejorar la comparabilidad entre los estudios de TL, transforme los datos finales de TL para cada muestra en el archivo de datos de la cohorte general o del experimento por separado en puntuaciones Z utilizando la siguiente ecuación en la que la relación T/S media de todas las muestras de la cohorte se resta de la relación T/S de la muestra individual y luego se divide por la DE en todas las muestras de la cohorte. Figura 5: Configuración de placas basada en software. (A) Configuración de placa basada en software para una placa P1 después de completar los pasos 6.2-6.4. (B) Configuración de placa basada en software para una placa P2 después de completar los pasos 6.2-6.4. Los ID de muestra y estándar no están alineados entre las dos placas CFX debido a la forma en que el software asigna los ID de muestra en función de la posición del pozo (es decir, la muestra CFX 1 en P1 es la muestra CFX 24 en P2). La plantilla de Excel proporcionada en el Archivo Suplementario 1 da cuenta de esto, asegurando que las mediciones entre placas realizadas en la misma muestra biológica estén correctamente alineadas entre sí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Curvas estándar paraamplicones de telómero y albúmina. (A) Esta curva estándar proviene del amplicón de telómeros P1 del conjunto de datos de resultados representativos. Se eliminó una norma porque no cumplía con los criterios de control de calidad. (B) Esta curva estándar proviene del amplicón de albúmina P2 del conjunto de datos de resultados representativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Telómeros y amplicones de genes de copia única. (A) Amplificación de telómeros y (B) amplificación del gen de la albúmina de muestras reportadas en resultados representativos mostrados en el software. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 7. Informes de datos MMqPCR Al informar los resultados de la investigación utilizando los datos de TL creados a partir de la MMqPCR, asegúrese de informar los elementos descritos en las Pautas mínimas de informes de TRN. Estas directrices se pueden encontrar en el sitio web de TRN (https://trn.tulane.edu/resources/reporting-guidelines/) y en el Archivo Complementario 3 se proporciona una plantilla para presentar esta información. Cite este protocolo y otras directrices y recursos de TRN cuando corresponda.