Geração, manutenção e identificação de modelos de peixe-zebra livres de germes de larvas a estágios juvenis

A microbiota (ou seja, Archaea, Bacteria, Eukarya e vírus) desempenha papéis cruciais na manutenção da saúde do hospedeiro e contribui para o desenvolvimento de várias doenças, influenciando processos fisiológicos e patológicos por meio de interações simbióticas dentro da barreira intestinal, superfície epitelial e funções de mucina em indivíduos ^1,2,3. A composição da microbiota em diferentes fases da vida, desde a infância até a juventude, idade adulta e envelhecimento, bem como sua presença em vários locais, como narinas, locais orais, cutâneos e intestinais, é moldada dinamicamente por diversos habitats e ambientes⁴. A microbiota intestinal nos organismos está envolvida na absorção de nutrientes, resposta imune, invasão de patógenos, regulação metabólica, etc ^5,6. Estudos em pacientes demonstraram que as interrupções na microbiota intestinal estão relacionadas à obesidade humana, distúrbios do sono, depressão, doença inflamatória intestinal (DII), doenças neurodegenerativas (Parkinson, Alzheimer), envelhecimento e vários tipos de câncer ^7,8,9. Além disso, as vias interativas entre a microbiota intestinal e os hospedeiros envolvem fatores inflamatórios, neurotransmissores, metabólitos, barreira intestinal e estresse oxidativo, conforme observado em pesquisas anteriores usando modelos de camundongos e peixes^10,11.

Recentemente, várias abordagens ou terapias relacionadas a bactérias, incluindo potenciais probióticos e transplante de microbiota fecal (FMT), foram exploradas para esses distúrbios em modelos clínicos e animais. Essas explorações são baseadas em descobertas relacionadas ao eixo microbiota-intestino-cérebro/fígado/rim, produtos derivados da microbiota e atividade alterada do receptor^12,13. No entanto, o desenvolvimento, várias funções e mecanismos do sistema microbiota-hospedeiro ainda são incompletamente compreendidos e identificados devido à complexidade da comunidade microbiana e ao desafio de gerar poderosos modelos de doenças semelhantes às humanas.

Para resolver essas questões, modelos animais livres de germes (GF) foram propostos com urgência em meados do^século 19 e desenvolvidos principalmente durante^{o século} 20. Refinamentos subsequentes, incluindo modelos tratados com antibióticos e gnotobióticos, juntamente com avanços nas tecnologias de detecção e observação microbiana, aperfeiçoaram ainda mais esses modelos 14,15,16. Os animais GF, criados apagando seu próprio fundo e evitando micróbios ambientais, oferecem uma excelente estratégia para explorar as interações entre microrganismos e seus hospedeiros¹⁷. Por meio da aplicação de modelos animais e protocolos refinados, os pesquisadores replicaram com sucesso composições microbianas semelhantes encontradas em pacientes em camundongos e peixes GF. Além disso, outros modelos animais de FG, como cães, galinhas e porcos, oferecem diversas opções como sujeitos de pesquisa 18,19,20,21. Essa abordagem permitiu investigações sobre os potenciais efeitos terapêuticos dos microbiomas comensais em várias doenças, incluindo a imunoterapia contra o câncer em humanos^16,18. Os modelos GF oferecem informações mais precisas sobre as características e mecanismos de colonização, migração, multiplicação e interação bacteriana específica dentro dos hospedeiros. Isso fornece novos insights cruciais sobre a ocorrência e o desenvolvimento de doenças relacionadas à microbiota^22,23. A história de estabelecimento e aplicação do peixe-zebra GF na pesquisa microbiana evoluiu dos relatórios de Rawls et al. em 2004 e Bates et al. em 2006 para o protocolo de Melancon et al. em 2017 16,24,25. No entanto, a viabilidade de modelos de FG adultos ou reprodutores ainda é um processo prolongado, acompanhado de longevidade variável, taxas de sucesso e desafios de saúde.

Dentre os vários modelos animais, o peixe-zebra (Danio rerio) destaca-se como uma ferramenta crítica para a pesquisa básica e biomédica devido à sua semelhança vantajosa com órgãos humanos e genômica, ciclo de desenvolvimento curto, alta fecundidade e embriões transparentes^19,26. O peixe-zebra, servindo como modelos confiáveis de doenças humanas, oferece uma representação visual de processos fisiológicos e patológicos in vivo, fornecendo informações sobre as características atraentes das interações hospedeiro-micróbio. Notavelmente, o peixe-zebra exibe linhagens celulares distintas, permitindo imagens da fisiologia intestinal, dinâmica microbiana, gônadas e desenvolvimento reprodutivo, maturação do sistema imunológico do hospedeiro, comportamento e metabolismo²⁷. Os embriões de peixe-zebra se desenvolvem dentro de córions protetores até a eclosão, tornando-se larvas 3 dias após a fertilização (dpf). Eles caçam ativamente por comida a 5 dpf e atingem a maturidade sexual por volta de 3 meses após a fertilização (mpf)²⁸. O primeiro peixe-zebra livre de germes (GF) bem-sucedido, relatado por Rawls et ^al.24, mostrou que larvas alimentadas com ração autoclavada após a absorção da gema exibiram necrose tecidual de 8 dpf e morte total a 20 dpf. Isso indicou os efeitos da dieta ou a importância de considerar o suprimento de nutrientes exógenos em experimentos envolvendo peixes GF de longo prazo (>7 dpf)²⁹. Estudos subsequentes aprimoraram o protocolo de geração de peixes GF, empregando alimentos estéreis e métodos aperfeiçoados em diferentes modelos de peixes¹⁶.

No entanto, a maioria das pesquisas em modelos de peixe-zebra GF tem se concentrado nos estágios iniciais da vida, envolvendo infecção bacteriana a 5 dpf por 24 h a 48 h, com amostras coletadas antes de 7 dpf na conclusão dos experimentos 25,30,31. É amplamente reconhecido que a microbiota em organismos, incluindo humanos e peixes-zebra, é colonizada no início da vida e moldada durante o crescimento e desenvolvimento. A composição permanece estável na fase adulta, sendo os papéis da microbiota no hospedeiro cruciais ao longo da vida, especialmente nos aspectos do envelhecimento, neurodegenerativos, obesidade metabólica e doenças intestinais³. Assim, as perspectivas de animais GF com maior sobrevida podem fornecer insights sobre os mecanismos dos papéis microbianos no desenvolvimento e funções dos órgãos do hospedeiro, considerando os sistemas imunológico e reprodutivo imaturos das larvas de peixes no início da vida. Embora cepas bacterianas no intestino do peixe-zebra tenham sido isoladas e identificadas em estudos anteriores, oferecendo o potencial de infectar modelos animais de GF para selecionar probióticos ou pesquisar funções bacterianas no hospedeiro^19,25, a geração e aplicação de modelos de peixes GF foram restritas principalmente aos estágios iniciais da vida. Essa limitação, atribuída ao complexo processo de produção, altos custos de manutenção e problemas associados com alimentos e imunidade, dificulta os esforços de pesquisa destinados a investigar os efeitos crônicos e de desenvolvimento da microbiota no hospedeiro.

A taxa de sobrevivência, comportamento, crescimento, maturação e saúde geral dos peixes, especialmente em modelos livres de germes (GF), são significativamente influenciados pelas práticas alimentares, abrangendo a ingestão e absorção de nutrientes durante o período de boca aberta, desde as primeiras larvas até os juvenis^32,33. No entanto, um dos desafios na piscicultura GF é a escassez de dietas estéreis adequadas, limitando a eficácia do suporte nutricional para sustentar o crescimento e a sobrevivência das larvas. Resolver esse problema é crucial para restaurar a vida dos peixes GF, considerando seus mecanismos de defesa de desenvolvimento e fracas habilidades de digestão devido à ausência de um microbioma intestinal. Em termos de alimentação, o artêmia vivo (Artemia sp.) surge como a dieta mais adequada para larvas de peixes juvenis. Observou-se que peixes alimentados com artêmia viva apresentam maiores taxas de crescimento e sobrevivência em comparação com aqueles alimentados com gema de ovo cozida ou outras iscas naturais e sintéticas³⁴. Embora os modelos de início de vida de peixes GF possam sobreviver com suporte vitelino e os modelos de larvas GF possam ser mantidos com alimentação estéril, gerar modelos de longo prazo de larvas a juvenis e atingir a maturidade sexual continua sendo um desafio. Além disso, alimentos em flocos ou em pó são limitados pela composição nutricional desigual e podem afetar a qualidade da água. Em contraste, a Artemia viva tem vantagens como sobrevivência em água salgada e doce, tamanho pequeno adequado para larvas de adultos, facilidade de dosagem e maior qualidade de eclosão³⁵. Com base em métodos anteriores 16,24,30, simplificamos o complexo processo de tratamento e abordamos o desafio da dieta, estabelecendo Artemia sp. viva GF facilmente incubada como alimento estéril por períodos mais longos do que os peixes GF no início da vida.

Este estudo apresenta um protocolo otimizado que abrange (1) geração, (2) manutenção, (3) identificação da taxa de esterilidade e (4) manutenção e alimentação para garantir o crescimento de peixes-zebra livres de germes (GF) de embriões para larvas e estágios juvenis. Os resultados oferecem evidências preliminares sobre a eclosão, sobrevivência, crescimento e esterilidade do peixe-zebra GF, juntamente com índices essenciais para GF Artemia sp. como alimento estéril. As etapas detalhadas na geração de modelos e preparação de alimentos vivos estéreis fornecem suporte técnico crucial para a construção e aplicação de modelos de peixes GF de longo prazo, bem como GF Artemia sp. na pesquisa de interação microbiota-hospedeiro. O protocolo aborda o isolamento, identificação e infecção bacteriana em modelos de peixes GF, delineando métodos para marcação de fluorescência bacteriana e observando sua colonização no intestino de peixes ao microscópio. Peixes GF, peixes gnotobióticos com infecção bacteriana ou modelos de microbiota humana transferidos serão submetidos a várias detecções para elucidar suas funções e efeitos na imunidade do hospedeiro, digestão, comportamento, regulação transcriptômica e aspectos metabólicos. A longo prazo, este protocolo pode ser estendido a diferentes espécies de peixes selvagens, como o medaka marinho, e potencialmente a outras linhagens de peixe-zebra transgênico selecionadas correlacionadas a tecidos ou doenças específicas.