JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Monokrom Multipleks Kantitatif PCR Telomer Uzunluğu Ölçümü

Published: March 22, 2024
doi:
10.3791/66545
, , , , ,
1School of Medicine,Tulane University, 2Native American Center for Health Professions,University of Wisconsin-Madison, 3Department of Medicine,University of Wisconsin-Madison, 4Department of Biochemistry,University of Wisconsin-Madison, 5School of Science and Engineering,Tulane University, 6Department of Psychiatry and Behavioral Sciences,Boston Children’s Hospital

Summary

Burada, monokrom multipleks kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (MMqPCR) testi kullanılarak bağıl telomer uzunluğunun (TL) ölçümü için bir protokol sunuyoruz. MMqPCR testi, popülasyon temelli çalışmalarda insan DNA’sından TL ölçümü için tekrarlanabilir, verimli ve uygun maliyetli bir yöntemdir.

Abstract

Telomerler, DNA’yı hasardan koruyan ve kromozom stabilitesini koruyan tüm ökaryotik kromozomların sonunda bulunan ribonükleoprotein yapılarıdır. Telomer uzunluğu (TL) çeşitli maruziyetler, biyolojik süreçler ve sağlık sonuçları ile ilişkilendirilmiştir. Bu makale, insan DNA’sından bağıl ortalama TL ölçümü için laboratuvarımızda rutin olarak yürütülen monokrom multipleks kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (MMqPCR) test protokolünü açıklamaktadır. Birkaç farklı PCR tabanlı TL ölçüm yöntemi vardır, ancak bu yayında sunulan MMqPCR yöntemi için spesifik protokol tekrarlanabilir, verimli, uygun maliyetlidir ve popülasyon temelli çalışmalar için uygundur. Bu ayrıntılı protokol, araştırmacıların laboratuvarlarında bu testi oluşturmaları için gerekli tüm bilgileri özetlemektedir. Ek olarak, bu protokol, aynı numunenin tekrarlanan ölçümleri boyunca sınıf içi korelasyon katsayısı (ICC) ile tanımlanan bu tahlil ile TL ölçümünün tekrarlanabilirliğini artırmak için özel adımlar sağlar. ICC, belirli bir çalışma popülasyonu için beklenen gücün değerlendirilmesinde kritik bir faktördür; bu nedenle, herhangi bir TL tahlili için kohorta özgü ICC’lerin raporlanması, TL’nin popülasyona dayalı çalışmalarının genel titizliğini artırmak için gerekli bir adımdır. Periferik kan mononükleer hücrelerinden ekstrakte edilen DNA örneklerini kullanan örnek sonuçlar, bu MMqPCR protokolünü kullanarak yüksek oranda tekrarlanabilir TL verileri üretmenin fizibilitesini göstermektedir.

Introduction

Telomerler, tüm ökaryotik kromozomların sonunda bulunan, yüksek oranda korunmuş, tekrarlayan DNA dizileri ve ilişkili proteinlerden oluşan koruyucu komplekslerdir. Telomer, kromozom stabilitesini koruyarak DNA’nın bütünlüğünü korur. Telomerlerin ilerleyici kısalması, eksik gecikmeli iplikçik DNA sentezi, DNA hasarı ve diğer faktörlerin bir sonucu olarak bölünen hücrelerde meydana gelir 1,2. Telomer uzunluğunun (TL) insan ömrü boyunca yaşlanma ve yaşa bağlı hastalıkların bir biyobelirteç olduğunu destekleyen artan kanıtlara, insan maruziyeti, hastalık ve sağlık çalışmalarında TL’nin rolünü değerlendirmek için kullanılan TL ölçüm testlerinin türlerinde bir artış eşlik etmiştir 3,4,5. Meta-analizler, TL’nin genel mortalite, çevresel maruziyetler ve kanser, kardiyovasküler hastalık ve diyabet dahil olmak üzere sağlık sonuçları ile ilişkilerini bildirmiştir 6,7,8,9,10,11,12,13 . Bu meta-ilişkilendirmeler, ilişkilendirmelerin güçlü yönlerinin farklı metodolojiler arasında farklılık gösterme eğiliminde olduğu iki düzineden fazla farklı TL ölçüm metodolojisinden birini kullanan çalışmalardan kaynaklanmaktadır 14,15,16. Bir araştırma çalışması için en uygun TL ölçüm yönteminin seçilmesi, her yöntemin kendine özgü avantajları ve dezavantajları olduğundan, doğru sonuçlar elde etmek için çok önemli bir adımdır 5,17.

Reaktiflerin nispeten düşük maliyeti, hızlı tahlil geri dönüşü, ölçeklenebilirlik ve daha düşük başlangıç DNA gereksinimi nedeniyle, PCR tabanlı TL ölçüm teknikleri, büyük örneklem popülasyonlarıyla yapılan çalışmalar, yüksek DNA konsantrasyonlarına sahip örneklere sınırlı erişimi olan çalışmalar veya yüksek verime öncelik veren çalışmalar yürütülürken genellikle tercihen kullanılır. Orijinal olarak Richard Cawthon tarafından geliştirilen tek katlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) olan ilk PCR tabanlı TL ölçüm yöntemi, ayrı PCR plakaları18 üzerinde çalıştırılan telomer (T) ve tek kopya gen (S) amplifikasyonunun floresan sinyallerinin oranını kullanır. Bu yaklaşımda, numunedeki toplam telomer DNA içeriğini amplifiye etmek için tekrarlanan telomer DNA dizilerini (T) tamamlayan primerler kullanılır ve floresan raportör SYBR green’in tespiti ile nicelik belirlenir. Benzer şekilde, korunmuş tek kopya (S) geninin intergenik bir bölgesini tamamlayan primerler, genom kopya sayısını ölçmek için kullanılır. Bu iki tahmin, plakadan plakaya varyasyonu kontrol etmek için bir projedeki tüm tahlillerde kullanılan bir genomik DNA standart eğrisine göre ölçülür. Toplam telomerik DNA’nın (T) tek genom kopya sayısına (S) bölünmesi, tek bir DNA örneği18,19 için hücre başına ortalama telomerik içeriği temsil eden birimsiz, göreceli bir ölçüm olan T/S oranını üretir. Bu nedenle, T/S oranı, fonksiyonel uzunluğun belirli bir ölçüsü değildir; ancak literatür normlarına uygun olarak bu protokol boyunca örneklem başına ortalama TL terimini kullanmaktayız.

Bu yöntem, 2009 yılında Richard Cawthon’un monokrom multipleks qPCR (MMqPCR) testini, orijinal singleplex qPCR yöntemine göre T/S oranındaki değişkenliği potansiyel olarak azaltmak için bir yaklaşım olarak tanımladığı19 zaman geliştirilmiştir. MMqPCR testi, qPCR testinin faydalarına sahiptir ve aynı reaksiyon kuyusu içinde T ve S sinyallerini tek bir raporlama floroforu kullanarak ölçme avantajına sahiptir, böylece singleplex qPCR’ye göre hatayı azaltır ve daha yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik ile sonuçlanır19. Ayrıca, bu multipleks yöntemi potansiyel olarak maliyetleri düşürür ve singleplex testine kıyasla yarısı kadar reaksiyon gerektiğindenverimi artırır 19.

MMqPCR TL ölçümünün avantajları göz önüne alındığında, bu yöntem, maruziyetler, sağlık sonuçları ve biyolojik süreçlerle TL ilişkilerinin popülasyon temelli çalışmaları için çok uygundur. Ancak, yöntemi başlatmak zor olabilir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, laboratuvarımızda kullanılan MMqPCR TL ölçüm protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyor ve test hassasiyetini artırmak, kontaminasyon riskini azaltmak ve tekrarlanabilirliği geliştirmek için uygulanan temel adımları vurguluyoruz.

Ayrıca, bu protokol, verilerin temizlenmesi ve TL ölçümlerinin tekrarlanabilirliğinin önemli bir istatistiksel ölçüsü olan sınıf içi korelasyon katsayısının (ICC) hesaplanması için adımları ana hatlarıyla belirtir2. Temsili sonuçlarımızla, bu protokolü kullanarak yüksek ICC’ler üretme kabiliyetini gösteriyoruz. Ek olarak, TL ölçümlerindeki değişimi azaltması ve ortaya çıkan ICC’yi artırması beklenen kalite kontrol (QC) ve sorun giderme adımlarını belirliyoruz. Bu yöntemin yüksek tekrarlanabilirliği, verimliliği ve maliyet etkinliği nedeniyle, MMqPCR TL ölçümü epidemiyolojik TL araştırmaları için idealdir. Şekil 1, bu protokolde açıklandığı gibi MMqPCR yöntemine görsel bir genel bakış sağlar.

Figure 1
Şekil 1: Yönteme genel bakış. Telomer uzunluğunu ölçmek için monokrom multipleks kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu yöntemine geniş bir genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

Bu araştırma kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokol, çift üçlülerden oluşan bir ölçüm derinliğinde gerçekleştirilen MMqPCR testini, yani verimi artırmak için aynı anda iki termosikler kullanılarak uygulanan, çift plakalar boyunca tekrarlanan her bir numunenin üçlü ölçümlerini açıklar. Çift plakaların kullanılması, yüksek ICC’ler tarafından belirtildiği gibi yüksek tekrarlanabilirlik elde etmek için bu protokolün uygulanmasında en önemli husustur. Daha az kopya kullanmak mümkün olsa da, ICC üzerindeki etkinin ve ardından güç ve ihtiyaç duyulan numune boyutunun her laboratuvar tarafından her bir kohortta dikkatlice düşünülmesi ve ölçülmesi gerekir20,21. Yalnızca bir termodöngüleyici mevcutsa, ölçüm derinliğini korumanızı (yani yinelenen üçlüler) ve 2 plakayı sırayla çalıştırmanızı öneririz. 1. Stok hazırlama ve saklama koşulları Bu protokol için kullanılan tüm malzeme ve ekipmanlar için Malzeme Tablosuna bakınız. Ek olarak, MMqPCR testi için kullanılan spesifik ana karışım reaktifleri ve miktarları için Tablo 1’e bakınız. İki plakayı sırayla çalıştırıyorsanız, konsantrasyonu korurken ana karışım hacminin yarısı kadar, aynı tahlilin sıralı plakaları boyunca aynı reaktif alikotlarının kullanılmasını sağlayın.NOT: Tüm stok reaktifleri önceden hazırlanmalı ve alıntılanan reaktifler kullanımdan önce tamamen çözülmelidir. 1x Tris-EDTA, pH 7.6 (TE) 5 mL’lik tüplerde 3 mL’lik hacimlerde oda sıcaklığında 2 yıla kadar alikotlayın ve saklayın. 5 M Betain’i 5 mL’lik tüplerde 1.280 μL’lik hacimlerde -20 °C’de 1 yıla kadar ayırın ve saklayın. SYBR Green’i 3 μL’lik hacimlerde, -20 °C’de 2 yıla kadar, folyo ile kaplanmış ve minimum düzeyde ışığa maruz kalmış olarak saklayın ve saklayın. DNA polimerazı orijinal tüplerde -20 °C’de 1 yıla kadar saklayın. 10x polimeraz tamponunu 1.5 mL’lik tüplerde 660 μL’lik hacimlerde -20 °C’de 1 yıla kadar alikotlayın ve saklayın.10x polimeraz tamponunun 1x tampon dilüsyonları için, 0.5 mL tüplerde 89.1 μL PCR derecesi H2O’ya 9.9 μL 10x tampon ekleyin; -20 °C’de 1 yıla kadar saklayın. 1 M MgCl2’yi 0,5 mL’lik tüplerde 70 μL’lik hacimlerde 4 °C’de ışıktan 1 yıla kadar uzakta saklayın ve saklayın. İleri ve geri telomer (T) ve tek (S) kopya gen oligonükleotid liyofilize primerleri oda sıcaklığında ışıktan uzakta saklayın. Dört spesifik oligonükleotid primer dizisi Tablo 2’de sunulmuştur.NOT: Bu protokoldeki tek kopya gen albümindir; farklı bir tek kopya gen seçiliyorsa, kabul edilebilir PCR verimliliğini sağlamak için primer konsantrasyonlarının ayarlanması gerekebilir.Astar sulandırma: Her liyofilize primer tüpünü 10 saniye boyunca vorteksleyin ve ardından 1x TE tamponu eklemeden önce liyofilize peletin tüpün dibinde olduğundan emin olmak için tüpleri 5 saniye boyunca bir mini santrifüje yerleştirin. Her bir primer tüpünü nM konsantrasyonu ([nM] = alfa) açısından kontrol edin ve μL cinsinden alfa değerinin 10x’ine eşit 1x TE ekleyerek her bir primer tüpünü rehidre edin (örneğin, tüp üzerindeki nM konsantrasyonu 24.6 nM ise, daha sonra primer tüpüne 246 μL 1x TE ekleyin) her bir astarın 100 μM’lik bir çözeltisini oluşturmak için. Aliquot ileri ve geri telomer primerleri 16 μL hacimlerde ayrı ayrı ve ileri ve geri albümin primerlerini 11 μL hacimlerde ayrı ayrı. Dört tip astar alikotunu da -20 °C’de 6 aya kadar saklayın. dNTP karışımı: Dört dNTPS tipi 25 mM stok çözeltisinin her birinden (yani toplam 16-32 tüp) 4-8 tüpü 10 saniye boyunca vorteksleyin ve ardından bir mini santrifüj kullanarak oda sıcaklığında hızlı bir şekilde döndürün. Tüpleri mini santrifüjdeki tüp konumlarına eşit bir dağılım gösterecek şekilde yerleştirin ve ardından makinenin yaklaşık 5 saniye dönerek tam hıza ulaşmasını sağlamak için kapağı kapatın.5 mL’lik bir tüpte, her tüpten 200-250 μL ekleyin, dört dNTP tipinin her birinin eşit parçalarının eklendiğinden emin olun ve dNTP karışımını girdaplayın. 210 μL karışımı 0,5 mL’lik tüplerde toplayın ve -20 °C’de 1 yıla kadar saklayın. Stok DTT’yi -20 °C’de saklayın ve oda sıcaklığında 3 M sodyum asetat stoklayın.DTT çözümü: Paslanmaz çelik bir spatula kullanarak darası alınmış bir tartı teknesinde 0.1545 g DTT’yi ölçün.DİKKAT: Ditiyotreitol (DTT) tehlikeli bir reaktiftir. DTT yutulduğunda zararlıdır, cilt tahrişine neden olur ve ciddi göz hasarına neden olabilir. Bireyler DTT’yi kullanırken koruyucu eldiven, göz koruması ve yüz koruması giymelidir. Ek olarak, bireyler DTT buharlarını solumaktan kaçınmalı, DTT ile çalışırken PCR başlığında çalışmalı ve uzun süreli veya tekrarlanan maruziyetten kaçınmalıdır. 15 mL’lik bir tüpe 33.33 μL sodyum asetat ve 9.967 μL PCR derece H2O ekleyerek 10 mL 0.01 M sodyum asetat yapın ve iyice girdap yapın. Ölçülen DTT’yi 15 mL’lik 0.01 M sodyum asetat tüpüne ekleyin. Kalan DTT’yi toplamak için yaklaşık 100 μL 0.01 M sodyum asetat çözeltisini tartım teknesine aktarın. 100 μL’yi tekrar 15 mL’lik tüpe pipetleyin. Tüm DTT çözeltiye girdikten sonra, tüpü tamamen eriyene kadar girdaplayın. 15 mL’lik tüpün içeriğini bir yükleme oluğuna dökün, tüm çözeltiyi yükleme oluğunun bir ucundan 10 mL’lik plastik bir şırıngaya aspire edin. Doldurulmuş şırınganın ucuna 25 mm steril bir 0,2 μm selüloz asetat şırınga filtresi takın, 1 dakika boyunca tamamen doymasına izin verin ve şırınga pistonunu hafifçe aşağı iterek çözeltiyi yeni bir 15 mL’lik tüpe yavaşça damlatın, tüm çözeltinin filtreden yeni 15 mL’lik tüpe damlamasını sağlayın. Aliquot DTT çözeltisini 200 μL’lik hacimlerde 0,5 mL’lik tüplere indirin ve -20 ° C’de 6 haftaya kadar saklayın. Tablo 1: Reaktiflerin nihai hacimleri ve konsantrasyonları. Bireysel alikotlarda, ana karışımda ve PCR kuyularında reaktiflerin hacimleri ve konsantrasyonları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 2: Telomer ve tek kopya gen oligonükleotid primer dizileri. Metodolojide kullanılan telomer ve albümin tek kopya gen primer dizilerinin listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. 2. Genomik DNA ekstraksiyonu ve numune hazırlama Analitik numunelerin ekstraksiyonu: Laboratuvarda kitleri veya yerleşik yöntemleri kullanarak üreticinin yönergelerine uygun olarak numuneler için bir genomik DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.DNA numunesinin kalitesini bir spektrofotometre ve bir florometre kullanarak çift sarmallı DNA (dsDNA) ile kontrol edin. Kabul edilemez ortalama 260/280 ve 260/230 oranlarına veya tespitin altında dsDNA konsantrasyonuna (<0.20 ng/μL) sahip numuneler22,23 TL için analiz edilmemelidir. Ek olarak, dsDNA konsantrasyonu florometre (>1000 ng/μL) kullanılarak bir okuma oluşturmak için çok yüksekse, numuneyi seyreltin ve testi tekrarlayın.NOT: Burada sunulan sonuçlar için, nükleik asitlerin saflığı için kabul edilebilir değerler, 1.6 ila 2.0 arasında 260/280 oranı ve 2.0 ile 2.2 arasında 260/230 oranıydı. Kontrol numunelerinin ekstraksiyonu: Belirli bir proje için test edilen denek numuneleri ile aynı biyolojik materyalden türetilen bir kontrol numunesi üzerinde bir genomik DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin. Tüm kohort için çalıştırılması beklenen tüm plakalar için yeterli kontrol DNA’sının çıkarıldığından emin olun, böylece tüm tahliller için tek bir DNA standardı kullanılır.Kontrol DNA numune kalitesini spektrofotometre ve florometre ile kontrol edin. Kontrol numunesi, kabul edilebilir ortalama 260/280 ve 260/230 oranlarına ve saptanabilir dsDNA22,23 konsantrasyonlarına sahip olmalıdır. Aliquot, numune tipi ve tarihi ile etiketlenmiş 0.5 mL’lik tüplerde 150 μL miktarlarında 2 ng/μL konsantrasyonda DNA’yı kontrol eder. Kontrol DNA alikotlarını -20 °C’de 5 yıla kadar saklayın. Aynı kohort veya araştırma projesinden alınan tüm örneklerin tüm plakaları için bir kontrol DNA örneği kullanın. Bu stok alikotlarını önceden hazırlayın. Analitik numunelerin hazırlanması: Başlangıç konsantrasyonu >5 ng/μL olan numuneler için, konsantrasyonu 2,5 – 5,0 ng/μL arasında olacak şekilde seyreltmek için uygun miktarda ekstrakte edilmiş DNA numunesi (Ek Dosya 1 MMqPCR Kurulum Sayfası, Sütun F) ve PCR derecesi H2O (Ek Dosya 1 MMqPCR Kurulum Sayfası, Sütun G) ekleyerek bir tam sayı seyreltme faktörü kullanarak seyreltme alikotları oluşturun MMqPCR Kurulum Sayfası, Sütun K). Numuneleri <5 ng/μL konsantrasyonla seyreltmeyin, ancak bu protokolü kullanarak numuneyi 3x test etmek için yeterli hacmi elde edin.NOT: Her numunenin karşılık gelen PCR şerit tüpüne 15 ng DNA eklenebilmesi için numune hazırlama sırasında seyreltme alikotları yapılmalıdır. Numune alikotları, numunenin kalite kriterlerini geçememesi ve yeniden çalıştırılması gerekmesi durumunda, teknisyenlerin gereksiz donma-çözülme döngülerinin stok numune DNA bütünlüğünü etkilemesini önlemesine olanak tanır. Ek Dosya 1’de bulunan örnek MMqPCR Şablonu, seyreltme alikotlarını hazırlamak için doğru seyreltme faktörünün ve hacimlerinin belirlenmesine yardımcı olabilir (Ek Dosya 1, MMqPCR Kurulum Sayfası, Sütun E-I).PCR şeritlerini, Ek Dosya 1 MMqPCR Kurulum Sayfasında ayrıntılı olarak açıklandığı ve Tablo 3’te listelendiği gibi, PCR şeridi A’daki A1-8 numuneleri, PCR şeridi B’deki numuneler ve PRC şeridi C’deki C1-8 numuneleri ile doldurun ve uygun şekilde seyreltilmiş numune miktarları (Ek Dosya 1 MMqPCR Kurulum Sayfası, Sütun L) ve PCR derecesi H2O miktarları (Ek Dosya 1 MMqPCR Kurulum Sayfası, Sütun M) PCR tüpü başına toplam 15 ng DNA miktarı ve toplam 75 μL hacim için. Bir kenara koyun.NOT: PCR şeritlerindeki numuneler, ertesi gün kaplanmak üzere gece boyunca 4 °C’de saklanabilir. Standart eğrinin hazırlanması: Bir kontrol DNA alikotunu çözün, 30 saniye girdap, 5 saniye santrifüjleyin ve tam hacmi (150 μL) standart eğri (SC) PCR tüp şeridindeki ilk tüpe aspire edin.SC PCR şeridinin ikinci ila sekizinci tüplerine 70 μL PCR sınıfı H2O pipetleyin. 70 μL’yi aspire etmeden ve ikinci PCR tüpüne dağıtmadan önce birinci tüpte kontrol DNA’sını iyice yeniden süspanse edin. 30 saniye bekleyin, ardından 70 μL’yi aspire etmeden ve üçüncü PCR tüpüne dağıtmadan önce ikinci PCR tüpündeki çözeltiyi iyice yeniden süspanse edin. Yedi standartta 2 kat seri seyreltme oluşturmak için bunu üç ila yedi arasındaki tüpler için tekrarlayın. Son tüp, şablon olmayan bir kontrol (NTC) olarak işlev görmesi için yalnızca PCR sınıfı H2O içermelidir. SC PCR şeridini bir kenara koyun. Tablo 3: Numunelerin organizasyonu ve plakadaki kontrol standardı. Tüm numunelerin ve standartların 96 oyuklu bir PCR plakası üzerindeki yeri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. 3. MMqPCR ana karışım hazırlama DNA polimeraz hariç Tablo 1’de listelenen ana karışım reaktif alikotlarını toplayın ve PCR başlığının içinde oda sıcaklığına gelmelerine izin verin. 1x tampon alikotuna 1 μL SYBR Green alikot ekleyin.NOT: Bu kesin miktar, tahlil sırasında pipet doğruluğunun sınırlamaları nedeniyle doğru SYBR konsantrasyonunu oluşturmak için gereklidir, bu nedenle bir seferde yalnızca bir plaka çalıştırılsa bile bu miktar değişmeden kalmalıdır. Tüm alikotları 10 saniye vorteksleyin, 5 saniye santrifüjleyin, ardından 5 M betaini (şimdi ana karışım tüpü) tutan 5 mL’lik tüpe aşağıdaki miktarlarda reaktif ekleyin: 1.235.2 μL PCR derecesi H2O, 640 μL 10x tampon, 204.8 μL dNTP, 192 μL DTT, 64 μL MgCl2, 48 μL SYBR Green / 1x tampon (adım 3.1’den itibaren), her iki telomer primerinin 14.4 μL’si ve her iki albümin primerinin 9.6 μL’si Tablo 1’de listelenmiştir. DNA polimerazı -20 °C depodan çıkarın, 10 saniye girdap, 5 saniye santrifüjleyin, ardından ana karışıma yavaşça 128 μL ekleyin; DNA polimerazı hemen -20 °C depolamaya geri taşıyın. 5 mL’lik ana karışım tüpünü 30 saniye boyunca vorteksleyin. 4. 96 oyuklu plakanın hazırlanması PCR başlığının içine iki adet 96 oyuklu plaka, yükleme teknesi ve çok kanallı pipet ucu yerleştirin. Her plakayı plaka numarası (1 veya 2) ile etiketleyin. Birinci plakayı (P1 plakası) sütunların numaraları ters olacak şekilde 180° çevirin. İkinci plakayı (P2) teknisyene bakacak şekilde bırakın. 5 mL’lik ana karışım tüpünün içeriğini yükleme oluğuna dökün. Tüpte kalan çözeltiyi toplamak ve dağıtmak için bir pipet ucu kullanın. Sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için uçları çok kanallı pipetin üzerine yükleyin ve her pipet ucunun tabanını itin. Uçların, ana karışımın aspire edileceği çıkış bölgesinde herhangi bir filtreye sahip olmadığını kontrol edin; Bir filtre parçası varsa, ucu değiştirin. Plakaları viskoz ana karışımla doldurmak için ters pipetleme kullanın, yükleme teknesini döndürün ve ardından pipet uçlarına 15 μL’den daha fazla aspire ederek ilk duraktan sonra pipet pistonuna bastırın ve uçların aynı anda aynı hacimle dolduğundan emin olun. Ana karışımı bir sütuna boşaltırken, pistonu ilk sonuna kadar bastırın ve ekstra ana karışımı pipet uçlarında bırakın. Pistonu basılı bırakarak, uçları tekrar yükleme oluğuna daldırın ve uçları 15 μL daha doldurmak için pistonu serbest bırakın. Her iki plakayı da doldurmak için aynı uçları kullanın.Ana karışımı, plakalar arasında geçiş yaparak önce tüm çift veya tüm tek sütunlara atarak plakaları doldurun (yani, teknisyen tek sütun numaralarıyla başlamayı seçerse, önce P2’deki sütun 1, ardından P1’deki sütun 1, ardından P1’deki sütun 1, ardından P3’deki sütun 2, vb.). Teknisyen soldan sağa çalışarak serinin tüm kuyularını (tek veya çift) doldurduktan sonra, diğer sütun serilerini (çift veya tek) aynı şekilde yapın. Bu işlemin bir tablosu için Şekil 2’ye bakın.NOT: Bu şekilde plaka doldurma, plakalar boyunca konum etkilerini kontrol etme işlevi görür. Numuneleri ve standart eğriyi içeren dört kapalı PCR şeridini girdaplayın, ardından her birini 5 saniye boyunca bir mini santrifüjde döndürün.PCR tüp rafındaki PCR şeritlerini, plakaya nasıl yerleştirileceklerine göre sıralayın. P1 için ilk 3 sütun numunelerdir (PCR şeridi A), sütun 4-6 standarttır (PCR şeridi S), sütun 7-9 numunelerdir (PCR şeridi B) ve sütun 10-12 numunelerdir (PCR şeridi C; bkz. Şekil 3 ve Tablo 3). Teknisyene göre 180° döndürüldüğünde P2 doldurulduğundan, sütunlar tam tersi olacaktır. Her iki plakayı da 180° çevirin, böylece sütunların numaraları her plaka için teknisyene göre ters çevrilir (yani, teknisyen daha önce P2 etiketine baktıysa, şimdi plaka kenarındaki P1 etiketine bakacaktır). Çok kanallı pipeti 10 μL’ye ayarlayın ve pipet uçlarını adım 4.3’te açıklandığı gibi çok kanallı pipete yükleyin.Solüsyonları yeniden süspanse etmek için çok kanallı pipeti kullanın, ardından PCR şeridi A’dan başlayarak 10 μL numuneleri ve standart solüsyonları aspire etmek ve dağıtmak için adım 4.4’te açıklandığı gibi ters pipetleme gerçekleştirin. Her bir plakanın ilk 3 sütununu, ana karışımın plakaya yerleştirildiği gibi (yani çift veya tek) sütunları değiştirerek PCR şeridi A’yı kullanarak doldurun. Standart eğri PCR şeridini kullanarak sonraki üç sütunu doldurun. Bu şerit için, çok kanallı pipeti kullanarak tüm şeridi yeniden askıya almadan önce, ~ 90 μL’ye ayarlanmış 200 μL’lik bir pipet kullanarak 7. standart seyreltme tüpünü (sondan ikinci) yeniden süspanse edin.NOT: Bu tüpteki daha büyük hacim ve daha küçük DNA konsantrasyonu, zayıf karıştırma nedeniyle sıklıkla PCR plaka kuyuları boyunca çeşitli ölçümlere neden olur. Bu tüpü karıştırmak için daha büyük bir hacim kullanmak, DNA çözeltisini daha iyi homojenize eder. Sonraki üç sütunu PCR şeridi B ile ve son üçünü PCR şeridi C ile doldurun. Her bir PCR şeridi arasındaki pipet uçlarını değiştirin, her iki plakadaki 96 oyuğun tamamını Şekil 3’te belirtildiği gibi karşılık gelen numuneler ve kontrol standardı ile doldurun. Plakalar doldurulduktan sonra, kuyucukların kenarlarındaki sıvının dibe akmasını sağlamak için plakayı tezgah üstüne hafifçe vurun ve ardından plaka üstlerini sızdırmazlık filmleri kullanarak kapatın. Sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için filmin tüm kenarlarına bastırmak için parmak uçlarınızı kullanın.Plakaları, davlumbazın üst kısmında 30 saniye döndürerek karıştırın, ardından sızdırmaz plakaları, kuyu açıklıkları merkeze bakacak şekilde 2 dakika boyunca plaka döndürücüye yerleştirin. Plakaları, plakaların sütunlarının numaraları okunaklı bir sırayla olacak şekilde bir termocycler’a yerleştirin. Termocycler üstünü kapatmadan önce her plakanın üstünü temizlemek için temiz bir mendil kullanın. Şekil 2: Plakaları doldurma işlemi. (A) Önce tek sütunları doldurmayı seçerseniz, bu, kuyuların doldurulma sırasıdır. (B) Önce çift sütunları doldurmayı seçerseniz, bu, kuyuların doldurulma sırasıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Plaka düzeni. PCR şeridi A, şerit B, şerit C ve standart eğri (SC) şeridinin tümü, her numunenin ve standart seyreltmenin çift üçlüsünü üretmek için her plakadaki üç sütunu doldurmak için kullanılmalıdır. Bu diyagram, her şeritle hangi sütunların doldurulması gerektiğini gösterir. İkinci plaka yüklemeden önce 180° döndürülür (sütun ve satır başlıklarının baş aşağı olduğuna dikkat edin), ancak plaka birinci plaka ile aynı şekilde doldurulur, bu da olası pipetleme hatalarını ortadan kaldırırken plakalar arasındaki konum etkilerini kontrol etmeye devam eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 5. MMqPCR termosilleme Adım 4.8.1’de plakalar dönerken, bilgisayarı ve termodöngüleyicileri AÇIN. Thermocycler yazılımını açın. Bu protokol, CFX Maestro yazılımının kullanımını açıklar. MMqPCR termosikling protokolü19’a uygun olarak TL termosikling protokolünü oluşturun (Şekil 4).DNA polimerazı 95 °C’de 15 dakika aktive etmek için bir inkübasyon adımı ekleyin. Astar-dimer bağlanmasını önlemek için, 15 saniye boyunca 94 °C’de, 1 dakika boyunca 49 °C’de iki döngü, ardından 15 saniye boyunca 94 °C’de 3 döngü, 15 saniye boyunca 59 °C’de 3 döngü çalıştırın. Telomer amplifikasyonu için, 15 sn boyunca 85 °C’lik 27 döngü, 30 sn için 74 °C, ardından sinyal alımı ekleyin. Albümin amplifikasyonu için, 15 saniye boyunca 94 °C’lik 31 döngü, 30 saniye boyunca 84 °C, ardından sinyal alımı ekleyin. Termal döngü protokolünde her artan derece için 5 sn aralıklarla 59 °C ila 95 °C arasında bir erime eğrisi ekleyin. Her iki termodöngüleyici için Çalıştırmayı Başlat’a tıklayın. İstendiğinde, analiz dosyaları için bir başlık sağlayın. Şekil 4: MMqPCR testinin termosiklasyon profili. Yazılımda orijinal termosikling protokolüne uygun olarak oluşturulan MMqPCR protokolü19. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 6. MMqPCR veri analizi Isıl döngü tamamlandığında, işlenmiş numuneler için TL değerleri üretmek için verileri aşağıdaki şekilde analiz edin. Yazılımda, Plaka Kurulumu özelliğini seçin. Açılır menüde, Plakayı Görüntüle/Düzenle’ye tıklayın.Tüm kuyucukları vurgulayın ve Florofor Seç’e tıklayın, ardından SYBR etiketli kutuyu işaretleyin ve diğer tüm kutuların işaretini kaldırın. Tamam’a tıklayın. Tüm kuyular hala vurgulanmış durumdayken, Yük kelimesinin yanında, SYBR’nin yanındaki kutuyu işaretleyin. Şimdi tüm kuyuların üzerinde SYBR yazılı olmalıdır. Ardından, standart kontrol seri seyreltmesinin üstündeki veya altındaki üç NTC kuyusunu vurgulayın ve sağdaki numune türü menüsünden NTC’yi seçin. Üç kuyu şimdi sarı olmalı ve NTC olarak adlandırılmalıdır. Şekil 5A , P1 için hangi kuyuların seçilmesi gerektiğini ve Şekil 5B , P2 için hangi kuyuların seçilmesi gerektiğini göstermektedir.NOT: P2, P1’den ters çevrilecektir, bu nedenle NTC, P1 için 4-6 sütunlarının altında ve P2 için 7-9 sütunlarının üstünde olacaktır. Standart kontrol seri seyreltmesinin 21 kuyusunu vurgulayın ve numune tipi menüsünden Standart’ı seçin. Bu kuyular yeşil olmalıdır. Bu kuyular hala vurgulanırken, Teknik Çoğalt’ı tıklayın. Çoğaltma Boyutu menüsünden 3’ü seçin, ardından Yatay > Uygula’yı seçin. Bu kuyucuklar, Std-1’den Std-7’ye kadar üçlü setler halinde etiketlenmelidir. Standart hala vurgulanmış durumdayken aşağı kaydırın ve Seyreltme Serisi’ni seçin. Seyreltme Faktörü alanına 2 girin ve ardından aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi plaka numarasına göre seyreltme başlangıç konsantrasyonunu ve yönünü yazın. P1 plakası için, başlangıç konsantrasyonu alanına 2.00E-03 girin ve Azaltma kutusunu işaretleyin ve ardından Uygula’yı seçin. 21 kuyucuğundaki değerler, yukarıdan aşağıya 2.00E-03 ile 3.13E-05 arasında değişen her bir kuyuda yazılı konsantrasyon değerlerine sahip olmalıdır. P2 plakası için, başlangıç konsantrasyonu alanına 3.13E-5 girin ve Artırma kutusunu işaretleyin ve ardından Uygula’yı seçin. 21 kuyudaki değerler, yukarıdan aşağıya 3.13E-05 ile 2.00E-03 arasında değişen her bir kuyuda yazılı konsantrasyon değerlerine sahip olmalıdır. Örnekler için PCR şeridi A sütunlarını vurgulayın (P1 ve P2 için 1-3), örnek türü menüsünden Bilinmiyor’u seçin ve ardından Teknik Çoğaltma’yı seçin. Çoğaltma Boyutu menüsünden 3’ü seçin, ardından Yatay > Uygula’yı seçin. Bu sütunlar için kuyucuklar mavi olmalı ve Unk-1’den Unk-8’e kadar 3’lü setler halinde sıra sıra etiketlenmelidir.PCR şeridi B için sütunlar için adım 6.3’ü tekrarlayın (P1 için sütun 7-9 ve P2 için 4-6 sütunları). Unk-9 ile Unk-16 arasında etiketlenmelidirler. PCR şeridi C için sütunlar için adım 6.3’ü tekrarlayın (P1 ve P2 için sütun 10-12). Unk-17 ile Unk-24 arasında etiketlenmelidirler. 6.2-6.3.2 adımları tamamlandığında, plaka kurulum pencereleri Şekil 5A,B’ye benzemelidir. Plaka düzenleyici penceresinin sağ alt kısmındaki Tamam’ı seçin. İstendiğinde değişiklikleri uygulamak için Evet’i tıklatın. Test düzeyinde kalite kontrol için, sırasıyla telomer ve albümin amplikonlarına karşılık gelen termosiklasyon profilinin hem Adım 9 hem de Adım 12 için nicelik belirleme sekmesindeki eğrilerin uygun olduğundan emin olun (örneğin, ters amplifikasyon eğrileri yok). Eğrilere, yazılım penceresinin sağ orta tarafındaki açılır menüden erişilir. Şekil 6A,B uygun eğrileri gösterir.Hem Adım 9’da hem de Adım 12’de rapor edilen PCR verimliliklerinin ile 0 arasında olduğundan ve bu iki verimliliğin birbirinden ‘dan fazla farklılık göstermediğinden emin olun (yani, Adım 9 için ,4 ve Adım 12 için uygundur, ancak Adım 9 için ,4 ve Adım 12 için 8 uygun değildir). Ek olarak, standart R2 eğrisinin >0.995 olduğundan emin olun. P1 veya P2’den biri bu kriterleri karşılayamazsa, plakaların yeniden çalıştırılması gerekir. P1 için, Adım 9’u seçin ve Şekil 21A,B’de görüldüğü gibi standart eğriye karşılık gelen 6 kuyuyu vurgulayın. Yazılım penceresinin sağ alt köşesindeki Cq değerlerini kopyalayın. Ek Dosya 1 olarak bulunan telomer veri sayfası şablonunu açın ve bu değerleri standart 1 sayfasına, B sütununa yapıştırın. Adım 12’yi seçin ve ardından bu Cq değerlerini kopyalayın. Bu değerleri standart 1 sayfa, sütun I’e yapıştırın.Adım 9’daki eğim değerini belirleyin ve bunu standart 1 sayfasındaki C4 hücresine yazın. Adım 12’deki eğim değerini belirleyin ve bunu standart 1 sayfasındaki J4 hücresine yazın.NOT: Sistem, adım 6.6.1’de tanımlanan standart eğrinin eğimlerini kullanarak astarların verimlilik yüzdesini hesaplar. Verimlilik yüzdesi, aşağıdaki formül kullanılarak manuel olarak hesaplanabilir: Her standart seyreltme üçlüsü için varyasyon katsayısının (CV) 0,1’den küçük olduğundan emin olun. 0.1’e eşit veya daha büyükse, plaka üzerindeki 7 noktalı standart seri seyreltme eğrisine dahil edilen kontrol numunelerinin tüm konsantrasyonlarından toplam üç ayrı kuyucuğu hariç tutun. Herhangi bir üçlü setten yalnızca bir kuyucuk çıkarılmalıdır.NOT: Yazılım üzerindeki analizden standart noktaların hariç tutulması, her iki astar için rapor edilen eğimi, R, y-kesişimini ve verimliliği değiştirecektir. Bu nedenle, herhangi bir standart kuyu analizden çıkarıldıktan sonra, 6.5.1-6.6.1 adımları tekrarlanmalıdır. P2 analiz dosyası ve ilgili standart 2 sayfası için 6.6.1 – 6.6.2 adımlarını tekrarlayın. Yalnızca hem standart 1 hem de standart 2 sayfaları kabul edilebilir CV’lerle tamamlandığında, analiz dosyalarından bireysel örnek verileri toplayın. Kalite kontrol ayarlamalarının P1 v P2 sayfa sütunu L’de rapor edildiğinden emin olun, örneğin P1 analiz dosyasında kaç kuyu hariç tutulduğu. P72 analiz dosyasındaki yalnızca 1 numune kuyucuğunun, şurada görüldüğü gibi Miktar Belirleme sekmesinde mavi renkle vurgulandığından emin olun. Şekil 7A,B. Seçmek 9. Adım. Yazılım penceresinin sağ alt köşesindeki Cq ve SQ değerlerini kopyalayın. Bu değerleri, D3 hücresinden başlayarak örneklerin P1 sayfasına yapıştırın. Seçmek 12. adım daha sonra bu Cq ve SQ değerlerini kopyalayın ve F3 hücresinden başlayarak örneklerin P1 sayfasına yapıştırın.P2 analiz dosyasındaki numuneler ve ilgili numuneler P2 sayfası için bu adımı tekrarlayın. Telomer – tek kopya (T/S) oranları (Sütun H) otomatik olarak hesaplanır, ancak aşağıdaki formül kullanılarak manuel olarak hesaplanabilir:Burada ET/S , sırasıyla telomer veya tek kopya geni hedef alan reaksiyonlar için üstel amplifikasyonun verimliliğidir ve CqT/S , telomerik içeriği veya tek kopya geni hedefleyen belirli bir replikasyonun floresan nicelemesinin kritik eşiğine ulaştığı döngüdür. Ortalama T/S oranları (Sütun I), numune başına altı ölçümde hesaplanır.NOT: CFX’teki numune kimlik numaraları, iki plaka boyunca aynı biyolojik numuneye karşılık gelmez. Telomer veri sayfası şablonu bu farkı hesaba katar ve uygun yinelenen üçlüleri hizalar. CFX Maestro’da, tüm analitik numuneler için Cq değerlerinin, Şekil 7B’de görüldüğü gibi standart eğrinin en düşük ve en yüksek Cq değeri arasında olduğunu kontrol edin. Bir numune, Şekil 7A’da görüldüğü gibi aralığın dışındaysa, konsantrasyon ayarlamasından sonra yeniden çalıştırılması gerekecektir. En yüksek konsantrasyon standardından daha düşük bir Cq değerine sahip bir numunenin, aralık dışında olduğu amplifikasyon döngülerinin sayısına yaklaşık bir faktörle seyreltilmesi gerekir ve en düşük konsantrasyon standardından daha yüksek bir Cq değerine sahip bir numunenin, eşiğin ötesindeki amplifikasyon döngülerinin sayısına yaklaşık bir faktörle konsantre edilmesi gerekir.NOT: Analitik numunelerin konsantrasyonundaki geniş çeşitlilik, ek bir potansiyel varyasyon seviyesi ortaya çıkarır ve dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. NTC’deki başlangıç konsantrasyonunun, numune kuyucuklarında bulunan ortalama DNA miktarının %5’inden az olduğundan emin olun. Bu, MMqPCR’nin P1 numuneleri ve P2 numuneleri üzerindeki su kirliliği yüzdesi görüntülenerek kontrol edilebilir. NTC kontaminasyon gösteriyorsa, plakaları yeniden çalıştırın.NOT: MMqPCR testinin hassasiyeti nedeniyle, kontrol edilemeyen küçük kontaminasyon bazen NTC kuyularının yükselmesine neden olabilir. Bununla birlikte, bu amplifikasyon küçük olmalı ve termosiklasyon protokolünün Adım 12’sinde tek kopya gen amplifikasyonundan birkaç döngü sonra meydana gelmelidir. Numune düzeyinde kalite kontrol için, numuneler P1 ve numuneler P2 Sayfalarındaki standart sapmaları (SD) (Sütun J) ve CV’leri (Sütun K) gözden geçirin. Numune üçlü T/S oranlarındaki plaka içi CV’lerin 0,10’dan () az olduğundan emin olun. 0.1’den büyük herhangi bir intraplate CV’yi düzeltmek için, bir dizi üçlü kopyadan bir T / S oranı hariç tutulabilir.NOT: Numune başına altı ölçümde yalnızca bir toplam replikasyon hariç tutulabilir, yani aynı numune için bir replikasyon hem P1 hem de P2’de hariç tutulamaz. P1 v P2 sayfası, G sütunundaki her bir numune ara plakası CV’lerinin 0,05’ten (%5) küçük olduğunu kontrol edin. 0.05’ten büyük herhangi bir CV’yi düzeltmek için, her iki plakada numune başına altı ölçümden bir T/S oranının hariç tutulmasını gerçekleştirin. Plaka içi üçlülerde ve gerektiğinde altı ölçümün tümünde görsel incelemeden sonra numuneleri hariç tutun.NOT: Yalnızca bu QC kriterlerini geçen numuneler, ‘luk intraplate CV < ve %5'lik interplate CV < nihai TL sonuçlarına dahil edilebilir. Aksi takdirde, numune bu çalışma için P1 v P2 ve ICC veri sayfalarından çıkarılmalı ve numune ikinci bir MMqPCR testinde yeniden değerlendirilmelidir. Plaka düzeyinde kalite kontrol için, P1 numunelerinin ve P2 numunelerinin alt kısmında bulunan her bir plakadaki tüm numunelerdeki ortalama plaka içi varyasyonun 0,05’ten (%5) az olduğunu kontrol edin. Ek plaka düzeyinde kalite kontrol için, P1 v P2 levhası, G29 hücresindeki genel plakalar arası varyasyonun 0,06’dan (%6) küçük olduğunu kontrol edin. QC’yi geçemeyen örneklerin G30 hücresindeki plakalar arası CV hesaplamasından çıkarıldığından emin olun.NOT: İlgili numune gruplarıyla (örn. aile üyeleri, farklı zaman noktaları vb.) çalışırken, bir gruptaki tüm numunelerin aynı plaka üzerinde çalıştırılması gerekir. Bu nedenle, grubun bir numunesi kalite kontrol kriterlerini geçemezse, gruptaki tüm numuneler yeniden çalıştırılmalıdır. Ayrı bir genel kohort veya deney veri dosyasında, KK’yi geçen her numune için nihai TL verilerini (P1 v P2 Sayfası, Sütun I), KK’yi geçen her numune için ICC hesaplamalarını (ICC Veri Sayfası, Sütun E-K) ve P1 v P2 Sayfasından (Sütun JL) son tahlil çalıştırması KK verilerini kaydedin Proje 20 için ICC’yi hesaplamak için Telomer Araştırma Ağı (TRN) tarafından oluşturulan Ek Dosya2’yi kullanın. Son olarak, TL çalışmaları arasındaki karşılaştırılabilirliği artırmak için, ayrı genel kohort veya deney veri dosyasındaki her bir örnek için nihai TL verilerini, kohorttaki tüm örnekler için ortalama T/S oranının bireysel örnek T/S oranından çıkarıldığı ve ardından kohorttaki tüm örneklerde SD’ye bölündüğü aşağıdaki denklemi kullanarak Z-puanlarına dönüştürün. Şekil 5: Yazılım tabanlı plaka kurulumu. (A) 6.2-6.4 adımları tamamlandıktan sonra bir P1 plakası için yazılım tabanlı plaka kurulumu. (B) 6.2-6.4 adımlarını tamamladıktan sonra bir P2 plakası için yazılım tabanlı plaka kurulumu. Numune ve standart ID’ler, yazılımın kuyu konumuna göre numune ID’leri atama şekli nedeniyle iki CFX plakası arasında hizalanmamıştır (yani, P1’deki CFX numune 1, P2’deki CFX numune 24’tür). Ek Dosya 1’de sağlanan excel şablonu bunu hesaba katarak, aynı biyolojik numune üzerinde yapılan plakalar arası ölçümlerin birbirine uygun şekilde hizalanmasını sağlar Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: T elomere ve albümin amplikonları için standart eğriler. (A) Bu standart eğri, temsili sonuç veri setinin P1 telomer ampliconundan alınmıştır. Bir standart, kalite kontrol kriterlerini karşılamadığı için kaldırıldı. (B) Bu standart eğri, temsili sonuç veri setinin P2 albümin amplizonundan alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: Telomer ve tek kopya gen amplikonları. (A) Telomer amplifikasyonu ve (B) yazılımda görüntülenen temsili sonuçlarda rapor edilen örneklerin gen amplifikasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 7. MMqPCR veri raporlaması MMqPCR’den oluşturulan TL verilerini kullanarak araştırma sonuçlarını raporlarken, TRN Minimum Raporlama Kılavuzu’nda açıklanan maddelerin raporlanmasını sağlayın. Bu yönergeler TRN web sitesinde (https://trn.tulane.edu/resources/reporting-guidelines/) bulunabilir ve bu bilgilerin bildirilmesi için bir şablon Ek Dosya 3’te verilmiştir. Uygun olduğunda bu protokolden ve diğer TRN yönergelerinden ve kaynaklarından alıntı yapın.

Representative Results

Tablo 4 ve Tablo 5’te sunulan sonuçlar, protokol izlenerek elde edilen yüksek oranda tekrarlanabilir TL ölçümlerine bir örnek sunmaktadır. Bu sonuçlar için, üreticilerin yönergelerine göre ticari bir kit kullanılarak 24 periferik kan mononükleer hücre (PBMC) örneğinden DNA ekstrakte edildi. Bu 24 numune, iki adet 96 oyuklu plaka boyunca çalıştırıldı. Tüm DNA örnekleri, tahlil uygunluğunu ve numune seyreltme faktörünü belirlemek için ortalama 260/280 oranı, ortalama 260/230 oranı ve dsDNA konsantrasyonu kullanılarak spektrofotometre ve florometre ile kalite açısından kontrol edildi (Tablo 6). Tablo 6 ayrıca, bir spektrofotometre kullanılarak ölçülen DNA konsantrasyonundan farklı olabilen dsDNA konsantrasyonunun ölçülmesinin önemini vurgulamaktadır. Bu değişkenlik, nicelemeye yönelik farklı yaklaşımların bir sonucudur. Spesifik olarak, spektrofotometre, 280 nm’de absorpsiyona dayalı olarak DNA konsantrasyonunu türetir ve absorbans okumalarını etkileyen kirleticilerden (örn. protein, tuz vb.) kaynaklanan dalgalanmalara karşı hassastır. Buna karşılık, bir florometre kullanılarak ölçülen dsDNA konsantrasyonları, dsDNA’ya spesifik olarak bağlanan bir boyanın floresansı ile belirlenir ve bu nedenle, DNA içeriğinin daha doğru bir yansıması olduğu varsayılır. DNA örnekleri, MMqPCR TL analizinden önce üç adede kadar donma-çözülme döngüsüne maruz kaldı. Kontrol DNA’sı, 2 ng/μL’den 0.0313 ng/μL DNA’ya yedi noktalı bir seri seyreltme oluşturmak için kullanılan bir bireyden PBMC’lerin havuzlanmış DNA ekstraksiyonlarından oluşturuldu. PCR Step 9 (telomer amplicon) ve Step 12 (bu protokolde tek kopya gen amplicon, albumin) için oluşturulan bağımsız standart eğriler Şekil 6A,B’de sunulmuştur. Tahliller, Şekil 8’de görüldüğü gibi, bireysel amplikon ürünlerinin farklı sıcaklıklarda üretildiğini gösteren bir eriyik eğrisi oluşturan ticari bir Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sistemi üzerinde çalıştırıldı. Tablo 4: Optimum temsili sonuçlar için MMqPCR ölçümünden elde edilen çıktı verileri. 24 örnek için ortalama T/S oranları, SD’ler, CV’ler ve Z-skorlu TL. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 5: Telomer uzunluğu veri çıkışı. MMqPCR testinden elde edilen ham veriler yazılımda analiz edilir, ardından daha fazla analiz ve kalite kontrol için Ek Dosya 1 olarak eklenen elektronik tablo şablonuna eklenir. Bu TL şablonu çıktı sayfası, her iki plakadaki her numune için numune kimliklerini, ortalama TL’leri, SD’leri ve CV’leri görüntüleyen verilerin bir özetini sunar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 6: Numune sonuçları için Spektrofotometre ve Florometre DNA kalite ölçümleri. Numune başına dsDNA ve herhangi bir kontamine için çift spektrofotometre analizinden ve tekil florometre ölçümünden elde edilen kalite kontrol verileri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 8: Örnek erime eğrisi. Yazılımda oluşturulan örnek veriler için erime eğrisi. Önceki tepe ~ 80 ° C, telomer amplikonunu temsil eder ve ~ 89 ° C’deki ikincil tepe albümin amplikonunu temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Bu proje için, tüm çalışmalarda ortalama telomer verimliliği 90.7 ila 102.1 aralığında .6 ve ortalama albümin verimliliği 2.3 ve 93.6 ila 108.2 aralığında idi. Bu protokolün QC kriterlerini karşılayan standart eğrilerden kaldırılan ortalama 0,97 kopya vardı. SD ile ortalama plaka içi CV %1.83 ve SD 0.00658 ile ortalama intraplate CV %3.78 idi. Bu temsili örnekler için ortalama TL’ler Tablo 4 ve Tablo 5’te sunulmaktadır. Ortalama TL 1.37, SD 0.24 ve 0.84 ile 2.32 arasında bir aralık idi. Örneklem başına T/S oranı, SD, CV ve Z-skorlu TL Tablo 4’te listelenmiştir. MMqPCR testinin T/S oranı çıktısı TL’nin göreceli bir ölçümü olduğundan, çapraz çalışma karşılaştırmasına izin vermek için oranlar bu Z-skoruna dönüştürüldü. Bu proje için ICC, Ek Dosya 2’de bulunan TRN yönergelerinde açıklandığı gibi, toplu ve çalıştırma efektleri20’yi hesaba katan R betiği kullanılarak hesaplanmıştır. Proje içi ICC’yi hesaplamak için, geçen örneklerin ‘unu yeniden çalıştırdık ve ICC plakalarını kohortun her plakasından en az bir örnekle doldurduğumuzdan emin olduk. 0.801 [CI: 0.703, 0.86] olan genel proje ICC’si, TL sonuçlarının yüksek tekrarlanabilirliğini göstermektedir. Tüm sonuçlar optimal olmayacaktır. Şekil 9 ve Tablo 7’deki sonuçlar, MMqPCR testinden elde edilen optimal olmayan sonuçları göstermektedir. Şekil 9, telomer verimliliği ‘ın altında, QC standartlarının altında olan ve tüm plakanın tekrarlanmasını gerektiren standart bir eğriyi göstermektedir. Astar verimlilikleriyle ilgili sorunlar genellikle reaktiflerle ilgili bir sorundan kaynaklanır, bu nedenle düşük verimlilikten hangi reaktifin sorumlu olduğunu belirlemede ilk adım olarak reaktiflerin alikote edildiği tarihleri ve son kullanma tarihlerini izlemek önemlidir. Süresi dolmuş reaktifler, plaka tekrar çalıştırılmadan önce değiştirilmelidir. Tablo 7, ilk numune düzeyinde kalite kontrol kriterlerini geçen ancak plakalar arasında yüksek düzeyde değişkenliğe sahip olan ve plaka düzeyinde kalite kontrol arızasına yol açan bir plakayı göstermektedir. Plakalar arasındaki farklılıklar genellikle pipetleme ve plaka doldurma tekniklerindeki hatalardan kaynaklanır. Bu durumda, teknisyen plaka kurulumu sırasında meydana gelen sorunları değerlendirmeli ve pipetlerin kalibre edildiğinden emin olmalıdır. Şekil 9: Optimal olmayan sonuçlar. Yazılımda görüntülenen bu standart eğri, telomer primeri için amplifikasyon verimliliği ‘dan az olduğu için QC’yi geçemedi. Görüntü P1’den alınmıştır, ancak P2 de benzer şekilde düşük verimliliğe sahipti. Bu çalıştırmadan elde edilen veriler kullanılamadı ve süresi dolan nedensel reaktif değiştirildikten sonra tüm örneklerin yeniden çalıştırılması gerekiyordu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 7: Optimal Olmayan Sonuçlar. Tablo, örneklerin çoğunun QC standartlarını karşılayamadığı bir çalıştırma için telomer veri şablonunu görüntüler. Yeniden çalıştırılması gereken örnekler CV değerlerine göre belirlendi ve daha sonra kolay tanımlama için örnek adı kırmızı bir yazı tipiyle değiştirildi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 1: Telomer veri elektronik tablosu şablonu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 2: ICC hesaplaması. Bu protokol Telomer Araştırma Ağı (TRN) tarafından oluşturulmuştur. Bu dosya20 tarafından değiştirildi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 3: TRN raporlama yönergeleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

2002’den önce daha büyük popülasyon temelli çalışmalarda en yaygın olarak kullanılan TL ölçümü yöntemi, terminal kısıtlama fragmanı uzunluklarının (TRF) Southern blot analiziydi24,25. TRF, özel laboratuvarlarda mükemmel hassasiyet ve tekrarlanabilirlik sağlamasına rağmen, gerekli DNA’nın miktarı ve kalitesi ve sınırlı verim nedeniyle uygulanabilirlik açısından sınırlıdır, böylece qPCR bazlı TL testlerinin ve ardından MMqPCR testinin artan kullanımı için zemin sağlar. MMqPCR TL yöntemi, her bir QC kriterine dikkat edilerek kurulduğunda, optimize edildiğinde ve sürdürüldüğünde tekrarlanabilir TL ölçümü sağlar. Analiz edilen her kohort için spesifik ICC’nin hesaplanması ve raporlanması, test güvenilirliğini sağlamak için gereklidir. DNA kalitesine ve teknik uzmanlığa tabi olmakla birlikte, MMqPCR yöntemi, küçük miktarlarda DNA gerektirdiği, singleplex PCR’den daha güvenilir olduğu ve reaktif maliyetleri ve teknisyen süresi açısından diğer yöntemlere göre daha verimli olduğu için TL’yi araştıran büyük popülasyon tabanlı çalışmalar için çok uygundur. Yüksek ICC’ler üretme yeteneği, büyük popülasyon tabanlı TL çalışmaları için MMqPCR kullanımını desteklemek için ek veriler sağlar. MMqPCR TL ölçümü, TL’nin tüm nedenlere bağlı mortalite, yaşlanma, yaşam boyu stres, çevresel maruziyetler ve kardiyovasküler hastalık ve kanser gibi fiziksel sağlık sonuçlarının bir biyobelirteç olarak rolünü tanımlamayı amaçlayan çok çeşitli çalışmalara uygulanabilir 4,7,8,10,11,12,13,26,27,28, 29,30,31.

MMqPCR yönteminin bir sınırlaması, TL’yi tek kopya gen, ana karışım bileşimi ve PCR döngü parametrelerinin32 seçimine bağlı olarak değişen göreceli bir uzunluk tahmini olan bir T/S oranı olarak rapor etmesidir. T / S oranı birimsizdir. Bu nedenle, diğer TL ölçüm metodolojileri ile birleştirilmeden, bu yöntem 18,33,34 baz çifti değerlerinde tahminleri raporlama yeteneğine sahip değildir. Sonuç olarak, T/S oranı, çalışmalar arasında alaka düzeyine sahip olmak için bir Z-skoruna dönüştürülmelidir35. Bunu laboratuvarlarda, yöntemlerde ve tahlillerde yaparken çok dikkatli olunmalıdır. Ayrıca, bu yöntem, jel bazlı hibridizasyon deneylerinde olduğu gibi, interstisyel telomerlerin miktar tayinini içerebilir. Bununla birlikte, bu diziler genom başına toplam telomer DNA içeriğinin çok küçük bir bölümünü oluşturur. Ek olarak, interstisyel telomerik dizilerin, kanonik telomer tekrarlarından sapan uyumsuz baz çifti dizileri içerme olasılığı daha yüksektir, bu da primer bağlanması ve amplifikasyon olasılığını azaltır. Ek olarak, MMqPCR testi için gereken minimum DNA miktarı avantajlı olsa da, TL’nin qPCR tabanlı ölçümlerinin, numune saklama koşulları, DNA ekstraksiyon metodolojisi ve biyolojik doku dahil olmak üzere DNA kalitesini ve bütünlüğünü etkileyen pre-analitik faktörlerden etkilendiğine dikkat etmek önemlidir36,37. Bu faktörler için analitik kontrolün, qPCR38 kullanılarak oluşturulan TL ölçümlerinin dış geçerliliğini artırabileceği gösterilmiştir. Buna rağmen, DNA kalitesindeki farklılıkların MMqPCR testi ile üretilen TL üzerindeki etkisinin özellikle sistematik olarak değerlendirilmesi gerekir, çünkü bu yaklaşımı kullanarak bir numunenin doğru bir TL tahmini oluşturmak için yeterli kalitede olup olmadığını belirlemek için veriye dayalı güncel bir kılavuz mevcut değildir. Bu sınırlamalara rağmen, bu testin popülasyon düzeyinde sağlık sonuçları üzerine yapılan çalışmalar için uygulamaları dikkate değerdir.

MMqPCR testini kullanırken, hassasiyet ve verimin sürekli olarak değerlendirilmesi gerekir. Şu anda tasarlandığı gibi, teknisyenler iki termodöngüleyici kullanarak çift plakalar üzerinde aynı anda üç kopya numune çalıştırır. Birden fazla termodöngüleyicinin yokluğunda, azalan verim pahasına bile daha fazla hassasiyet için çift üçlü ölçümleri ve çalışma plakalarını sırayla tutmanızı öneririz. Hassasiyet yerine verime öncelik verme kararına, örneğin tek üçlü ölçümler kullanarak, analitik numunelerin analizine devam etmeden önce elde edilen ICC’lerin kapsamlı bir şekilde test edilmesi ve değerlendirilmesi eşlik etmelidir. Verim ve hassasiyet ile ilgili kararlar verirken, numune boyutu ve numune DNA’sının kalitesi dikkate alınmalıdır. Daha küçük bir örnek boyutu veya düşük kaliteli DNA örnekleri, daha yüksek hassasiyete öncelik verilmesini gerektirir23. Bu, ilgili gruplardan örneklerle çalışırken daha da önemlidir (örneğin, aile üyeleri, birden fazla zaman noktasına sahip denekler). Bu gibi durumlarda, dikkatli bir planlama, örneğin deneye başlamadan önce ilgili numuneleri aynı plakaya atamak, yanlışlıkla plaka karıştırmaya göre gruplandırma yoluyla istatistiksel güç kaybını önlemenin bir yoludur.

Bu test için, DNA numune kalitesini değerlendirmek için bir spektrofotometre kullanıldı: 260/280 oranları için 1.6-2.0 ve 260/230 oranları için 2.0-2.2 aralığındaki numuneler kabul edilebilir olarak kabul edildi. Bu kalite değerlendirmesi ve çift sarmallı DNA’nın florometre ile doğru bir şekilde değerlendirilmesi, tekrarlanabilir TL verilerinin elde edilmesi için bu protokoldeki kritik adımlardır. Numune kalitesinin belirlenmesinde, parça boyutu ve/veya agaroz jel ile belirlenen DNA kalitesinin özet ölçümleri (örneğin, DNA bütünlük numarası) gibi DNA bütünlüğünün diğer, daha tanımlayıcı ölçümleri de kullanılabilir38. Ayrıca, numunelerin seyreltilmesinin yalnızca MMqPCR testinin çalıştırılması için numune hazırlama sırasında gerçekleşmesini öneririz. Bu, DNA alikotlarının ekstraksiyondan sonra mümkün olduğunca az miktarda manipülasyona maruz kalmasını sağlar ve test öncesi işlemedeki değişkenliği azaltır. DNA numunelerinin taşınması gerekiyorsa, daha düşük konsantrasyonlarda DNA numunelerinde meydana gelen bozulmayı azaltmak için mümkün olan en yüksek konsantrasyonda kuru buz üzerinde sevk edilmelidir39,40. Donma-çözülme döngüleri ile meydana gelen DNA bozunması nedeniyle, stok DNA’ya donma-çözülme sayısı en aza indirilmelidir41. Kohort çalıştırılmadan önce havuzlanmış kontrol DNA’sının alikotları oluşturulmalı ve tahlil çalıştırılmadan önce bireysel analitik DNA örneklerinin alikotları oluşturulmalıdır.

Tahlil performansı ve kalite kontrolünün temel metrikleri arasında NTC sinyali, plakalar arası ve plaka içi CV’ler ve standart eğriR2 bulunur. Kalite kontrol kriterlerinin karşılanamaması çeşitli yollarla azaltılabilir. PCR derece H2O stoklarının düzenli olarak değiştirilmesi ve her bir plaka çifti için PCR derece H2O alt stoklarının kesilmesi, NTC amplifikasyonunun yanı sıra kontaminasyon kaynaklarını da en aza indirecektir. Kontaminasyonu azaltmak için ek adımlar şunları içerir: yalnızca MMqPCR testine adanmış özel bir PCR başlığının belirlenmesi; PCR başlığını ve ekipmanını bir DNA dekontamine edici solüsyon ile silmek; odayı ultraviyole ışıkla ışınlamak; ve PCR başlığındayken steril teknik uygulamak. Test tekrarlanabilirliğini artırmak ve CV’leri azaltmak için, DNA örneklerini pipetlerken numuneleri, seyreltmeleri ve PCR şeritlerini ilgili girdap adımlarında kuvvetlice girdaplamak ve iyice yeniden süspanse etmek önerilir. Eşik değerin altındaki bir standart R2 eğrisi (<0,995), büyük olasılıkla plaka yükleme sırasındaki pipetleme hatalarına bağlanabilir. Bunu önlemek için, hassas pipetlemeye ve pipetleri yıllık olarak kalibre etmeye dikkat edin, yüklemeden önce standart PCR şeritlerini kuvvetlice karıştırın ve verimli bir iş akışını teşvik etmek için sarf malzemelerini dikkatli bir şekilde düzenleyin. İki makine ve bir plakanın kullanılmasının sürekli olarak daha yüksek CV'ler çıkardığı gözlemlenirse, sorunu iyileştirmenin potansiyel bir yolu olarak makineye servis yapılmalıdır. Termocycler'ın performansını değerlendirmek için üreticinin QC plakaları plakalar üzerinde düzenli olarak çalıştırılmalıdır.

Yukarıda önerilen adımların uygulanmasından sonra bile sorunlar devam ederse, protokoldeki sorunları gidermek için aşağıdaki adımlar kullanılabilir. Tüm reaktiflerin ne zaman alikote edildiğinin ve ilgili son kullanma tarihlerinin kaydını tutmak, zorluklar kaçınılmaz olarak ortaya çıktığında sorun giderme sürecini kolaylaştırmaya yardımcı olabilir. Herhangi bir sorun giderme sürecinin önemli bir parçası, söz konusu en ucuz reaktiften başlayarak, QC kriterlerini geçmeyen plakaların spesifik nedenini belirlemek için bir seferde yalnızca bir reaktifi ayarlamaktır. Örneğin, hem telomer hem de tek kopya gen düşük verimliliğe sahipse, DTT, dNTP’ler veya SYBR alikot gibi paylaşılan reaktifler, amplikon spesifik primerlerden daha olasıdır. Listelenen fiyatta, yeni alikotlar DTT sırasına göre test edilmeli, ardından dNTP’ler ve son olarak, sorun devam ederse, yeni SYBR alikotları test edilmelidir. Tersine, amplikonlardan sadece biri (telomer veya tek kopya gen) düşük bir verime sahipse, zorluğun nedeni daha çok primerlerden biridir. Şekil 8’de sunulan erime eğrisi tepe noktalarının yorumlanması, sorun giderme için bir temel bilgi kaynağı olarak hizmet edebilir. İki erime eğrisi tepe noktasının görselleştirilmesi, belirli bir numuneyle ilgili potansiyel sorunları belirlemek için kullanılabilir, çünkü bireysel bir problem numunesi, standartlar veya kalan analitik numuneler tarafından sergilenen zirvelerin genel eğiliminden öne çıkacaktır. Eriyik eğrisi, belirli bir amplikon için tepe noktaları sistematik olarak diğerinden daha az keskinse, belirli bir primer ile ilgili sorunları teşhis etmek için de kullanılabilir.

Bu makale, halk sağlığı araştırmalarına geniş uygulanabilirlik ile TL ölçümü için MMqPCR testinin nasıl başarılı bir şekilde kurulacağını detaylandırmakta ve bu verimli ve uygun maliyetli yöntemin erişilebilirliğini ve güvenilirliğini artırmak amacıyla kalite kontrol ve sorun giderme için temel önerileri sunmaktadır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, bu çalışmayı mümkün kılan Telomer Araştırma Ağı Danışma Komitesi’ne ve Ulusal Yaşlanma Enstitüsü / Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü finansmanına (U24 AG066528 ve U24 AG066528-S1) teşekkür eder.

Materials

0.5mL Tubes USA Scientific 1605-0099 Seal-Rite 0.5mL Microcentrifuge Tubes, Sterile
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
1.5mL Tubes USA Scientific 1615-5599 Seal-Rite 1.5mL Microcentrifuge Tubes, Sterile
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
100mM DTT In House Not Applicable Made with stock DTT, diluted sodium acetate, and PCR Grade H2O
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C 
15mL Tubes Thermo Fisher 14-959-53A Corning 352196 Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
1M MgCl2 Thermo Fisher 50152107 Biotang Inc 1M MgCl2 1M Magnesium Chloride Solution, Prepared in 18.2 Megohms Water and Filtered through 0.22 Micron Filter
Storage Temperature and Conditions: 4 °C 
1x Gold Buffer In House Not Applicable 10X Gold Buffer diluted with PCR Grade H2O
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C 
25mM dNTPs New England BioLabs N0446S Deoxynucleotide Solution Set
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C 
5mL Tubes Thermo Fisher 3391276 Argos Technologies Microcentrifuge Tubes – 5mL
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
96 Well Plate Bio-Rad HSP9601 Hard-Shell 96-Well PCR Plates, Low Profile, Thin Wall, Skirted, White / Clear
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Aluminum Foil Office Depot 3489072 Reynolds Wrap Stanard Aluminum Foil Roll, 12" x 75', Silver
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
AmpliTaq Gold Kit – Polymerase and Buffer Thermo Fisher 4311806 AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 (MgCl2 in this kit is not used), 10X Gold Buffer, 2.5U AmpliTaq Gold Polymerase
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C 
Betaine Thermo Fisher AAJ77507AB Betaine, 5M Solution, Molecular Biology Grade, Ultrapure, 10mL
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C 
Big Tube Rack Thermo Fisher 344817 Fisherbrand 4-Way Tube Rack
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
CFX Maestro Software Bio-Rad 12004110 Software for real-time PCR plate setup, data collection, statistics, and graphiing of results
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems with Starter Package Bio-Rad 1845096 96-well optical module for real-time PCR
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
DTT Fisher Scientific AAJ1539706 Dithiothreitol, >99.5+ Molecular Biology Grade, 5 g
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C 
ELIMINase Fisher Scientific 04-355-32 ELIMINase Laboratory Decontaminant
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
HEPA Filter USA Scientific Replacement Filters High-Efficiency Particulate Air Filter for AirClean Workstations
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Kimwipes Thermo Fisher 06666A Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Loading Trough Thermo Fisher 14387069 Thermo Scientific Matrix Reagent Reservoirs
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Microsoft Excel Microsoft Not Applicable Microsoft 365 package, Excel software application
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Mini Centrifuge Genesee Scientific 31-500B Poseidon 31-500B Mini Centrifuge, Blue Lid
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
PCR Grade H2O Thermo Fisher AM9937 Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
PCR Hood USA Scientific 4263-2588 Nucleic Acid Workstation with HEPA Filtration, AirClean Systems Combination PCR Workstation
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
PCR Strips Thermo Fisher AB0776 Low Profile Tubes and Flat Caps, Strips of 8
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
PCR Tube Rack Thermo Fisher 344820 Fisherbrand 96-Well PCR Tube Rack
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipette Tips (Multichannel) Ranin 17005860 Pipette Tips SR LTS 20µL F 960A/5, 20µL Maximum
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipette Tips (Single Channel) USA Scientific 1181-3850 10µL Graduated TipOne RPT Filter Tips
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipette Tips (Single Channel) USA Scientific 1180-1850 20µL Beveled TipOne RPT Filter Tips
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipette Tips (Single Channel) USA Scientific 1111-0880 200µL Natural TipOne Pipette Tips in Racks
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipette Tips (Single Channel) USA Scientific 1111-2890 1000µL Natural Graduated TipOne Pipette Tips in Racks
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipettors (Multichannel) Ranin 17013802 Pipet-Lite Multi Pipette L8-10XLS, 0.5 to 10µL
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipettors (Multichannel) Ranin 17013803 Pipet-Lite Multi Pipette L8-20LS+, 2 to 20µL
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipettors (Single Channel) Thermo Fisher F144802G Gilson Pipetman Classic Pipets, 1 to 10µL
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipettors (Single Channel) Thermo Fisher F123600 Gilson Pipetman Classic Pipets, 2 to 20µL
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipettors (Single Channel) Thermo Fisher F123601 Gilson Pipetman Classic Pipets, 20 to 200µL
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipettors (Single Channel) Thermo Fisher F123602 Gilson Pipetman Classic Pipets, 200 to 1000µL
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Plate Sealing Film Bio-Rad MSB1001 Microseal “B” PCR Plate Sealing Film, Adhesive, Optical
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Plate Spinner Thermo Fisher 14-100-141 Fisherbrand Mini Plate Spinner Centrifuge, 230 V
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pre-Hood Filter USA Scientific 4235-3724 Prefilter for AirClean Systems Workstations
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
R Software The R Project for Statistical Computing Not Applicable R version 4.2.2
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Scale Thermo Fisher 01-922-329 OHAUS 30430060 PR Series Analytical Balance, 62g Capacity
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Scissors Office Depot 458612 Office Depot Brand Scissors, 8”, Straight, Black, Pack of 2
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Sharpies Sharpie 2151734 Brush Twin Permanent Markers, Black
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Single Copy Gene Forward Primer Integrated DNA Technologies Custom See separate table
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C when rehydrated
Single Copy Gene Reverse Primer Integrated DNA Technologies Custom See separate table
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C when rehydrated
Small Tube Rack Thermo Fisher 21-402-17 Thermo Fisher 8601 Reversible Microtube Racks with Lid
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Sodium Acetate Thermo Fisher J63560.EQE 3M NaOAc pH 5.2
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Stainless Steel Spatula Thermo Fisher 3990240 Bel-Art SP Scienceware Stainless-Steel Sampling Spoon and Spatula
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
SYBR Green Thermo Fisher S7563 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain – 10,000X Concentrate in DMSO
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C when rehydrated
Syringe Filters Fisher Scientific 09-927-55A GD/X 25 mm Sterile Syringe Filter, cellulose acetate filtration medium, 0.2 μm
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Syringes Thermo Fisher 148232A BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles, 10mL
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
TE Buffer Fisher Scientific BP2474100 TE Buffer, Tris-EDTA, 1X Solution, pH 7.6, Molecular Biology, Fisher BioReagents
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Telomere Forward Primer Integrated DNA Technologies Custom See separate table
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C when rehydrated
Telomere Reverse Primer Integrated DNA Technologies Custom See separate table
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C when rehydrated
UV Light USA Scientific 4288-2540 UV Light Bulb for Workstations
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Vortex Thermo Fisher 14-955-151 Fisherbrand Mini Vortex Mixer, 115 V, 50/60 Hz
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Weigh Boat Thermo Fisher 01-549-752 Fisherbrand Sterile Hexagonal Weighing Boat, 10mL
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hemann, M., Strong, M., Hao, L., Greider, C. The shortest telomere, not average telomere length, is critical for cell viability and chromosome stability. Cell. 107 (1), 67-77 (2001).
  2. Xu, L., Li, S., Stohr, B. A. The role of telomere biology in cancer. Ann Rev Pathol: Mech Dis. 8, 49-78 (2013).
  3. Lindrose, A., Drury, S. Minimum reporting recommendations for pcr-based telomere length measurement. Telomere Research Network. , (2020).
  4. Verhulst, S., et al. Commentary: The reliability of telomere length measurements. Int J Epidemiol. 44 (5), 1683-1686 (2015).
  5. Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutat Res. 730 (1-2), 59-67 (2012).
  6. Mundstock, E., et al. Effect of obesity on telomere length: Systematic review and meta-analysis. Obesity. 23 (11), 2165-2174 (2015).
  7. Haycock, P. C., et al. Leucocyte telomere length and risk of cardiovascular disease: Systematic review and meta-analysis. BMJ. 349, 4227 (2014).
  8. Astuti, Y., Wardhana, A., Watkins, J., Wulaningsih, W. Cigarette smoking and telomere length: A systematic review of 84 studies and meta-analysis. Environ Res. 158, 480-489 (2017).
  9. Ridout, K. K., Ridout, S. J., Price, L. H., Sen, S., Tyrka, A. R. Depression and telomere length: A meta-analysis. J Affect Disord. 191, 237-247 (2016).
  10. Wang, Q., Zhan, Y., Pedersen, N. L., Fang, F., Hägg, S. Telomere length and all-cause mortality: A meta-analysis. Ageing Res Rev. 48, 11-20 (2018).
  11. Hu, R., Hua, X. G., Jiang, Q. C. Associations of telomere length in risk and recurrence of prostate cancer: A meta-analysis. Andrologia. 51 (7), e13304 (2019).
  12. Schneider, C. V., et al. Association of telomere length with risk of disease and mortality. JAMA Inter Med. 182 (3), 291-300 (2022).
  13. Deng, Y., et al. Telomere length and the risk of cardiovascular diseases: A mendelian randomization study. Front Cardiovasc Med. 9, 1012615 (2022).
  14. D’mello, M. J., et al. Association between shortened leukocyte telomere length and cardiometabolic outcomes: Systematic review and meta-analysis. Circulation: Cardiovasc Gene. 8 (1), 82-90 (2015).
  15. Wilbourn, R. V., et al. The relationship between telomere length and mortality risk in non-model vertebrate systems: A meta-analysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160447 (2018).
  16. Gardner, M., et al. Gender and telomere length: Systematic review and meta-analysis. Exp Gerontol. 51, 15-27 (2014).
  17. Lai, T. -. P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160451 (2018).
  18. Cawthon, R. Telomere measurement by quatitative pcr. Nuc Acid Res. 30 (10), e47-e53 (2002).
  19. Cawthon, R. M. Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative pcr method. Nuc Acid Res. 37 (3), e21-e21 (2009).
  20. Lindrose, A. R., et al. Method comparison studies of telomere length measurement using qpcr approaches: A critical appraisal of the literature. PLoS One. 16 (1), e0245582 (2021).
  21. Lin, J., et al. Effects of DNA extraction, DNA integrity, and laboratory on the precision of qpcr-based telomere length measurement – a multi-lab impartial study. bioRxiv. , (2022).
  22. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of ph and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 474-481 (1997).
  23. Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. Assessment of DNA yield and purity: An overlooked detail of pcr troubleshooting. Clin Microbiol Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).
  24. Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
  25. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  26. Ye, Q., et al. Telomere length and chronological age across the human lifespan: A systematic review and meta-analysis of 414 study samples including 743,019 individuals. Ageing Res Rev. 90, 102031 (2023).
  27. Axelrad, M. D., Budagov, T., Atzmon, G. Telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence. J Vis Exp. (75), e50246 (2013).
  28. Liu, M., et al. Immune-mediated inflammatory diseases and leukocyte telomere length: A mendelian randomization study. Front Genetics. 14, 1129247 (2023).
  29. Van Ockenburg, S., et al. Stressful life events and leukocyte telomere attrition in adulthood: A prospective population-based cohort study. Psychol Med. 45 (14), 2975-2984 (2015).
  30. Zong, Z. Q., et al. Ambient air pollution exposure and telomere length: A systematic review and meta-analysis. Public Health. 215, 42-55 (2023).
  31. Tang, L., Li, D., Wang, J., Su, B., Tian, Y. Ambient air pollution, genetic risk and telomere length in uk biobank. J Expo Sci Environ Epidemiol. , (2023).
  32. Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutat Res. 730 (1), 59-67 (2012).
  33. Lin, J., et al. Systematic and cell type-specific telomere length changes in subsets of lymphocytes. J Immunol Res. 2016, 5371050 (2016).
  34. Needham, B. L., et al. Socioeconomic status, health behavior, and leukocyte telomere length in the national health and nutrition examination survey, 1999-2002. Soc Sci Med. 85, 1-8 (2013).
  35. Verhulst, S. Improving comparability between qpcr-based telomere studies. Mol Ecol Res. 20 (1), 11-13 (2020).
  36. Dagnall, C. L., et al. Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement. PloS one. 12 (9), e0184098 (2017).
  37. Lin, J., Smith, D. L., Esteves, K., Drury, S. Telomere length measurement by qpcr-summary of critical factors and recommendations for assay design. Psychoneuroendocrinology. 99, 271-278 (2019).
  38. Wolf, S. E., et al. Cross-tissue comparison of telomere length and quality metrics of DNA among individuals aged 8 to 70 years. PLOS One. 19 (2), e0290918 (2024).
  39. RoDer, B., FruHwirth, K., Vogl, C., Wagner, M., Rossmanith, P. Impact of long-term storage on stability of standard DNA for nucleic acid-based methods. J Clin Microbiol. 48 (11), 4260-4262 (2010).
  40. Dagnall, C., et al. Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement. PLoS One. 12 (9), e0184098 (2017).
  41. Shao, W., Khin, S., Kopp, W. C. Characterization of effect of repeated freeze and thaw cycles on stability of genomic DNA using pulsed field gel electrophoresis. Biopreserv Biobank. 10 (1), 4-11 (2012).
  42. Institute for Statistics and Mathematics of WU. The Comprehensive R Archive Network Available from: https://cran.r-project.org/ (2024)
  43. Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists. Biol Rev. 85 (4), 935-956 (2010).

Tags

Telomere LengthMonochrome Multiplex Quantitative PCRMMqPCRTelomere MeasurementDNAPeripheral Blood Mononuclear CellsIntraclass Correlation CoefficientPopulation-based Studies
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Martin, N. A., McLester-Davis, L. W. Y., Roy, T. R., Magruder, M. G., Hastings, W. J., Drury, S. S. Monochrome Multiplex Quantitative PCR Telomere Length Measurement. J. Vis. Exp. (205), e66545, doi:10.3791/66545 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image