Génération, maintenance et identification de modèles de poissons-zèbres exempts de germes, des larves aux stades juvéniles

Le microbiote (c’est-à-dire les archées, les bactéries, les eucarya et les virus) joue un rôle crucial dans le maintien de la santé de l’hôte et contribue au développement de diverses maladies en influençant les processus physiologiques et pathologiques par le biais d’interactions symbiotiques au sein de la barrière intestinale, de la surface épithéliale et des fonctions de la mucine chez les individus ^1,2,3. La composition du microbiote à travers les différents stades de la vie, de la petite enfance à la jeunesse, à l’âge adulte et au vieillissement, ainsi que sa présence à divers endroits tels que les narines, la bouche, la peau et les intestins, sont façonnées de manière dynamique par divers habitats et environnements⁴. Le microbiote intestinal dans les organismes est impliqué dans l’absorption des nutriments, la réponse immunitaire, l’invasion d’agents pathogènes, la régulation métabolique, etc. ^5,6. Des études sur des patients ont démontré que les perturbations du microbiote intestinal sont liées à l’obésité humaine, aux troubles du sommeil, à la dépression, aux maladies inflammatoires de l’intestin (MICI), aux maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer), au vieillissement et à divers cancers ^7,8,9. De plus, les voies interactives entre le microbiote intestinal et les hôtes impliquent des facteurs inflammatoires, des neurotransmetteurs, des métabolites, la barrière intestinale et le stress oxydatif, comme observé dans des recherches antérieures utilisant des modèles de souris et de poissons^10,11.

Récemment, de multiples approches ou thérapies liées aux bactéries, y compris des probiotiques potentiels et la transplantation de microbiote fécal (FMT), ont été explorées pour ces troubles dans des modèles cliniques et animaux. Ces explorations sont basées sur des découvertes liées à l’axe microbiote-intestin-cerveau/foie/rein, aux produits dérivés du microbiote et à l’activité altérée des récepteurs^12,13. Cependant, le développement, les diverses fonctions et les mécanismes du système microbiote-hôte sont encore incomplètement compris et identifiés en raison de la complexité de la communauté microbienne et du défi de générer de puissants modèles de maladies semblables à celles de l’homme.

Pour résoudre ces problèmes, des modèles animaux exempts de germes (GF) ont été proposés d’urgence au milieu du 19^e siècle et principalement développés au cours du 20^e siècle. Des améliorations ultérieures, y compris des modèles traités aux antibiotiques et gnotobiotiques, ainsi que des progrès dans les technologies de détection et d’observation microbiennes, ont perfectionné ces modèles 14,15,16. Les animaux GF, créés en effaçant leur propre arrière-plan et en évitant les microbes environnementaux, offrent une excellente stratégie pour explorer les interactions entre les micro-organismes et leurs hôtes¹⁷. Grâce à l’application de modèles animaux et de protocoles affinés, les chercheurs ont réussi à reproduire des compositions microbiennes similaires trouvées chez des patients chez des souris et des poissons GF. De plus, d’autres modèles d’animaux GF, tels que les chiens, les poulets et les porcs, offrent diverses options en tant que sujets de recherche 18,19,20,21. Cette approche a permis d’étudier les effets thérapeutiques potentiels des microbiomes commensales sur diverses maladies, y compris l’immunothérapie du cancer chez l’homme^16,18. Les modèles GF offrent des informations plus précises sur les caractéristiques et les mécanismes de la colonisation, de la migration, de la multiplication et de l’interaction bactériennes spécifiques au sein des hôtes. Cela fournit de nouvelles informations cruciales sur l’apparition et le développement des maladies liées au microbiote^22,23. L’histoire de l’établissement et de l’application du poisson-zèbre GF dans la recherche microbienne a évolué depuis les rapports de Rawls et al. en 2004 et de Bates et al. en 2006 jusqu’au protocole de Melancon et al. en 2017 16,24,25. Cependant, la faisabilité de modèles de GF adultes ou reproducteurs est encore un processus prolongé, accompagné d’une longévité, de taux de réussite et de problèmes de santé variables.

Parmi les différents modèles animaux, le poisson-zèbre (Danio rerio) se distingue comme un outil essentiel pour la recherche fondamentale et biomédicale en raison de sa similitude avantageuse avec les organes humains et la génomique, de son cycle de développement court, de sa fécondité élevée et de ses embryons transparents^19,26. Les poissons-zèbres, qui servent de modèles fiables de maladies humaines, offrent une représentation visuelle des processus physiologiques et pathologiques in vivo, donnant un aperçu des caractéristiques attrayantes des interactions hôte-microbe. Notamment, les poissons-zèbres présentent des lignées cellulaires distinctes, permettant l’imagerie de la physiologie intestinale, de la dynamique microbienne, des gonades et du développement reproducteur, de la maturation du système immunitaire de l’hôte, du comportement et du^{métabolisme27}. Les embryons de poisson-zèbre se développent dans des chorions protecteurs jusqu’à l’éclosion, devenant des larves 3 jours après la fécondation (dpf). Ils chassent activement pour se nourrir à 5 dpf et atteignent la maturité sexuelle environ 3 mois après la fécondation (mpf)²⁸. Le premier poisson-zèbre sans germes (GF) réussi, rapporté par Rawls et ^al.24, a montré que les larves nourries avec de la nourriture autoclavée après absorption du vitellus présentaient une nécrose tissulaire à partir de 8 dpf et une mort totale à 20 dpf. Cela a révélé les effets de l’alimentation ou l’importance de tenir compte de l’apport exogène en nutriments dans les expériences impliquant des poissons SG à long terme (>7 dpf)²⁹. Des études ultérieures ont amélioré le protocole de génération des poissons GF, en utilisant des aliments stériles et des méthodes perfectionnées dans différents modèles de poissons¹⁶.

Cependant, la plupart des recherches sur les modèles de poissons-zèbres GF se sont concentrées sur les premiers stades de la vie, impliquant une infection bactérienne à 5 dpf pendant 24 h à 48 h, avec des échantillons collectés avant 7 dpf à la fin des expériences 25,30,31. Il est largement reconnu que le microbiote des organismes, y compris les humains et les poissons-zèbres, est colonisé au début de la vie et façonné au cours de la croissance et du développement. La composition reste stable aux stades adultes, les rôles du microbiote chez l’hôte étant cruciaux tout au long de la vie, en particulier dans les aspects du vieillissement, des maladies neurodégénératives, métaboliques et des maladies intestinales³. Ainsi, les perspectives d’animaux GF ayant une survie plus longue peuvent donner un aperçu des mécanismes des rôles microbiens dans le développement et les fonctions des organes de l’hôte, compte tenu des systèmes immunitaires et reproducteurs immatures des larves de poissons au début de la vie. Alors que des souches bactériennes dans les intestins du poisson-zèbre ont été isolées et identifiées dans des études antérieures, offrant le potentiel d’infecter des modèles animaux GF pour sélectionner des probiotiques ou rechercher les fonctions bactériennes chez l’hôte^19,25, la génération et l’application de modèles de poissons GF ont été principalement limitées aux premiers stades de la vie. Cette limitation, attribuée à la complexité du processus de production, aux coûts d’entretien élevés et aux problèmes associés à l’alimentation et à l’immunité, entrave les efforts de recherche visant à étudier les effets développementaux et chroniques du microbiote chez l’hôte.

Le taux de survie, le comportement, la croissance, la maturation et la santé globale des poissons, en particulier dans les modèles sans germes (GF), sont significativement influencés par les pratiques alimentaires, englobant l’apport nutritionnel et l’absorption pendant la période d’ouverture de la bouche, des larves précoces aux juvéniles^32,33. Cependant, l’un des défis de l’élevage des poissons GF est la rareté des régimes stériles appropriés, ce qui limite l’efficacité du soutien nutritionnel pour soutenir la croissance et la survie des larves. La résolution de ce problème est cruciale pour restaurer la vie des poissons GF, compte tenu de leurs mécanismes de défense développementaux et de leurs faibles capacités de digestion dues à l’absence de microbiome intestinal. En termes de nourriture, les artémias vivants (Artemia sp.) apparaissent comme le régime alimentaire le plus approprié pour les larves à bouche ouverte comme pour les poissons juvéniles. Il a été observé que les poissons nourris avec des artémias vivants présentent des taux de croissance et de survie plus élevés que ceux nourris avec du jaune d’œuf cuit ou d’autres appâts naturels et synthétiques³⁴. Bien que les modèles précoces de poissons GF puissent survivre avec le soutien du vitellin et que les modèles de larves GF puissent être maintenus avec une alimentation stérile, il reste difficile de générer des modèles à long terme des larves aux juvéniles et d’atteindre la maturité sexuelle. De plus, les aliments en flocons ou en poudre sont limités par une composition nutritionnelle inégale et peuvent avoir un impact sur la qualité de l’eau. En revanche, les artémias vivants présentent des avantages tels que la survie en eau salée et douce, une petite taille adaptée aux larves aux adultes, une facilité de dosage et une qualité d’éclosion supérieure³⁵. En nous appuyant sur les méthodes précédentes 16,24,30, nous avons simplifié le processus de traitement complexe et relevé le défi de l’alimentation en établissant des Artemia sp. vivants sans gluten facilement incubés comme nourriture stérile pendant de plus longues durées que les poissons sans gluten en début de vie.

Cette étude présente un protocole optimisé couvrant (1) la génération, (2) l’entretien, (3) l’identification du taux de stérileté, et (4) l’entretien et l’alimentation pour assurer la croissance du poisson-zèbre sans germes (GF) de l’embryon au stade larvaire et juvénile. Les résultats offrent des preuves préliminaires sur l’éclosion, la survie, la croissance et la stérilité du poisson-zèbre GF, ainsi que des indices essentiels pour GF Artemia sp. en tant qu’aliment stérile. Les étapes détaillées de la génération de modèles et de la préparation d’aliments vivants stériles fournissent un soutien technique crucial pour la construction et l’application de modèles à long terme de poissons GF, ainsi que GF Artemia sp. dans la recherche sur l’interaction microbiote-hôte. Le protocole aborde l’isolement, l’identification et l’infection bactériennes sur des modèles de poissons GF, en décrivant les méthodes de marquage par fluorescence bactérienne et en observant leur colonisation dans les intestins des poissons au microscope. Les poissons GF, les poissons gnotobiotiques atteints d’une infection bactérienne ou les modèles de microbiote humain transférés subiront diverses détections pour élucider leurs fonctions et leurs effets sur l’immunité de l’hôte, la digestion, le comportement, la régulation transcriptomique et les aspects métaboliques. À long terme, ce protocole peut être étendu à différentes espèces de poissons sauvages, comme le medaka marin, et potentiellement à d’autres lignées de poissons-zèbres transgéniques sélectionnées corrélées à des tissus ou à des maladies spécifiques.