ヒト人工多能性幹細胞からの破骨細胞の分化と特性評価
Summary
このプロトコルは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)からのヒト破骨細胞の微分を示し、破骨細胞および破骨細胞の前駆細胞の性格描写のための方法を記述する。
Abstract
このプロトコルでは、ヒトiPS細胞の増殖と継代、および破骨細胞への分化について詳しく説明します。まず、iPS細胞を単一細胞懸濁液に解離し、胚様体誘導に利用します。中胚葉誘導後、胚様体は造血分化を受け、浮遊造血細胞集団を産生します。その後、採取された造血細胞は、マクロファージコロニー刺激因子の成熟段階を経て、最後に破骨細胞の分化を経ます。破骨細胞の分化後、破骨細胞はメチルグリーン核染色と組み合わせたTRAPの染色を特徴としています。破骨細胞は、多核のTRAP+多核として観察されます。それらの同定は、カテプシンK染色によってさらに裏付けられます。骨およびミネラル吸収アッセイは、機能的特性評価を可能にし、真正な破骨細胞の同一性を確認します。このプロトコールは、ヒト破骨細胞とiPS細胞を区別するための堅牢で汎用性の高い方法を実証し、大量の機能的なヒト破骨細胞を必要とするアプリケーションへの容易な採用を可能にします。骨研究、がん研究、組織工学、人工骨内研究などの分野での応用が想定されています。
Introduction
破骨細胞(OC)は造血由来の1,2汎用性の高い細胞タイプであり、骨疾患研究3,4、がん研究5,6、組織工学7,8、エンドプロテーゼ研究9,10などの分野の研究者によって一般的に使用されています.それにもかかわらず、機能的なOCを作製するには単核前駆体の多核OCへの融合が必要であるため、OCの分化は困難な場合があります11。OCの分化には、NF-κBリガンド受容体活性化因子(RANKL)やマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)など、いくつかの生物学的因子が必要です。M-CSFは、細胞増殖、細胞生存、およびRANK発現にプラスの効果をもたらすことが報告されています12,13,14。一方、RANKLはRANKに結合し、破骨細胞形成を誘導する下流のシグナル伝達カスケードを活性化します。活性化はTNF受容体関連因子6(TRAF6)を介して媒介され、NF-κB二量体に結合する結合タンパク質であるB細胞阻害剤α(IκB-α)のκ光ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核因子の分解につながる16,17。したがって、IκB-α分解によりNF-κB二量体が放出され、これが核内に移動し、転写因子c-Fosおよび活性化T細胞核因子1(NFATc1)の発現が誘導されます。これにより、多数のOC分化関連タンパク質の転写が引き起こされる15,18。DC-StampやAtp6v0d2などのアップレギュレーションされたタンパク質は、OC前駆体の細胞間融合を媒介し、合胞体の形成を引き起こします19,20,21。
ヒト初代細胞に関しては、CD34+ およびCD14+ PBMCが現在、OCへの分化に最も広く使用されている細胞型である22。しかしながら、このアプローチは、ドナーから採取された細胞のCD34+ 集団内の不均一性23 およびそれらの限られた拡張性によって制限される。ヒトiPS細胞は、OCの代替供給源となります。それらは無期限に伝播することができるので24、それらはOC生産の拡張性とアップスケーリングを可能にします。これにより、多数のOCの区別が可能になり、OC研究が容易になります。
iPS細胞をOCに分化させるためのいくつかのプロトコルが発表されています25,26,27。分化過程全体は、iPS細胞増殖部、中胚葉分化部、造血分化部、OC分化に分けられます。分化プロセスの前にiPS細胞を増殖させることで、分化前のOC産生のスケールアップが可能になります。中胚葉分化と造血分化に関しては、いくつかのアプローチがあります。従来、胚様体(EB)形成は造血細胞の分化に使用されてきましたが、単層ベースのアプローチは、EB誘導を必要としない別の造血分化戦略を表しています。それにもかかわらず、単層ベースのシステムは、EBベースのアプローチがOCの分化のためにより頑健であることを発見したため、さらなる最適化が必要であるようです。
ここでは、EBベースのプロトコルを用いたヒトiPS細胞からのOCの鑑別について説明します。このプロトコルは、Rössler et al.26 から採用され、頑健性を高め、分化プロセス中の凍結保存を可能にするように修正されました。まず、10日間の分化後に造血細胞を1回だけ採取しました。その後、造血細胞を凍結保存し、分化プロセス中の柔軟性を高めました。さらに、造血細胞の播種密度を1 x 105 から2 x 105 cells/cm2 に増やし、OC分化に成功させました。より最近のヒトiPS細胞無血清培地(iPS細胞-SFM、 材料表参照)を使用し、0.1%ゼラチンの代わりに200-300μg/mLの基底膜抽出物( 材料表参照)でウェルをコーティングしました。ペニシリン/ストレプトマイシンは培地に添加しなかった。
Rösslerらによるプロトコル26は、もともとiPS細胞から造血にEB形成を使用するマクロファージ分化プロトコル28に適応したものである。EB形成は造血分化のために研究者によって長期間使用されてきましたが29,30、EB誘導のいくつかの方法は、自発的凝集、丸底ウェルプレートでの遠心分離、吊り下げドロップ培養、バイオリアクター培養、円錐管培養、ゆっくりと回転する側方血管、およびマイクロモールドゲル培養31など、文献に記載されています.このプロトコルでは、解離したiPS細胞を丸底ウェルプレートで遠心分離し、単一のiPS細胞を互いに近づけ、以下で説明するように球体(EB)の形成を可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコールは、iPS細胞をOCに鑑別するための信頼性が高く堅牢な方法を提供します。それにもかかわらず、差別化プロセス全体で遭遇する可能性のあるいくつかの落とし穴があります。異なる組織起源の細胞から作製されたヒトiPS細胞株は、このプロトコルを用いて分化することに成功している33。iPS細胞を凍結する場合(プロトコルステップ「3.凍結バックiPS細胞」)?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、Giachelli研究室のメンバーの技術的な支援とサポートに感謝します。共焦点顕微鏡と広視野顕微鏡画像の取得に協力してくださったW.M.ケック顕微鏡センターとケックセンターマネージャーのナサニアル・ピーターズ博士に感謝します。また、UW Flow Core FacilityとFlow Core FacilityマネージャーのAurelio Silvestroni氏には、技術サポートと支援をいただいたことに感謝いたします。最後に、イラストレーションとグラフィックデザインのサポートをしてくれたHannah Blümkeに感謝します。
資金は、米国国立衛生研究所の助成金R35 HL139602-01を通じて提供されました。また、W.M.ケックセンターでの機器への資金提供に対するNIH S10助成金S10 OD016240、およびUWフローコアファシリティでの機器への資金提供に対するNIH助成金1S10OD024979-01A1にも感謝します。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-10ML | |
| Antibody – Anti-Cathepsin K | Abcam | ab19027 | |
| Antibody – APC-conjugated Anti-Human CD45 | BD | 555485 | |
| Antibody – APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | |
| Antibody – BV711-conjugated Anti-Human CD14 | BD | 563372 | |
| Antibody – BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD | 563125 | |
| Antibody – Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 | Abcam | ab150079 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human CD14 | R&D Systems | FAB3832P-025 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b | R&D Systems | FAB16991P-025 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 | BD | 560710 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557872 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b | Biolegend | 301308 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl | Biolegend | 400118 | |
| Antibody – PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 550795 | |
| Antibody – PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 | BD | 563521 | |
| Bone Resorption Assay Kit | CosmoBioUSA | CSR-BRA-24KIT | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher | 16812556 | |
| Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Sytems | 3434-010-02 | Basal membrane extract |
| DAPI | R&D Systems | 5748/10 | |
| Dispase (5 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Stem Cell | 36254 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537-500ML | |
| Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) | STEMCELL Technologies | 78211 | |
| Human IL-3 | STEMCELL Technologies | 78146.1 | |
| Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) | STEMCELL Technologies | 78150.1 | |
| Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) | STEMCELL Technologies | 78214.1 | |
| Human Stem Cell Factor (hSCF) | STEMCELL Technologies | 78155.1 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | Biolegend | 422301 | |
| Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) | STEMCELL Technologies | 78073 | |
| Invitrogen Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| MEM α, nucleosides, no phenol red | ThermoFisher | 41061029 | |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 05855 | Serum free cryopreservation medium |
| mTeSR Plus medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM) |
| Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 174925 | Round bottom ultra-low attachment 96-well plate |
| P1000 Wide Bore Tips | ThermoFisher | 2079GPK | |
| ROCK-Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| StemSpan SFEM | StemCell | 09650 | Hematopoietic cell culture medium |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher | 12563011 | Single-cell dissociation reagent |
| Ultraglutamine | Bioscience Lonza | BE17-605E/U1 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Bioscience Lonza | 04-418Q | Hematopoietic basal medium |
| µ-Slide 8 Well High | Ibidi | 80806 |
References
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