ヒト人工多能性幹細胞からの破骨細胞の分化と特性評価

注:このプロトコルで使用されるすべての試薬は、 材料表に記載されています。特に指定のない限り、すべての培地は使用前に37°Cに事前に平衡化されています。すべての遠心分離ステップは、37°Cで、最も遅い加速/減速モードを使用して実行されます。特に指定のない限り、上清は常に使い捨てのパスツールガラスピペットを使用して除去されます。 1. ヒトiPS細胞の融解と増殖 iPS細胞を融解する前日に、6ウェルプレートのウェルに200-300μg/mLの濃度で1mLの基底膜抽出物をコーティングします。ウェルプレートを4°Cで一晩置きます。 翌日、細胞を融解し、P1000ピペットを使用して15 mLチューブに移します。滴下し、5〜7 mLのDMEM/F-12と15 mM HEPESを加えます。 細胞を300 x g で5分間遠心分離します。遠心分離機から細胞をそっと取り出し、細胞ペレットを乱さないように注意してください。 パスツールグラスピペットで上清を慎重に除去し、細胞を1 mLのヒトiPS細胞血清遊離培地(10 μMのRhoキナーゼ(ROCK)阻害剤Y-27632を含むhiPSC-SFM)に、先端の広いP1000を用いて再懸濁します。 前日に塗布したウェルから基底膜抽出物を吸引し(ステップ1.1)、10μMのY-27632を含むiPSC-SFM1mLをウェルに移します。再懸濁したiPS細胞をウェルに添加し、最終容量がウェルあたり2 mLになるようにします。 プレートを回転させてiPS細胞の凝集体を均一に分散させ、37°C、5%CO2のインキュベーターに入れます。 iPSC-SFM(ROCK阻害剤Y-27632を添加しない)を用いて、1日おきに完全な培地交換を行う。iPS細胞は通常、3〜4日で増殖後に70〜80%のコンフルエントに達します。 2. 継代iPS細胞 継代iPS細胞の1日前に、6ウェルプレートのウェルに200〜300μg/mLの濃度で基底膜抽出物をコーティングします。ウェルプレートを4°Cで一晩置きます。注:細胞が約70〜80%のコンフルエントに達していることを確認します。iPS細胞が過剰にコンフルエントにならないように(80%以上のコンフルエントに)、自然分化を促進します。 10 μLまたは20 μLのピペットチップまたは細胞スクレーパーを使用して、実体顕微鏡下で分化領域または死体iPS細胞凝集体が多数存在する領域を除去することにより、iPS細胞の継代を開始します。区別された領域は、色が濃くまたは白く表示されます。注:掻き落とされた細胞凝集体は、ウェルの底に部分的に付着している可能性があります。 ウェルの底を口径の広いP1000ピペットで数回洗浄し、ウェルの底に部分的に付着している凝集体を取り除きます。 iPS細胞を培養した使用済み培地のうち、剥離したiPS細胞凝集体を含むものは廃棄してください。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄ステップをさらに2回繰り返します。 次に、ウェルあたり 1 mL の 5 U/mL ディスパーゼを添加します。iPS細胞コロニーの縁はウェルプレートから浮き上がり、室温で3〜5分間インキュベートした後、実体顕微鏡で観察することができます。 わずかに剥離した凝集体が除去されないようにディスパーゼを慎重に除去し、1 mL の DMEM/F-12 と 15 mM HEPES を添加します。使い捨てのセルリフターを使用して、凝集体を小さなサイズにスライスします。iPS細胞の凝集体の一貫性は、幹細胞継代ツールで改善することができます。 スライスしたiPS細胞の凝集体をウェル内の培地で洗い流し、凝集体を含む培地を5 mLの血清ピペットまたは口径の広いP1000を使用して15 mLのコニカルチューブに移します。 ウェルをDMEM/F-12で洗浄し、iPS細胞凝集体を含む15 mLチューブに培地を移します。 スライスしたiPS細胞凝集体を200 x g で3分間遠心分離します。パスツールガラスピペットで上清を除去し、2 mLのiPSC-SFMを加えて、5 mLの血清ピペットまたは口径の広いP1000を使用してiPS細胞を除去し、再懸濁します。 プレコートされたウェルプレートから残った基底膜抽出物を吸引し、6ウェルプレートの各ウェルに1 mLのhiPSC-SFMを加えます。 iPS細胞を6ウェルプレートの新しいウェルに移し、最終容量が2 mLになるように、先端径の広いP1000を使用します。iPS細胞株によっては、分割比を最適化する必要があります。ここでは、1:6の分割比を使用しました。 実体顕微鏡下でウェルに浮遊骨材と骨材サイズがないか確認します。理想的には、凝集体のサイズは50〜200μmである必要があります。 凝集体が移されたら、ウェルプレートを旋回させて細胞をプレート全体に均等に分散させ、37°C、5%CO2 で70〜80%のコンフルエントになるまでインキュベートします。 3. iPS細胞の凍結 iPS細胞を凍結して戻すには、上記のように細胞を継代します(プロトコルステップ「2.iPS細胞の継代」)。細胞をコロニーにスライスし、ウェルの底から洗い流した後(ステップ2.10)、スライスした凝集体を200 x g で3分間スピンダウンします。上澄みを吸引する。 6ウェルプレートのウェルあたり1 mLの無血清凍結保存培地を15 mLチューブに加え、先端径の広いP1000を使用してスライスした凝集体を再懸濁します。 細胞を標識済みのクライオチューブに移します。チューブを閉じ、4°Cで事前に冷却した凍結保存容器にチューブを移します。 細胞を-80°Cで24〜48時間保存します。 クライオバイアルを液体窒素に移し、長期保存します。メモ:OCの区別プロセスの概略図を 図1に示します。 4.胚様体誘導 EB誘導のために、上記のように十分なiPS細胞を培養し、増殖させる。注:OC産生は、胚様体の数を増やすことでスケールアップすることができ、その結果、造血細胞の全体的な収量が高くなります。70〜80%のコンフルエントiPS細胞の1つのウェルは、6ウェルプレートウェルのウェルあたり約8.4 x 105 細胞を生成します。12,500個の単一細胞iPS細胞が1つの胚様体を形成するのに必要です。 iPS細胞培養液から使用済み培地を吸引し、iPS細胞コロニーをD-PBSで洗い流します。 室温に予熱したシングルセル解離試薬0.5 mLを6ウェルプレートの各ウェルに加え、培養容器を旋回させてウェル表面全体をコーティングします。培養容器を37°Cで5〜8分間インキュベートします。 インキュベーターから容器を取り出し、単一細胞解離試薬を吸引し、50 ng/mLのヒト骨形成タンパク質4(hBMP4)、50 ng/mLのヒト血管内皮増殖因子-165(hVEGF)、20 ng/mLのヒト幹細胞因子(hSCF)を含むiPS細胞血清遊離培地からなるステージ1分化培地1 mLをウェルに加えます。 および10μM Y-27632。 ステージ1培地でウェルをすすぐことにより、細胞を静かに剥離します。解離したiPS細胞を15mLのコニカルチューブにプールします。 ステージ1の分化培地1 mLをウェルに加え、残っている細胞を洗い流すか、簡単に洗い流せないコロニーにはセルスクレーパーを使用します。 すべての細胞をチューブに移した後、室温で200 × gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを形成します。5 mLの血清ピペットまたはボアチップの広いP1000を使用して、合計2 mLの平衡化済みステージ1分化培地に細胞を吸引し、再懸濁します。 血球計算盤または自動細胞計数装置を使用して細胞をカウントします。単一細胞懸濁液を含む15 mLチューブに培地を添加し、1ウェルあたり12,500個の細胞を丸底超低付着96ウェルプレートにステージ1分化培地100 μLで播種します。注:顕微鏡下では、細胞はウェル全体に分散した単一細胞懸濁液として現れます。 96ウェルプレートを100 x gで3分間遠心分離します。遠心分離後、細胞は顕微鏡で見るとスフェロイドに似始めるはずです。プレートを37°Cのインキュベーターに24時間置きます。 1日目と2日目に培地の半分をステージ1の分化培地で交換します。効率を向上させるには、マルチチャンネルピペットを使用して、使用済みのステージ1分化培地50 μLをペトリ皿に廃棄します。 96ウェルプレートから培地を廃棄した後、実体顕微鏡で誤って除去された可能性のあるEBがないか確認します。誤って除去したEBを、口径の広いP1000ピペットを使用して96ウェルプレートに移し替えます。 マルチチャンネルピペットを使用して、丸底超低アタッチメント96ウェルプレートの各ウェルに50 μLの新鮮なステージ1分化培地を加えます。 5. 造血分化 造血分化開始の1日前に、6ウェルプレートのウェルに200〜300μg/mLの濃度で1mLの基底膜抽出物をコーティングします。ウェルプレートを4°Cで一晩置きます。注:各ウェルは、このプロトコルの後の時点で8つのEBを受け取ります。準備したEBの数に応じて、それに応じてウェルをコーティングします。 2 mM ウルトラグルタミン、55 μM 2-メルカプトエタノール、25 ng/mL ヒトインターロイキン 3(hIL-3)、および100 ng/mL ヒトマクロファージコロニー刺激因子(hM-CSF)を添加した造血基礎培地からなるステージ 2 分化培地 3 mL で、6 ウェルプレートの余分な基底膜抽出物およびプレフィルウェルを吸引します。 ボアチップの広いP1000を使用して、8つのEBを6ウェルプレートの各ウェルに移します。移し替え後、目視または実体顕微鏡で、各ウェルに8つのEBがあることを確認します。注:1日後、フローティングEBはウェルの底に付着します。次の5〜7日で、造血細胞を含む浮遊細胞集団が見えるようになります。造血分化期間は、7日間から変更することができます。10日間の分化により、大きなCD45+、CD14+ 、およびCD11b+ 亜集団で構成される造血集団が示されました。 ステージ2の分化培地で5日間処理した後、使用済みの培地を除去し、50 mLのコニカルチューブに分注することにより、培地交換を行います。ゆっくりとピペットで操作し、浮遊細胞をできるだけ少なくし、せん断応力をできるだけ低く保ちます。実体顕微鏡下でのピペッティングは、細胞の偶発的な除去を防ぐのに役立ちます。 ただちに1 mLの新鮮なステージ2分化培地をウェルに加えます。分化プロセスのこの時点ですでに存在する可能性のある浮遊造血細胞を回収するために、分注した培地を廃棄しないでください。むしろ、使用済みの培地でチューブを300 x g で5分間スピンダウンし、上清を吸引します。 新しいステージ2分化培地をチューブに加え、使用済みの培地と一緒に移された可能性のある細胞を剥離するために再懸濁します。 回収した細胞を含む新鮮なステージ2分化培地2 mLを、ステージ2分化培地1 mLで事前に充填した各ウェルに加えます。 造血分化10日目に、浮遊造血細胞が多数存在するか確認する。50mLのチューブに集めて収穫します。10%DMSO、50S、および40%培地で凍結するか、細胞をOCに分化させるためにすぐに使用できます。 6. M-CSFの成熟とOCの分化 200,000細胞/cm2 の濃度で細胞を組織培養処理ウェルプレートに播種し、10Sおよび50ng/mLのhM-CSFを添加したα-MEMで処理します。 機能アッセイまたはイメージングを行うには、播種後3日後に、先端径の広いP1000を用いて、予め温めたPBSで37°Cに洗浄することにより、M-CSF成熟細胞を剥離します。細胞を完全に剥離するには、洗浄ステップを繰り返す必要がある場合があります。 分離した細胞を、口径の広いP1000を使用して15 mLチューブに移し、300 x g で5分間遠心分離します。上澄みを捨てます。 細胞ペレットを、10% FBS、50 ng/mL hM-CSF、および80 ng/mL hRANKLを添加したα-MEMからなるOC分化培地で再懸濁し、溶解します。血球計算盤または自動細胞計数装置を使用して細胞をカウントし、M-CSF成熟細胞を200,00-250,000細胞/cm2 の密度で機能アッセイまたはイメージング用の適切な培養器装(すなわち、骨吸収アッセイ、イメージング用のカバースリップスライドなど)に再播種します。 OC分化培地で7〜9日間分化します。2〜3日ごとに新鮮なOC分化培地で完全なウェル培地交換を行います。注:多核OCは通常、5〜7日後に現れます。