Modelos tridimensionais de cultura celular para investigar a barreira epitelial na esofagite eosinofílica
Summary
Aqui, é fornecido um protocolo para a cultura de organoides esofágicos humanos e cultura de interface ar-líquido. A cultura de interface ar-líquido dos organoides esofágicos pode ser usada para estudar o impacto das citocinas na barreira epitelial esofágica.
Abstract
O epitélio escamoso do esôfago é diretamente exposto ao ambiente, enfrentando continuamente antígenos estranhos, incluindo antígenos alimentares e micróbios. Manter a integridade da barreira epitelial é fundamental para prevenir infecções e evitar a inflamação causada por antígenos inofensivos derivados de alimentos. Este artigo fornece protocolos simplificados para gerar organoides esofágicos humanos e culturas de interface ar-líquido a partir de biópsias de pacientes para estudar o compartimento epitelial do esôfago no contexto da homeostase tecidual e da doença. Esses protocolos foram marcos científicos significativos na última década, descrevendo estruturas tridimensionais semelhantes a órgãos de células primárias derivadas de pacientes, organoides e culturas de interface ar-líquido. Eles oferecem a possibilidade de investigar a função de citocinas específicas, fatores de crescimento e vias de sinalização no epitélio esofágico dentro de uma estrutura tridimensional, mantendo as propriedades fenotípicas e genéticas do doador. Os organoides fornecem informações sobre a microarquitetura tecidual, avaliando o transcriptoma e o proteoma após a estimulação de citocinas. Em contraste, as culturas de interface ar-líquido permitem a avaliação da integridade da barreira epitelial por meio de medições de resistência transepitelial (TEER) ou fluxo de macromoléculas. A combinação desses organoides e culturas de interface ar-líquido é uma ferramenta poderosa para avançar na pesquisa em condições de barreira epitelial esofágica prejudicadas.
Introduction
A inflamação esofágica compromete a integridade da barreira epitelial 1,2,3,4,5, como observado na esofagite eosinofílica (EoE), uma doença inflamatória crônica do esôfago dominada por Th26. A EoE foi descrita pela primeira vez na década de 1990 7,8 e é predominantemente induzida por antígenos alimentares 9,10,11,12,13. Os sintomas mais frequentes de EoE na população adulta são disfagia e impactação alimentar14. Em crianças, a EoE geralmente se manifesta com retardo do crescimento, recusa alimentar, vômitos e dor abdominal15. Estudos de associação genômica ampla (GWAS) identificaram genes de risco de EoE envolvidos na integridade da barreira epitelial, movendo o epitélio para o foco da pesquisa de EoE 16,17,18. A transcriptômica da EoE revelou ainda que um processo de diferenciação prejudicado e uma hiperplasia reativa da zona basal causam o comprometimento da função de barreira do epitélio esofágico 3,5,19,20,21,22. A compreensão precoce da EoE como uma doença mediada por Th26 levou à descoberta da IL-13 como um mediador determinante, perturbando a integridade epitelial3 , 4 , 21 , 23 . Sistemas experimentais que permitem a dissecação dos efeitos mediados por citocinas na integridade epitelial do comprometimento da barreira intrínseca por meio da predisposição genética fornecem a possibilidade de estudar a complexa interação entre as células imunes e o epitélio na EoE. Organoides esofágicos humanos e culturas de interface ar-líquido (LPA) têm sido propostos como ferramentas valiosas para analisar a consequência da estimulação de citocinas na integridade epitelial5.
O primeiro protocolo para geração de organoides esofágicos derivados de células-tronco específicas de tecido adulto (ASC) foi estabelecido cinco anos após os primeiros relatos publicados de organoides intestinais em 2009, usando ASCs Lgr5+ intestinais recapitulando o compartimento epitelial do intestino delgado24. DeWard et al. foram pioneiros na geração de organoides a partir de células epiteliais esofágicas murinas25. Em 2018, Kasagi et al. geraram organoides esofágicos humanos a partir da linha celular de epitélio escamoso esofágico humano imortalizada EPC2-hTERT e células primárias derivadas de pacientes26. No mesmo ano, Zhang et al. geraram com sucesso organoides esofágicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). Eles delinearam a importância da inibição do TGFβ e da proteína morfogenética óssea (BMP) para o desenvolvimento de células progenitoras esofágicas (EPC) e o papel crucial da sinalização Notch na diferenciação do epitélio escamoso estratificado26,27. Trisno e colegas complementaram essas descobertas identificando o Sox2 como um inibidor de Wnt que direciona o destino do desenvolvimento para a diferenciação esofágica28. Os refinamentos subsequentes de protocolos, composição do meio e condições de cultura aumentaram a taxa de formação de organoides e possibilitaram a subcultura e recuperação de organoides após a criopreservação 26,29,30,31,32. Embora esses organoides sejam ferramentas poderosas para estudar a arquitetura do tecido e a expressão de genes-alvo potenciais após estimulação com citocinas, os organoides esofágicos não oferecerão a possibilidade de medir a resistência transepitelial (TEER) ou o fluxo de macromoléculas como medidas diretas para a integridade da barreira. Conforme descrito anteriormente por Sherrill e colegas22, as culturas ALI que modelam a diferenciação epitelial4 permitem avaliações diretas da integridade epitelial. A combinação de organoides derivados de pacientes e culturas de LPA é uma ferramenta poderosa para investigar a arquitetura do tecido e a integridade da barreira epitelial na EoE.
Aqui estão os procedimentos com instruções para isolar células viáveis de biópsias esofágicas e estabelecer culturas de organoides esofágicos e ALI que podem ser usados para estudar os efeitos das citocinas na integridade da barreira.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os procedimentos fornecidos permitem o cultivo de organoides derivados de pacientes e culturas de LPA com altas perspectivas de sucesso. O protocolo organoide foi adaptado do primeiro protocolo publicado relatando a geração de organoides esofágicos humanos26 e de um protocolo publicado recentemente32. Sherill e colegas descreveram o modelo ALI22. Organoides e modelos de cultura de LPA auxiliam-se mutuamente no estudo do impacto de citocinas e outr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A concessão SNSF 310030_219210 para J.H.N. apoiou a publicação deste manuscrito sem restrições. A Figura 1 foi criada com a ajuda de BioRender.com.
Materials
| 1250 µL Griptip – Filter | Integra | 4445 | |
| 300 µL Griptip – Filter | Integra | 4435 | |
| 70 µM cell strainer | Sarstedt | 83.3945.070 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich (Merck) | A4544 | |
| Bovine pituitary extract | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | |
| Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures | Greiner Bio-One | 7.657 185 | |
| Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear | R&D Systems (Bio-Techne) | 3532-010-02 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade | Carl Roth | A994 | |
| Dispase I | Corning | 354235 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich (Merck) | D4693 | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich (Merck) | D8537 | |
| EVE Automated Cell Counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| EVE Cell counting slide | NanoEntek | EVS-050 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran | Sigma-Aldrich (Merck) | FD4 | average mol wt 3000-5000 |
| Heraeus – Megafuge 40R | Thermo Fisher Scientific | 75004518 | |
| Human recombinant epidermal growth factor | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Keratinocyte-SFM | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 17005042 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 15140122 | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein | R&D Systems (Bio-Techne) | 251-KG-010/CF | |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Single Channel EVOLVE 100-1000 µL | Integra | 3018 | |
| Single Channel EVOLVE 20-200 µL | Integra | 3016 | |
| Syringe 1 mL | 1134950 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich (Merck) | T9128 | |
| Trypsin-EDTA | SAFC Biosciences (Merck) | 59418C | |
| Y27632 dihydrochloride | Tocris (Bio-Techne) | 1254 |
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