Generatie, onderhoud en identificatie van kiemvrije zebravismodellen van larven tot juveniele stadia

De microbiota (d.w.z. Archaea, bacteriën, Eukarya en virussen) spelen een cruciale rol bij het handhaven van de gezondheid van de gastheer en dragen bij aan de ontwikkeling van verschillende ziekten door fysiologische en pathologische processen te beïnvloeden door middel van symbiotische interacties binnen de darmbarrière, het epitheeloppervlak en de mucinefuncties bij individuen ^1,2,3. De samenstelling van de microbiota in verschillende levensfasen, van kindertijd tot jeugd, volwassenheid en veroudering, evenals de aanwezigheid ervan op verschillende locaties zoals neusgaten, mond-, huid- en darmlocaties, wordt dynamisch gevormd door diverse habitats en omgevingen⁴. De darmmicrobiota in organismen is betrokken bij de opname van voedingsstoffen, immuunrespons, invasie van ziekteverwekkers, metabole regulatie, enz. ^5,6. Studies bij patiënten hebben aangetoond dat verstoringen in de darmmicrobiota verband houden met obesitas bij de mens, slaapstoornissen, depressie, inflammatoire darmaandoeningen (IBD), neurodegeneratieve ziekten (Parkinson, Alzheimer), veroudering en verschillende vormen van kanker ^7,8,9. Bovendien omvatten interactieve routes tussen darmmicrobiota en gastheren ontstekingsfactoren, neurotransmitters, metabolieten, darmbarrière en oxidatieve stress, zoals waargenomen in eerder onderzoek met behulp van muizen- en vismodellen^10,11.

Onlangs zijn meerdere bacteriegerelateerde benaderingen of therapieën, waaronder mogelijke probiotica en fecale microbiota-transplantatie (FMT), onderzocht voor deze aandoeningen in klinische en diermodellen. Deze verkenningen zijn gebaseerd op ontdekkingen met betrekking tot de microbiota-darm-hersenen/lever/nier-as, van microbiota afgeleide producten en veranderde receptoractiviteit ^12,13. De ontwikkeling, verschillende functies en mechanismen van het microbiota-gastheersysteem worden echter nog steeds onvolledig begrepen en geïdentificeerd vanwege de complexiteit van de microbiële gemeenschap en de uitdaging om krachtige mensachtige ziektemodellen te genereren.

Om deze problemen aan te pakken, werden in het midden van de^19e eeuw dringend kiemvrije (GF) diermodellen voorgesteld die voornamelijk in de 20e^{eeuw werden} ontwikkeld. Latere verfijningen, waaronder met antibiotica behandelde en gnotobiotische modellen, samen met vooruitgang in microbiële detectie- en observatietechnologieën, perfectioneerden deze modellen verder 14,15,16. GF-dieren, gecreëerd door hun eigen achtergrond uit te wissen en omgevingsmicroben te vermijden, bieden een uitstekende strategie voor het verkennen van de interacties tussen micro-organismen en hun gastheren¹⁷. Door de toepassing van diermodellen en verfijnde protocollen hebben onderzoekers met succes vergelijkbare microbiële samenstellingen gerepliceerd die bij patiënten in GF-muizen en vissen worden aangetroffen. Bovendien bieden andere GF-diermodellen, zoals honden, kippen en varkens, diverse opties als proefpersonen 18,19,20,21. Deze aanpak heeft onderzoek mogelijk gemaakt naar de mogelijke therapeutische effecten van commensale microbiomen op verschillende ziekten, waaronder kankerimmunotherapie bij mensen^16,18. GF-modellen bieden nauwkeuriger inzicht in de kenmerken en mechanismen van specifieke bacteriële kolonisatie, migratie, vermenigvuldiging en interactie binnen gastheren. Dit biedt cruciale nieuwe inzichten in het voorkomen en de ontwikkeling van microbiota-gerelateerde ziekten ^22,23. De geschiedenis van het vaststellen en toepassen van GF-zebravissen in microbieel onderzoek is geëvolueerd van de rapporten van Rawls et al. in 2004 en Bates et al. in 2006 tot het protocol van Melancon et al. in 2017 16,24,25. De haalbaarheid van volwassen of fokkende GF-modellen is echter nog steeds een langdurig proces, dat gepaard gaat met een variabele levensduur, slagingspercentages en gezondheidsuitdagingen.

Van de verschillende diermodellen onderscheidt de zebravis (Danio rerio) zich als een cruciaal hulpmiddel voor zowel fundamenteel als biomedisch onderzoek vanwege de voordelige gelijkenis met menselijke organen en genomica, de korte ontwikkelingscyclus, de hoge vruchtbaarheid en transparante embryo’s^19,26. Zebravissen, die dienen als betrouwbare menselijke ziektemodellen, bieden een visuele weergave van fysiologische en pathologische processen in vivo en geven inzicht in de aantrekkelijke kenmerken van gastheer-microbe-interacties. Met name zebravissen vertonen verschillende cellijnen, waardoor beeldvorming van darmfysiologie, microbiële dynamiek, geslachtsklieren en reproductieve ontwikkeling, rijping van het immuunsysteem van de gastheer, gedrag en metabolisme mogelijk^is. Zebravisembryo’s ontwikkelen zich in beschermende chorionen tot ze uitkomen en worden 3 dagen na de bevruchting (dpf) larven. Ze jagen actief op voedsel bij 5 dpf en bereiken ongeveer 3 maanden na de bevruchting (mpf) ^{geslachtsrijpheid28}. De eerste succesvolle kiemvrije (GF) zebravis, gerapporteerd door Rawls et ^al.24, toonde aan dat larven die na dooierabsorptie met geautoclaveerd voer werden gevoed, weefselnecrose vertoonden vanaf 8 dpf en totale dood bij 20 dpf. Dit gaf de effecten van voeding aan of het belang van het overwegen van exogene nutriëntenvoorziening in experimenten met langdurige (>7 dpf) GF-vissen²⁹. Latere studies verbeterden het generatieprotocol van GF-vissen, met behulp van steriel voedsel en methoden die in verschillende vismodellen waren^{geperfectioneerd16}.

Het meeste onderzoek naar GF-zebravismodellen is echter gericht op vroege levensfasen, waarbij bacteriële infectie optreedt bij 5 dpf gedurende 24 uur tot 48 uur, met monsters verzameld vóór 7 dpf aan het einde van de experimenten 25,30,31. Het wordt algemeen erkend dat de microbiota in organismen, waaronder mensen en zebravissen, aan het begin van het leven wordt gekoloniseerd en gevormd tijdens groei en ontwikkeling. De samenstelling blijft stabiel in de volwassen stadia, waarbij de rol van de microbiota in de gastheer gedurende het hele leven cruciaal is, vooral bij veroudering, neurodegeneratieve, metabole obesitas en aspecten van darmziekten^. Perspectieven van GF-dieren met een langere overleving kunnen dus inzicht geven in de mechanismen van microbiële rollen in de ontwikkeling en functies van gastheerorganen, rekening houdend met de onvolgroeide immuun- en voortplantingssystemen van vislarven in het vroege leven. Hoewel bacteriestammen in de darmen van zebravissen in eerdere studies zijn geïsoleerd en geïdentificeerd, wat het potentieel biedt voor het infecteren van GF-diermodellen om probiotica te selecteren of bacteriële functies in de gastheer te onderzoeken^19,25, zijn het genereren en toepassen van GF-vismodellen voornamelijk beperkt tot vroege levensfasen. Deze beperking, toegeschreven aan het complexe productieproces, de hoge onderhoudskosten en de daarmee samenhangende problemen met voedsel en immuniteit, belemmert onderzoeksinspanningen die gericht zijn op het onderzoeken van de ontwikkelings- en chronische effecten van microbiota in de gastheer.

Het overlevingspercentage, het gedrag, de groei, de rijping en de algehele gezondheid van vissen, vooral in kiemvrije (GF) modellen, worden aanzienlijk beïnvloed door voedingspraktijken, waaronder de inname en absorptie van voeding tijdens de mondopen-periode van vroege larven tot juvenielen ^32,33. Een van de uitdagingen bij de GF-visteelt is echter de schaarste aan geschikte steriele diëten, waardoor de effectiviteit van voedingsondersteuning voor het ondersteunen van de groei en overleving van larven wordt beperkt. Het oplossen van dit probleem is cruciaal voor het herstellen van het leven van GF-vissen, gezien hun ontwikkelingsafweermechanismen en zwakke spijsverteringsvermogen als gevolg van de afwezigheid van een darmmicrobioom. Levende artemia (Artemia sp.) komt qua voedsel naar voren als het meest geschikte dieet voor mondopen larven tot jonge vissen. Er is waargenomen dat vissen die worden gevoed met levende artemia hogere groei- en overlevingspercentages vertonen in vergelijking met vissen die worden gevoed met gekookt eigeel of ander natuurlijk en synthetisch aas³⁴. Hoewel modellen voor het vroege leven van GF-vissen kunnen overleven met dooierondersteuning en GF-larvenmodellen kunnen worden onderhouden met steriele voeding, blijft het genereren van langetermijnmodellen van larven tot juvenielen en het bereiken van geslachtsrijpheid een uitdaging. Bovendien wordt vlokken- of poedervoer beperkt door een ongelijke voedingssamenstelling en kan het de waterkwaliteit beïnvloeden. Daarentegen heeft levende Artemia voordelen zoals overleving in zowel zout als zoet water, klein formaat geschikt voor larven tot volwassenen, gemak van batching en een hogere broedkwaliteit³⁵. Voortbouwend op eerdere methoden 16,24,30, hebben we het complexe behandelingsproces vereenvoudigd en de dieetuitdaging aangepakt door gemakkelijk te incuberen GF levende Artemia sp. als steriel voedsel voor langere duur dan jonge GF-vissen.

Deze studie presenteert een geoptimaliseerd protocol dat (1) generatie, (2) onderhoud, (3) identificatie van steriele snelheid en (4) onderhoud en voeding omvat om de groei van kiemvrije (GF) zebravissen van embryo’s tot larven en juveniele stadia te garanderen. De resultaten bieden voorlopig bewijs voor het uitkomen, de overleving, de groei en de steriliteit van GF-zebravissen, samen met essentiële indices voor GF Artemia sp. als steriel voedsel. De gedetailleerde stappen in het genereren en bereiden van steriel levend voedsel bieden cruciale technische ondersteuning voor het construeren en toepassen van GF-vismodellen op lange termijn, evenals GF Artemia sp. in onderzoek naar microbiota-gastheerinteractie. Het protocol richt zich op bacteriële isolatie, identificatie en infectie op GF-vismodellen, schetst methoden voor bacteriële fluorescentie-etikettering en observeert hun kolonisatie in visdarmen onder een microscoop. GF-vissen, gnotobiotische vissen met een bacteriële infectie of overgedragen menselijke microbiota-modellen zullen verschillende detecties ondergaan om hun functies en effecten op de immuniteit, spijsvertering, gedrag, transcriptomische regulatie en metabole aspecten van de gastheer op te helderen. Op de lange termijn kan dit protocol worden uitgebreid naar verschillende wildtype vissoorten, zoals mariene medaka, en mogelijk naar andere geselecteerde transgene zebravislijnen die gecorreleerd zijn met specifieke weefsels of ziekten.