تمايز وتوصيف الخلايا الآكلة للعظم من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان
Summary
يعرض هذا البروتوكول تمايز الخلايا الآكلة للعظم البشري عن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ويصف طرق توصيف الخلايا الآكلة للعظم وسلائف ناقضة العظم.
Abstract
يفصل هذا البروتوكول انتشار وتمرير iPSCs البشرية وتمايزها إلى ناقضات عظمية. أولا ، يتم فصل iPSCs إلى تعليق أحادي الخلية لمزيد من الاستخدام في تحريض الجسم الجنيني. بعد تحريض الأديم المتوسط ، تخضع الأجسام الجنينية لتمايز المكونة للدم ، مما ينتج عنه مجموعة خلايا مكونة للدم عائمة. بعد ذلك ، تخضع الخلايا المكونة للدم المحصودة لخطوة نضوج عامل تحفيز مستعمرة البلاعم ، وأخيرا تمايز ناقضة العظم. بعد تمايز ناقضة العظم ، تتميز الخلايا الآكلة للعظم بتلطيخ TRAP بالتزامن مع بقعة نووية خضراء ميثيل. لوحظت الخلايا الآكلة للعظم على أنها متعددة النوى ، TRAP + متعددة النوى. يمكن دعم تحديدهم بشكل أكبر من خلال تلطيخ Cathepsin K. تسمح مقايسات ارتشاف العظام والمعادن بالتوصيف الوظيفي ، مما يؤكد هوية الخلايا الآكلة للعظم حسنة النية. يوضح هذا البروتوكول طريقة قوية ومتعددة الاستخدامات للتمييز بين الخلايا الآكلة للأخطاء البشرية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية ويسمح باعتمادها بسهولة في التطبيقات التي تتطلب كميات كبيرة من ناقضات العظم البشرية الوظيفية. يمكن تصور التطبيقات في مجالات أبحاث العظام وأبحاث السرطان وهندسة الأنسجة وأبحاث الأطراف الاصطناعية.
Introduction
الخلايا الآكلة للعظم (OCs) هي مشتقة من المكونة للدم 1,2 ، وأنواع خلايا متعددة الاستخدامات يشيع استخدامها من قبل الباحثين في مجالات مثل أبحاث أمراض العظام 3,4 ، وأبحاث السرطان 5,6 ، وهندسة الأنسجة 7,8 ، وأبحاث الأطراف الاصطناعية 9,10. ومع ذلك ، يمكن أن يكون تمايز OC أمرا صعبا لأن اندماج السلائف أحادية النواة في OCs متعددة النوى ضروري لإنشاء OCsوظيفية 11. العديد من العوامل البيولوجية ، مثل منشط مستقبلات NF-κB ligand (RANKL) وعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) ، ضرورية لتمايز OC. تم الإبلاغ عن أن M-CSF له تأثير إيجابي على تكاثر الخلايا وبقاء الخلايا وتعبير RANK12،13،14. من ناحية أخرى ، يرتبط RANKL ب RANK ، الذي ينشط شلالات الإشارات النهائية التي تحفز تكوين العظم. يتم التوسط في التنشيط عبر العامل المرتبط بمستقبلات TNF 6 (TRAF6) ، مما يؤدي إلى تدهور العامل النووي لمحسن جين كابا الببتيد الضوئي في مثبط الخلايا البائية ، ألفا (IκB-α) ، وهو بروتين ملزم يربط ثنائيات NF-kB16,17. ومن ثم ، فإن تحلل IκB-α يطلق ثنائيات NF-kB ، والتي تنتقل بعد ذلك إلى النواة وتحفز التعبير عن عوامل النسخ c-Fos والعامل النووي للخلايا التائية المنشطة 1 (NFATc1). وهذا بدوره يؤدي إلى نسخ العديد من البروتينات المرتبطة بالتمايز OC15,18. تتوسط البروتينات غير المنظمة مثل DC-Stamp و Atp6v0d2 اندماج الخلايا الخلوية لسلائف OC ، مما يؤدي إلى تكوين الخلايا المخلوية19،20،21.
فيما يتعلق بالخلايا الأولية البشرية ، تعد CD34 + و CD14 + PBMCs حاليا أكثر أنواع الخلايا استخداما للتمايز إلى OCs22. ومع ذلك ، فإن هذا النهج محدود بسبب عدم التجانس داخل مجموعة CD34 + للخلايا المحصودة من المتبرعين23 وقابليتها المحدودة للتوسع. تقدم iPSCs البشرية مصدرا بديلا ل OCs. نظرا لأنه يمكن نشرها إلى أجل غير مسمى24 ، فإنها تسمح بالتوسع ورفع مستوى إنتاج OC. هذا يسمح بتمييز أعداد كبيرة من OCs ، مما يسهل أبحاث OC.
تم نشر العديد من البروتوكولات للتمييز بين iPSCs إلى OCs25،26،27. يمكن تقسيم عملية التمايز بأكملها إلى جزء انتشار iPSC ، وجزء تمايز الأديم المتوسط والمكونة للدم ، وتمايز OC. يسمح انتشار iPSCs قبل عملية التمايز برفع مستوى إنتاج OC قبل التمايز. توجد عدة طرق فيما يتعلق بالتمايز بين الأديم المتوسط والمكونة للدم. تقليديا ، تم استخدام تكوين الجسم الجنيني (EB) للتمييز بين الخلايا المكونة للدم ، لكن الأساليب القائمة على أحادية الطبقة تمثل استراتيجية تمايز أخرى مكونة للدم لا تتطلب تحريض EB. ومع ذلك ، يبدو أن الأنظمة القائمة على الطبقة الواحدة تتطلب مزيدا من التحسين ، حيث وجدنا نحن وآخرون أن الأساليب القائمة على EB أكثر قوة للتمييز بين OCs.
هنا ، نصف تمايز OCs عن iPSCs البشرية باستخدام بروتوكول قائم على EB. تم تكييف هذا البروتوكول من Rössler et al.26 وتعديله لزيادة المتانة والسماح بالحفظ بالتبريد أثناء عملية التمايز. أولا ، حصدنا الخلايا المكونة للدم مرة واحدة فقط بعد 10 أيام من التمايز. ثم تم حفظ الخلايا المكونة للدم بالتبريد للسماح بمزيد من المرونة أثناء عملية التمايز. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بزيادة كثافة بذر الخلايا المكونة للدم من 1 × 105 إلى 2 × 105 خلايا / سم2 لتمايز OC. تم استخدام وسط بشري أحدث خال من مصل iPSC (hiPSC-SFM ، انظر جدول المواد) ، وتم طلاء الآبار ب 200-300 ميكروغرام / مل من مستخلص الغشاء القاعدي (انظر جدول المواد) بدلا من 0.1٪ جيلاتين. لم تتم إضافة البنسلين / الستربتومايسين إلى وسائل الإعلام.
تم تكييف بروتوكول Rössler et al.26 في الأصل من iPSC إلى بروتوكول تمايز البلاعم28 الذي يستخدم تكوين EB للتمايز المكونة للدم. بينما تم استخدام تكوين EB لفترة طويلة من قبل الباحثين للتمايز المكونة للدم29،30 ، تم وصف العديد من طرق تحريض EB في الأدبيات ، مثل التجميع التلقائي ، والطرد المركزي في صفيحة بئر مستديرة القاع ، وثقافة قطرة معلقة ، وثقافة المفاعل الحيوي ، وثقافة الأنبوب المخروطي ، والوعاء الجانبي البطيء الدوران ، وثقافة هلام micromold31. يستخدم هذا البروتوكول الطرد المركزي ل iPSCs المنفصلة في لوحة بئر مستديرة القاع لتقريب خلايا iPSC المفردة من بعضها البعض وللسماح بتكوين الكرة (EB) ، كما هو موضح أدناه.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة وقوية للتمييز بين iPSCs إلى OCs. ومع ذلك ، هناك العديد من المزالق التي يمكن مواجهتها خلال عملية التمايز. تم تمييز خطوط iPSC البشرية المتولدة من خلايا من أصول أنسجة مختلفة بنجاح باستخدام هذا البروتوكول33. عند تجميد iPSCs مرة أخرى (انظر خطوة البروتوكول “3. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبر Giachelli على مساعدتهم الفنية ودعمهم. نشكر مركز W. M. Keck المجهري ومدير مركز Keck ، الدكتور Nathanial Peters ، للمساعدة في الحصول على الفحص المجهري متحد البؤر والصور المجهرية واسعة المجال. كما نشكر مرفق UW Flow Core ومدير مرفق التدفق الأساسي ، Aurelio Silvestroni ، على الدعم الفني والمساعدة. أخيرا ، نشكر Hannah Blümke على الدعم في الرسم التوضيحي والتصميم الجرافيكي.
تم توفير التمويل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R35 HL139602-01. نعترف أيضا بمنحة NIH S10 S10 OD016240 لتمويل الأدوات في مركز W. M. Keck بالإضافة إلى منحة NIH 1S10OD024979-01A1 لتمويل الأدوات في مرفق UW Flow الأساسي.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-10ML | |
| Antibody – Anti-Cathepsin K | Abcam | ab19027 | |
| Antibody – APC-conjugated Anti-Human CD45 | BD | 555485 | |
| Antibody – APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | |
| Antibody – BV711-conjugated Anti-Human CD14 | BD | 563372 | |
| Antibody – BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD | 563125 | |
| Antibody – Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 | Abcam | ab150079 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human CD14 | R&D Systems | FAB3832P-025 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b | R&D Systems | FAB16991P-025 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 | BD | 560710 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557872 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b | Biolegend | 301308 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl | Biolegend | 400118 | |
| Antibody – PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 550795 | |
| Antibody – PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 | BD | 563521 | |
| Bone Resorption Assay Kit | CosmoBioUSA | CSR-BRA-24KIT | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher | 16812556 | |
| Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Sytems | 3434-010-02 | Basal membrane extract |
| DAPI | R&D Systems | 5748/10 | |
| Dispase (5 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Stem Cell | 36254 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537-500ML | |
| Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) | STEMCELL Technologies | 78211 | |
| Human IL-3 | STEMCELL Technologies | 78146.1 | |
| Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) | STEMCELL Technologies | 78150.1 | |
| Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) | STEMCELL Technologies | 78214.1 | |
| Human Stem Cell Factor (hSCF) | STEMCELL Technologies | 78155.1 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | Biolegend | 422301 | |
| Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) | STEMCELL Technologies | 78073 | |
| Invitrogen Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| MEM α, nucleosides, no phenol red | ThermoFisher | 41061029 | |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 05855 | Serum free cryopreservation medium |
| mTeSR Plus medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM) |
| Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 174925 | Round bottom ultra-low attachment 96-well plate |
| P1000 Wide Bore Tips | ThermoFisher | 2079GPK | |
| ROCK-Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| StemSpan SFEM | StemCell | 09650 | Hematopoietic cell culture medium |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher | 12563011 | Single-cell dissociation reagent |
| Ultraglutamine | Bioscience Lonza | BE17-605E/U1 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Bioscience Lonza | 04-418Q | Hematopoietic basal medium |
| µ-Slide 8 Well High | Ibidi | 80806 |
References
- Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
- Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast functions. Journal of Dental Research. 92 (10), 860-867 (2013).
- Buranaphatthana, W., et al. Engineered osteoclasts resorb necrotic alveolar bone in anti-RANKL antibody-treated mice. Bone. 153, 116144 (2021).
- Wang, L., et al. Isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (147), e58895 (2019).
- Mercatali, L., et al. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Marino, S., Bishop, R. T., de Ridder, D., Delgado-Calle, J., Reagan, M. R. 2D and 3D in vitro co-culture for cancer and bone cell interaction studies. Methods in Molecular Biology. 1914, 71-98 (2019).
- Rementer, C. W., et al. An inducible, ligand-independent receptor activator of NF-κB gene to control osteoclast differentiation from monocytic precursors. PloS One. 8 (12), e0084465 (2013).
- Rementer, C., et al. Engineered myeloid precursors differentiate into osteoclasts and resorb heterotopic ossification in mice. Research Square Priprint. , 2156913 (2022).
- Bjelić, D., Finšgar, M. Bioactive coatings with anti-osteoclast therapeutic agents for bone implants: Enhanced compliance and prolonged implant life. Pharmacological Research. 176, 106060 (2022).
- Minkin, C., Marinho, V. C. Role of the osteoclast at the bone-implant interface. Advances in dental research. 13, 49-56 (1999).
- Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: Review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 1-35 (2020).
- Mun, S. H., Park, P. S. U., Park-Min, K. H. The M-CSF receptor in osteoclasts and beyond. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1239-1254 (2020).
- Plotkin, L. I., Bivi, N. Local regulation of bone cell function. Basic and Applied Bone Biology. , 47-73 (2014).
- Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
- Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
- Boyce, B. F., Xiu, Y., Li, J., Xing, L., Yao, Z. NF-κB-mediated regulation of osteoclastogenesis. Endocrinology and Metabolism. 30 (1), 35 (2015).
- Novack, D. V. Role of NF-κB in the skeleton. Cell Research. 21 (1), 169-182 (2010).
- Kim, K., Lee, S. H., Jung, H. K., Choi, Y., Kim, N. NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP). Molecular Endocrinology. 22 (1), 176-185 (2008).
- Wu, H., Xu, G., Li, Y. P. Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (5), 871 (2009).
- Vignery, A. Macrophage fusion: The making of osteoclasts and giant cells. The Journal of Experimental Medicine. 202 (3), 337 (2005).
- Chiu, Y. H., Ritchlin, C. T. DC-STAMP: A key regulator in osteoclast differentiation. Journal of Cellular Physiology. 231 (11), 2402 (2016).
- Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. S., Ansalone, C. Differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood CD14+ monocytes. Journal of Visualized Experiments. (191), e64698 (2023).
- Gothot, A., Pyatt, R., McMahel, J., Rice, S., Srour, E. F. Functional heterogeneity of human CD34+ cells isolated in subcompartments of the G0 /G1 phase of the cell cycle. Blood. 90 (11), 4384-4393 (1997).
- Dinella, J., Koster, M. I., Koch, P. J. Use of induced pluripotent stem cells in dermatological research. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (8), e23 (2014).
- Grigoriadis, A. E., et al. Directed differentiation of hematopoietic precursors and functional osteoclasts from human ES and iPS cells. Blood. 115 (14), 2769-2776 (2010).
- Rössler, U., et al. Efficient generation of osteoclasts from human induced pluripotent stem cells and functional investigations of lethal CLCN7-related osteopetrosis. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 36 (8), 1621-1635 (2021).
- Chen, I. -. P. Differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into osteoclasts. Bio-Protocol. 10 (24), e3854-e3854 (2020).
- Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
- Abe, K., et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Experimental Cell Research. 229 (1), 27-34 (1996).
- Perlingeiro, R. C. R., Kyba, M., Daley, G. Q. Clonal analysis of differentiating embryonic stem cells reveals a hematopoietic progenitor with primitive erythroid and adult lymphoid-myeloid potential. Development. 128 (22), 4597-4604 (2001).
- Pettinato, G., Wen, X., Zhang, N. Engineering strategies for the formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 24 (14), 1595 (2015).
- Ruiz, J. P., et al. Robust generation of erythroid and multilineage hematopoietic progenitors from human iPSCs using a scalable monolayer culture system. Stem Cell Research. 41, 101600 (2019).
- Blümke, A., et al. Comparison of osteoclast differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells of different tissue origins. Stem Cell Research & Therapy. 14 (1), 319 (2023).
- Klepikova, A., et al. iPSC-Derived Macrophages: The differentiation protocol affects cell immune characteristics and differentiation trajectories. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 16087 (2022).
- Neely, M. D., Tidball, A. M., Aboud, A. A., Ess, K. C., Bowman, A. B. Induced pluripotent stem cells (iPSCs): An emerging model system for the study of human neurotoxicology. Neuromethods. 56, 27-61 (2011).
- Doulatov, S., et al. Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors. Cell Stem Cell. 13 (4), 459-470 (2013).
- Van Winkle, A. P., Gates, I. D., Kallos, M. S. Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells, Tissues, Organs. 196 (1), 34-47 (2012).
- Kim, J. M., et al. Assessment of differentiation aspects by the morphological classification of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 20 (11), 1925-1935 (2011).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (158), e61038 (2020).
- Cao, X., et al. Differentiation and functional comparison of monocytes and macrophages from hiPSCs with peripheral blood derivatives. Stem Cell Reports. 12 (6), 1282 (2019).
- Omata, Y., et al. Interspecies single-cell RNA-seq analysis reveals the novel trajectory of osteoclast differentiation and therapeutic targets. JBMR Plus. 6 (7), e10631 (2022).
- Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201 (2002).
- Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in psteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 641162 (2021).
- Bernhardt, A., Schamel, M., Gbureck, U., Gelinsky, M. Osteoclastic differentiation and resorption is modulated by bioactive metal ions Co2+, Cu2+ and Cr3+ incorporated into calcium phosphate bone cements. PLoS One. 12 (8), e0182109 (2017).
- Akasaka, T., et al. Different micro/nano-scale patterns of surface materials influence osteoclastogenesis and actin structure. Nano Research. 15 (5), 4201-4211 (2022).
- Hobolt-Pedersen, A. S., Delaissé, J. M., Søe, K. Osteoclast fusion is based on heterogeneity between fusion partners. Calcified Tissue International. 95 (1), 73 (2014).
