התמיינות ואפיון אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם
Summary
פרוטוקול זה מציג את ההתמיינות של אוסטאוקלסטים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) ומתאר שיטות לאפיון אוסטאוקלסטים ומבשרי אוסטאוקלסט.
Abstract
פרוטוקול זה מפרט את ההתפשטות וההעברה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ואת התמיינותם לאוסטאוקלסטים. ראשית, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מנותקים לתרחיף חד-תאי לשימוש נוסף בהשראת גוף עוברי. לאחר השראת מזודרמיס, גופים עובריים עוברים התמיינות המטופויטית, ומייצרים אוכלוסיית תאים המטופויטיים צפה. לאחר מכן, התאים ההמטופויטיים שנקטפו עוברים שלב הבשלה של גורם מגרה מושבת מקרופאגים, ולבסוף התמיינות אוסטאוקלסט. לאחר התמיינות אוסטאוקלסט, אוסטאוקלסטים מאופיינים על ידי צביעה עבור TRAP בשילוב עם כתם גרעיני ירוק מתיל. אוסטאוקלסטים נצפים כפוליקריוני TRAP+ מרובי גרעינים. זיהויים יכול להיות נתמך עוד יותר על ידי צביעת Cathepsin K. בדיקות ספיגת עצם ומינרלים מאפשרות אפיון פונקציונלי, המאשר את זהותם של אוסטאוקלסטים בתום לב. פרוטוקול זה מדגים שיטה חזקה ורב-תכליתית להבדיל אוסטאוקלסטים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ומאפשר אימוץ קל ביישומים הדורשים כמויות גדולות של אוסטאוקלסטים אנושיים פונקציונליים. ניתן לחזות יישומים בתחומי חקר העצם, חקר הסרטן, הנדסת רקמות ומחקר אנדופרוטזה.
Introduction
אוסטאוקלסטים (OCs) הם סוגי תאים רב-תכליתיים 1,2 שמקורם בהמטופויאטיים, הנמצאים בשימוש נפוץ על ידי חוקרים בתחומים כגון חקר מחלות עצם 3,4, חקר הסרטן 5,6, הנדסת רקמות 7,8 ומחקר אנדופרוטזה 9,10. אף על פי כן, התמיינות OC יכולה להיות מאתגרת מכיוון שמיזוג של מבשרי מונו-גרעיניים לתוך OCs מרובי גרעינים הוא הכרחי כדי ליצור OCs11 פונקציונליים. מספר גורמים ביולוגיים, כגון מפעיל קולטן של ליגנד NF-κB (RANKL) וגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF), נחוצים להתמיינות OC. M-CSF דווח כבעל השפעה חיובית על התפשטות תאים, הישרדות תאים וביטוי RANK 12,13,14. מצד שני, RANKL נקשר ל- RANK, אשר מפעיל מפל איתות במורד הזרם המשרה אוסטאוקלסטוגנזה. ההפעלה מתווכת באמצעות גורם 6 הקשור לקולטן TNF (TRAF6), המוביל לפירוק הגורם הגרעיני של משפר הגן פוליפפטיד קל קאפה במעכב תאי B, אלפא (IκB-α), חלבון קושר הקושר דימרים NF-kB16,17. לפיכך, התפרקות IκB-α משחררת דימרים NF-kB, אשר לאחר מכן עוברים טרנסלוקציה לתוך הגרעין וגורמים לביטוי של גורמי השעתוק c-Fos וגורם גרעיני של תאי T מופעלים 1 (NFATc1). זה, בתורו, מפעיל את השעתוק של מספר רב של חלבונים הקשורים התמיינות OC15,18. חלבונים מווסתים כגון DC-Stamp ו-Atp6v0d2 מתווכים איחוי תאים-תאים של מבשרי OC, מה שמוביל להיווצרות סינקיטיום 19,20,21.
ביחס לתאים ראשוניים אנושיים, CD34+ ו- CD14+ PBMCs הם כיום סוגי התאים הנפוצים ביותר להתמיינות לOCs22. עם זאת, גישה זו מוגבלת על ידי ההטרוגניות באוכלוסיית CD34+ של תאים שנקטפו מתורמים23 ויכולת ההרחבה המוגבלת שלהם. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים מהווים מקור חלופי לOCs. מכיוון שניתן להפיץ אותם ללא הגבלת זמן24, הם מאפשרים הרחבה ושדרוג של ייצור OC. זה מאפשר הבחנה של מספר גדול של OCs, אשר מאפשר מחקר OC.
מספר פרוטוקולים להבחנה של iPSCs ל- OCs פורסמו 25,26,27. ניתן לחלק את כל תהליך ההתמיינות לחלק התפשטות iPSC, חלק התמיינות מזודרמלי והמטופויאטי, והתמיינות OC. התפשטות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לפני תהליך הבידול מאפשרת שדרוג של ייצור המהרה לפני הבידול. קיימות מספר גישות לגבי התמיינות מזודרמלית והמטופויאטית. באופן מסורתי, היווצרות גוף עוברי (EB) שימשה כדי להתמיין תאים hematopoietic, אבל גישות מבוססות monolayer מייצגים אסטרטגיית התמיינות hematopoietic אחרת שאינה דורשת השראת EB. עם זאת, נראה כי מערכות מבוססות מונו-שכבות דורשות אופטימיזציה נוספת, מכיוון שאנו ואחרים מצאנו שגישות מבוססות EB עמידות יותר לבידול של OCs.
במאמר זה אנו מתארים את ההבחנה בין OCs לבין תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים באמצעות פרוטוקול מבוסס EB. פרוטוקול זה הותאם מ- Rössler et al.26 והותאם כדי להגביר את החוסן ולאפשר שימור בהקפאה במהלך תהליך הבידול. ראשית, קצרנו תאים המטופויטיים רק פעם אחת לאחר 10 ימים של התמיינות. תאים המטופויטיים נשמרו אז בהקפאה כדי לאפשר גמישות רבה יותר בתהליך ההתמיינות. בנוסף, הגדלנו את צפיפות זריעת התאים ההמטופויטיים מ-1 x 105 ל-2 x 105 תאים לסמ”ר2 לצורך התמיינות OC. נעשה שימוש בתווך חדש יותר ללא סרום iPSC אנושי (hiPSC-SFM, ראו טבלת חומרים), וציפוי בארות בוצע עם 200-300 מיקרוגרם/מ”ל של תמצית קרום בסיסי (ראו טבלת חומרים) במקום 0.1% ג’לטין. פניצילין/סטרפטומיצין לא נוסף לתקשורת.
הפרוטוקול של Rössler et al.26 הותאם במקור מ-iPSC לפרוטוקול התמיינות מקרופאגים28 המשתמש בהיווצרות EB להתמיינות המטופויטית. בעוד היווצרות EB שימשה במשך זמן ממושך על ידי חוקרים עבור התמיינות hematopoietic29,30, מספר שיטות של אינדוקציה EB תוארו בספרות, כגון צבירה ספונטנית, צנטריפוגה בצלחת באר עגולה תחתית, תרבית טיפה תלויה, תרבית ביוריאקטורים, תרבית צינור חרוט, כלי לרוחב מסתובב לאט, ותרבית ג’ל micromold31. פרוטוקול זה משתמש בצנטריפוגה של iPSCs מנותקים בלוח באר עגול למטה כדי להביא תאי iPSC בודדים לקרבה זה לזה ולאפשר היווצרות כדור (EB), כמתואר להלן.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מציע שיטה אמינה וחזקה להבדיל iPSCs ל- OCs. עם זאת, ישנם מספר מלכודות שניתן להיתקל בהן לאורך תהליך הבידול. קווי iPSC אנושיים שנוצרו מתאים ממקורות רקמה שונים התמינו בהצלחה באמצעות פרוטוקולזה 33. בעת הקפאת iPSCs בחזרה (ראה שלב פרוטוקול “3. הקפאת iPSCs לאחור”), באר אחת בנקודת המעבר הו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לחברי מעבדת ג’יאצ’לי על עזרתם ותמיכתם הטכנית. אנו מודים למרכז W. M. Keck Microscopy Center ולמנהל מרכז Keck, ד”ר נתנאל פיטרס, על הסיוע בהשגת תמונות המיקרוסקופ הקונפוקלי והמיקרוסקופ הרחב. אנו מודים גם ל-Flow Core Facility של UW ולמנהל מתקן Flow Core, Aurelio Silvestroni, על התמיכה והסיוע הטכני. לבסוף, אנו מודים לחנה בלומקה על התמיכה באיור ובעיצוב גרפי.
המימון ניתן באמצעות מענק המכונים הלאומיים לבריאות R35 HL139602-01. אנו מכירים גם במענק S10 של NIH S10 OD016240 למימון מכשירים במרכז W. M. Keck וכן במענק NIH 1S10OD024979-01A1 למימון מכשירים במתקן UW Flow Core.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-10ML | |
| Antibody – Anti-Cathepsin K | Abcam | ab19027 | |
| Antibody – APC-conjugated Anti-Human CD45 | BD | 555485 | |
| Antibody – APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | |
| Antibody – BV711-conjugated Anti-Human CD14 | BD | 563372 | |
| Antibody – BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD | 563125 | |
| Antibody – Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 | Abcam | ab150079 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human CD14 | R&D Systems | FAB3832P-025 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b | R&D Systems | FAB16991P-025 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 | BD | 560710 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557872 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b | Biolegend | 301308 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl | Biolegend | 400118 | |
| Antibody – PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 550795 | |
| Antibody – PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 | BD | 563521 | |
| Bone Resorption Assay Kit | CosmoBioUSA | CSR-BRA-24KIT | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher | 16812556 | |
| Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Sytems | 3434-010-02 | Basal membrane extract |
| DAPI | R&D Systems | 5748/10 | |
| Dispase (5 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Stem Cell | 36254 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537-500ML | |
| Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) | STEMCELL Technologies | 78211 | |
| Human IL-3 | STEMCELL Technologies | 78146.1 | |
| Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) | STEMCELL Technologies | 78150.1 | |
| Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) | STEMCELL Technologies | 78214.1 | |
| Human Stem Cell Factor (hSCF) | STEMCELL Technologies | 78155.1 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | Biolegend | 422301 | |
| Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) | STEMCELL Technologies | 78073 | |
| Invitrogen Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| MEM α, nucleosides, no phenol red | ThermoFisher | 41061029 | |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 05855 | Serum free cryopreservation medium |
| mTeSR Plus medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM) |
| Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 174925 | Round bottom ultra-low attachment 96-well plate |
| P1000 Wide Bore Tips | ThermoFisher | 2079GPK | |
| ROCK-Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| StemSpan SFEM | StemCell | 09650 | Hematopoietic cell culture medium |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher | 12563011 | Single-cell dissociation reagent |
| Ultraglutamine | Bioscience Lonza | BE17-605E/U1 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Bioscience Lonza | 04-418Q | Hematopoietic basal medium |
| µ-Slide 8 Well High | Ibidi | 80806 |
References
- Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
- Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast functions. Journal of Dental Research. 92 (10), 860-867 (2013).
- Buranaphatthana, W., et al. Engineered osteoclasts resorb necrotic alveolar bone in anti-RANKL antibody-treated mice. Bone. 153, 116144 (2021).
- Wang, L., et al. Isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (147), e58895 (2019).
- Mercatali, L., et al. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Marino, S., Bishop, R. T., de Ridder, D., Delgado-Calle, J., Reagan, M. R. 2D and 3D in vitro co-culture for cancer and bone cell interaction studies. Methods in Molecular Biology. 1914, 71-98 (2019).
- Rementer, C. W., et al. An inducible, ligand-independent receptor activator of NF-κB gene to control osteoclast differentiation from monocytic precursors. PloS One. 8 (12), e0084465 (2013).
- Rementer, C., et al. Engineered myeloid precursors differentiate into osteoclasts and resorb heterotopic ossification in mice. Research Square Priprint. , 2156913 (2022).
- Bjelić, D., Finšgar, M. Bioactive coatings with anti-osteoclast therapeutic agents for bone implants: Enhanced compliance and prolonged implant life. Pharmacological Research. 176, 106060 (2022).
- Minkin, C., Marinho, V. C. Role of the osteoclast at the bone-implant interface. Advances in dental research. 13, 49-56 (1999).
- Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: Review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 1-35 (2020).
- Mun, S. H., Park, P. S. U., Park-Min, K. H. The M-CSF receptor in osteoclasts and beyond. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1239-1254 (2020).
- Plotkin, L. I., Bivi, N. Local regulation of bone cell function. Basic and Applied Bone Biology. , 47-73 (2014).
- Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
- Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
- Boyce, B. F., Xiu, Y., Li, J., Xing, L., Yao, Z. NF-κB-mediated regulation of osteoclastogenesis. Endocrinology and Metabolism. 30 (1), 35 (2015).
- Novack, D. V. Role of NF-κB in the skeleton. Cell Research. 21 (1), 169-182 (2010).
- Kim, K., Lee, S. H., Jung, H. K., Choi, Y., Kim, N. NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP). Molecular Endocrinology. 22 (1), 176-185 (2008).
- Wu, H., Xu, G., Li, Y. P. Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (5), 871 (2009).
- Vignery, A. Macrophage fusion: The making of osteoclasts and giant cells. The Journal of Experimental Medicine. 202 (3), 337 (2005).
- Chiu, Y. H., Ritchlin, C. T. DC-STAMP: A key regulator in osteoclast differentiation. Journal of Cellular Physiology. 231 (11), 2402 (2016).
- Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. S., Ansalone, C. Differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood CD14+ monocytes. Journal of Visualized Experiments. (191), e64698 (2023).
- Gothot, A., Pyatt, R., McMahel, J., Rice, S., Srour, E. F. Functional heterogeneity of human CD34+ cells isolated in subcompartments of the G0 /G1 phase of the cell cycle. Blood. 90 (11), 4384-4393 (1997).
- Dinella, J., Koster, M. I., Koch, P. J. Use of induced pluripotent stem cells in dermatological research. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (8), e23 (2014).
- Grigoriadis, A. E., et al. Directed differentiation of hematopoietic precursors and functional osteoclasts from human ES and iPS cells. Blood. 115 (14), 2769-2776 (2010).
- Rössler, U., et al. Efficient generation of osteoclasts from human induced pluripotent stem cells and functional investigations of lethal CLCN7-related osteopetrosis. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 36 (8), 1621-1635 (2021).
- Chen, I. -. P. Differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into osteoclasts. Bio-Protocol. 10 (24), e3854-e3854 (2020).
- Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
- Abe, K., et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Experimental Cell Research. 229 (1), 27-34 (1996).
- Perlingeiro, R. C. R., Kyba, M., Daley, G. Q. Clonal analysis of differentiating embryonic stem cells reveals a hematopoietic progenitor with primitive erythroid and adult lymphoid-myeloid potential. Development. 128 (22), 4597-4604 (2001).
- Pettinato, G., Wen, X., Zhang, N. Engineering strategies for the formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 24 (14), 1595 (2015).
- Ruiz, J. P., et al. Robust generation of erythroid and multilineage hematopoietic progenitors from human iPSCs using a scalable monolayer culture system. Stem Cell Research. 41, 101600 (2019).
- Blümke, A., et al. Comparison of osteoclast differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells of different tissue origins. Stem Cell Research & Therapy. 14 (1), 319 (2023).
- Klepikova, A., et al. iPSC-Derived Macrophages: The differentiation protocol affects cell immune characteristics and differentiation trajectories. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 16087 (2022).
- Neely, M. D., Tidball, A. M., Aboud, A. A., Ess, K. C., Bowman, A. B. Induced pluripotent stem cells (iPSCs): An emerging model system for the study of human neurotoxicology. Neuromethods. 56, 27-61 (2011).
- Doulatov, S., et al. Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors. Cell Stem Cell. 13 (4), 459-470 (2013).
- Van Winkle, A. P., Gates, I. D., Kallos, M. S. Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells, Tissues, Organs. 196 (1), 34-47 (2012).
- Kim, J. M., et al. Assessment of differentiation aspects by the morphological classification of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 20 (11), 1925-1935 (2011).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (158), e61038 (2020).
- Cao, X., et al. Differentiation and functional comparison of monocytes and macrophages from hiPSCs with peripheral blood derivatives. Stem Cell Reports. 12 (6), 1282 (2019).
- Omata, Y., et al. Interspecies single-cell RNA-seq analysis reveals the novel trajectory of osteoclast differentiation and therapeutic targets. JBMR Plus. 6 (7), e10631 (2022).
- Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201 (2002).
- Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in psteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 641162 (2021).
- Bernhardt, A., Schamel, M., Gbureck, U., Gelinsky, M. Osteoclastic differentiation and resorption is modulated by bioactive metal ions Co2+, Cu2+ and Cr3+ incorporated into calcium phosphate bone cements. PLoS One. 12 (8), e0182109 (2017).
- Akasaka, T., et al. Different micro/nano-scale patterns of surface materials influence osteoclastogenesis and actin structure. Nano Research. 15 (5), 4201-4211 (2022).
- Hobolt-Pedersen, A. S., Delaissé, J. M., Søe, K. Osteoclast fusion is based on heterogeneity between fusion partners. Calcified Tissue International. 95 (1), 73 (2014).
