幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

微生物叢(古細菌、細菌、真核生物、ウイルスなど)は、腸管関門、上皮表面、ムチン機能内の共生相互作用を通じて生理学的および病理学的プロセスに影響を与えることにより、宿主の健康を維持し、さまざまな疾患の発症に寄与する上で重要な役割を果たします^1,2,3.乳児期から若年期、成人期、老化までのさまざまなライフステージにわたる微生物叢の構成、および鼻、口腔、皮膚、腸の部位などのさまざまな場所での存在は、多様な生息地と環境によって動的に形成されます⁴。生物の腸内細菌叢は、栄養素の吸収、免疫応答、病原体の侵入、代謝調節などに関与しています^5,6。患者を対象とした研究では、腸内細菌叢の破壊が人間の肥満、睡眠障害、うつ病、炎症性腸疾患(IBD)、神経変性疾患(パーキンソン病、アルツハイマー病)、老化、およびさまざまな癌に関連していることが実証されています^7,8,9。さらに、腸内細菌叢と宿主の間の相互作用経路には、マウスと魚のモデルを使用した以前の研究で観察されたように、炎症因子、神経伝達物質、代謝物、腸バリア、および酸化ストレスが含まれます^10,11。

最近、潜在的なプロバイオティクスや糞便微生物叢移植(FMT)を含む複数の細菌関連のアプローチまたは治療法が、臨床および動物モデルでこれらの障害について調査されています。これらの調査は、微生物叢-腸-脳/肝臓/腎臓軸、微生物叢由来の産物、および受容体活性の変化に関連する発見に基づいています^12,13。しかし、微生物叢-宿主システムの発生、さまざまな機能、およびメカニズムは、微生物群集の複雑さと強力なヒト様疾患モデルの生成という課題のために、まだ完全に理解および特定されていません。

これらの問題に対処するために、無菌(GF)動物モデルが19^世紀半ばに緊急に提案され、主に20^世紀に開発されました。抗生物質処理モデルやノノトバイオティクスモデルなどのその後の改良と、微生物の検出および観察技術の進歩により、これらのモデルはさらに完成しました14,15,16。GF動物は、自身の背景を消し去り、環境微生物を避けて作られており、微生物とその宿主との相互作用を探るための優れた戦略を提供している¹⁷。動物モデルと洗練されたプロトコルの適用により、研究者はGFマウスと魚の患者に見られる同様の微生物組成を再現することに成功しました。さらに、イヌ、ニワトリ、ブタなどの他のGF動物モデルは、研究対象として多様な選択肢を提供する18,19,20,21。このアプローチにより、ヒトの癌免疫療法を含むさまざまな疾患に対する共生微生物叢の潜在的な治療効果の調査が可能になりました^16,18。GFモデルは、宿主内の特定の細菌のコロニー形成、移動、増殖、相互作用の特性とメカニズムについて、より正確な洞察を提供します。これは、微生物叢関連疾患の発生と発症に関する重要な新しい洞察を提供します^22,23。GFゼブラフィッシュを微生物研究に確立し、応用してきた歴史は、2004年のRawlsらと2006年のBatesらの報告から、2017年のMelancon et al.のプロトコルへと発展してきました16,24,25。しかし、成体または繁殖GFモデルの実現可能性は、依然として長期にわたるプロセスであり、寿命、成功率、および健康上の課題にばらつきがあります。

さまざまな動物モデルの中で、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、ヒトの臓器やゲノミクスとの有利な類似性、短い発生サイクル、高い繁殖力、および透明な胚により、基礎研究と生物医学研究の両方にとって重要なツールとして際立っています^19,26。ゼブラフィッシュは、信頼性の高いヒト疾患モデルとして機能し、生体内の生理学的および病理学的プロセスを視覚的に表現し、宿主と微生物の相互作用の魅力的な特徴に関する洞察を提供します。特に、ゼブラフィッシュは異なる細胞系譜を示し、腸の生理機能、微生物の動態、生殖腺と生殖発達、宿主の免疫系の成熟、行動、代謝のイメージングを可能にします²⁷。ゼブラフィッシュの胚は、孵化するまで保護絨毛膜内で発生し、受精後3日(dpf)で幼生になります。彼らは5 dpfで積極的に餌を探し、受精後約3か月(mpf)で性的成熟に達します²⁸。Rawlsら^によって報告された最初の無菌(GF)ゼブラフィッシュは、卵黄吸収後にオートクレーブ飼料を与えられた幼虫が8dpfからの組織壊死と20dpfで全死を示したことを示しました。これは、食事の影響、または長期(>7 dpf)GF魚²⁹を含む実験における外因性の栄養素供給を考慮することの重要性を示しました。その後の研究は、GF魚の生成プロトコルを改善し、無菌食品とさまざまな魚モデルで完成された方法を採用しました¹⁶。

しかし、GFゼブラフィッシュモデルに関するほとんどの研究は、5dpfで24時間から48時間にわたって細菌感染を含む初期ライフステージに焦点を当てており、実験^25,30,31の終わりに7dpfより前にサンプルが収集されました。ヒトやゼブラフィッシュなどの生物の微生物叢は、生命の初めにコロニーを形成し、成長と発達の過程で形成されることは広く認められています。組成は成虫の段階で安定しており、宿主における微生物叢の役割は、特に老化、神経変性、代謝関連肥満、および腸疾患の側面において、生涯を通じて重要です³。したがって、生存期間の長いGF動物からの視点は、初期生活における魚の幼生の未熟な免疫系と生殖系を考慮して、宿主器官の発生と機能における微生物の役割のメカニズムへの洞察を提供することができます。ゼブラフィッシュの腸内の細菌株は、以前の研究で単離され、同定されており、GF動物モデルに感染してプロバイオティクスを選択したり、宿主の細菌機能を研究したりする可能性があります^19,25が、GF魚類モデルの生成と応用は、主に初期のライフステージに限定されています。この制限は、複雑な生産プロセス、高い維持費、および食物と免疫に関連する問題に起因し、宿主における微生物叢の発生的および慢性的な影響を調査することを目的とした研究努力を妨げています。

魚の生存率、行動、成長、成熟、および全体的な健康状態は、特に無菌(GF)モデルでは、初期の幼虫から幼魚までの口を開けた期間中の栄養摂取と吸収を含む摂食慣行に大きく影響されます^32,33。しかし、GFの養殖における課題の1つは、適切な無菌食が不足しており、幼虫の成長と生存を維持するための栄養サポートの有効性が制限されていることです。この問題を解決することは、GF魚の発生防御機構と腸内細菌叢の欠如による消化能力の弱さを考慮すると、GF魚の生命を回復するために重要です。食物の面では、生きたブラインシュリンプ(Artemia sp.)が、口を開けた幼魚から稚魚に最も適した餌として浮上しています。生きたブラインシュリンプを与えられた魚は、調理された卵黄または他の天然および合成餌を与えられた魚と比較して、より高い成長率と生存率を示すことが観察されている³⁴。GF魚の初期の生命モデルは卵黄のサポートで生き残ることができ、GF幼虫モデルは無菌摂食で維持できますが、幼虫から幼魚までの長期モデルを生成し、性的成熟に達することは依然として困難です。さらに、フレークや粉末状の食品は、栄養組成の不均一によって制限され、水質に影響を与える可能性があります。対照的に、生きたアルテミアは、塩水と淡水の両方での生存、幼虫から成虫に適した小型、バッチ処理の容易さ、孵化品質の向上などの利点があります³⁵。以前の方法16,24,30に基づいて、複雑な処理プロセスを簡素化し、初期のGF魚よりも長期間無菌食品として容易にインキュベートできるGF生きたアルテミアsp.を確立することにより、食事の課題に対処しました。

この研究では、胚から幼生および幼魚期までの無菌(GF)ゼブラフィッシュの成長を確実にするための、(1)生成、(2)維持管理、(3)不妊率の特定、および(4)維持管理と給餌をカバーする最適化されたプロトコルを提示します。この結果は、GFゼブラフィッシュの孵化、生存、成長、および不妊性に関する予備的な証拠と、無菌食品としてのGF アルテミア sp.の重要な指標を提供します。無菌生食品のモデル生成と調製の詳細な手順は、長期的なGF魚モデルの構築と適用、および微生物叢と宿主の相互作用研究におけるGF アルテミア sp.の重要な技術サポートを提供します。このプロトコルは、GF魚類モデルでの細菌の分離、同定、および感染に対処し、細菌の蛍光標識の方法を概説し、顕微鏡下で魚の腸内でのコロニー形成を観察します。GF魚類、細菌感染したノトバイオティクス魚類、または移植されたヒト微生物叢モデルは、宿主免疫、消化、行動、トランスクリプトーム調節、および代謝面に対するそれらの機能と影響を解明するために、さまざまな検出を受けます。長期的には、このプロトコルは、海洋メダカなどのさまざまな野生型魚種に拡張することができ、場合によっては、特定の組織や疾患に関連する他の選択されたトランスジェニックゼブラフィッシュ系統にも拡張できます。