Dreidimensionale Zellkulturmodelle zur Untersuchung der Epithelbarriere bei eosinophiler Ösophagitis
Summary
Hier wird ein Protokoll für die Kultivierung von humanen Ösophagus-Organoiden und Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen bereitgestellt. Die Luft-Flüssig-Grenzflächenkultur von Ösophagus-Organoiden kann verwendet werden, um den Einfluss von Zytokinen auf die Epithelbarriere der Speiseröhre zu untersuchen.
Abstract
Das Plattenepithel der Speiseröhre ist direkt der Umwelt ausgesetzt und ständig fremden Antigenen, einschließlich Lebensmittelantigenen und Mikroben, ausgesetzt. Die Aufrechterhaltung der Integrität der Epithelbarriere ist entscheidend für die Vorbeugung von Infektionen und die Vermeidung von Entzündungen, die durch harmlose Antigene aus der Nahrung verursacht werden. Dieser Artikel enthält vereinfachte Protokolle für die Generierung von humanen Organoiden der Speiseröhre und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen aus Patientenbiopsien, um das epitheliale Kompartiment der Speiseröhre im Zusammenhang mit Gewebehomöostase und -krankheit zu untersuchen. Diese Protokolle waren in den letzten zehn Jahren bedeutende wissenschaftliche Meilensteine und beschreiben dreidimensionale organähnliche Strukturen aus patientengewonnenen Primärzellen, Organoiden und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen. Sie bieten die Möglichkeit, die Funktion spezifischer Zytokine, Wachstumsfaktoren und Signalwege im Ösophagepithel in einem dreidimensionalen Rahmen unter Beibehaltung der phänotypischen und genetischen Eigenschaften des Spenders zu untersuchen. Organoide liefern Informationen über die Mikroarchitektur des Gewebes, indem sie das Transkriptom und Proteom nach Zytokinstimulation bewerten. Im Gegensatz dazu ermöglichen Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen die Beurteilung der Integrität der epithelialen Barriere durch Messungen des transepithelialen Widerstands (TEER) oder des Makromolekülflusses. Die Kombination dieser Organoide und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Forschung zu beeinträchtigten Bedingungen der epithelialen Barriere der Speiseröhre voranzutreiben.
Introduction
Eine Entzündung der Speiseröhre beeinträchtigt die Integrität der Epithelbarriere 1,2,3,4,5, wie bei der eosinophilen Ösophagitis (EoE), einer Th2-dominierten chronischen Entzündungserkrankung der Speiseröhre6, beobachtet wird. EoE wurde erstmals in den 1990er Jahren beschrieben 7,8 und wird überwiegend durch die Lebensmittelantigene 9,10,11,12,13 induziert. Die am häufigsten auftretenden Symptome von EoE in der erwachsenen Bevölkerung sind Dysphagie und Nahrungsmittelimpaktion14. Bei Kindern manifestiert sich EoE typischerweise mit Gedeihstörungen, Nahrungsverweigerung, Erbrechen und Bauchschmerzen15. Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben EoE-Risikogene identifiziert, die an der Integrität der Epithelbarriere beteiligt sind, wodurch das Epithel in den Fokus der EoE-Forschung gerücktist 16,17,18. Die EoE-Transkriptomik zeigte weiterhin, dass ein gestörter Differenzierungsprozess und eine reaktive Basalzonenhyperplasie die beeinträchtigte Barrierefunktion des Ösophagepithels verursachen 3,5,19,20,21,22. Das frühe Verständnis, dass EoE eine Th2-vermittelte Erkrankungist 6, führte zur Entdeckung von IL-13 als treibender Mediator durch Störung der epithelialen Integrität 3,4,21,23. Experimentelle Systeme, die es ermöglichen, Zytokin-vermittelte Effekte auf die Epithelintegrität von intrinsischen Barrierebeeinträchtigungen durch genetische Prädisposition zu disparieren, bieten die Möglichkeit, das komplexe Zusammenspiel zwischen Immunzellen und Epithel in EoE zu untersuchen. Humane Ösophagus-Organoide und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen (ALI) wurden als wertvolle Werkzeuge vorgeschlagen, um die Auswirkungen der Zytokinstimulation auf die epitheliale Integrität zu analysieren5.
Das erste Protokoll zur Generierung adulter gewebespezifischer Stammzellen (ASC)-abgeleiteter Ösophagus-Organoide wurde fünf Jahre nach den ersten veröffentlichten Berichten über Darmorganoide im Jahr 2009 etabliert, bei denen intestinale Lgr5+-ASCs verwendet wurden, die das Epithelkompartiment des Dünndarms rekapitulieren24. DeWard et al. leisteten Pionierarbeit bei der Erzeugung von Organoiden aus murinen Ösophagus-Epithelzellen25. Im Jahr 2018 erzeugten Kasagi et al. humane Ösophagus-Organoide aus der immortalisierten humanen Plattenepithelzelllinie EPC2-hTERT und primären patienteneigenen Zellen26. Im selben Jahr gelang es Zhang et al., aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete Organoide der Speiseröhre zu erzeugen. Sie skizzierten die Bedeutung der Hemmung von TGFβ und knochenmorphogenetischem Protein (BMP) für die Entwicklung von Vorläuferzellen der Speiseröhre (EPC) und die entscheidende Rolle des Notch-Signalwegs bei der Differenzierung des geschichteten Plattenepithels26,27. Trisno und Kollegen ergänzten diese Befunde, indem sie Sox2 als Wnt-Inhibitor identifizierten, der das Entwicklungsschicksal in Richtung Ösophagusdifferenzierung lenkt28. Die anschließende Verfeinerung der Protokolle, der Zusammensetzung des Mediums und der Kulturbedingungen erhöhte die Organoidbildungsrate und ermöglichte die Subkultivierung und Rückgewinnung von Organoiden nach der Kryokonservierung 26,29,30,31,32. Obwohl diese Organoide leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung der Gewebearchitektur und der Expression potenzieller Zielgene nach Stimulation mit Zytokinen sind, bieten Organoide der Speiseröhre nicht die Möglichkeit, den transepithelialen Widerstand (TEER) oder den Makromolekülfluss als direkte Messungen für die Barriereintegrität zu messen. Wie zuvor von Sherrill und Kollegen22 beschrieben, ermöglichen ALI-Kulturen, die die epitheliale Differenzierung4 modellieren, eine direkte Beurteilung der epithelialen Integrität. Die Kombination von patienteneigenen Organoiden und ALI-Kulturen ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Gewebearchitektur und der Integrität der Epithelbarriere bei EoE.
Hier finden Sie Verfahren mit Anweisungen zur Isolierung lebensfähiger Zellen aus Ösophagusbiopsien und zur Etablierung von Organoid- und ALI-Kulturen der Speiseröhre, die weiter verwendet werden können, um die Auswirkungen von Zytokinen auf die Integrität der Barriere zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die zur Verfügung gestellten Verfahren ermöglichen die Kultivierung von patientengewonnenen Organoiden und ALI-Kulturen mit hohen Erfolgsaussichten. Das Organoid-Protokoll wurde aus dem ersten veröffentlichten Protokoll, das über die Erzeugung humaner Ösophagus-Organoide berichtet26, und aus einem kürzlich veröffentlichten Protokoll32 angepasst. Sherill und Kollegen haben das ALI-Modell22 beschrieben. Organoide und ALI-Kulturmodelle unterstüt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das SNF-Stipendium 310030_219210 an J.H.N. unterstützte die Veröffentlichung dieses Manuskripts ohne Einschränkungen. Abbildung 1 wurde mit Hilfe von BioRender.com erstellt.
Materials
| 1250 µL Griptip – Filter | Integra | 4445 | |
| 300 µL Griptip – Filter | Integra | 4435 | |
| 70 µM cell strainer | Sarstedt | 83.3945.070 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich (Merck) | A4544 | |
| Bovine pituitary extract | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | |
| Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures | Greiner Bio-One | 7.657 185 | |
| Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear | R&D Systems (Bio-Techne) | 3532-010-02 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade | Carl Roth | A994 | |
| Dispase I | Corning | 354235 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich (Merck) | D4693 | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich (Merck) | D8537 | |
| EVE Automated Cell Counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| EVE Cell counting slide | NanoEntek | EVS-050 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran | Sigma-Aldrich (Merck) | FD4 | average mol wt 3000-5000 |
| Heraeus – Megafuge 40R | Thermo Fisher Scientific | 75004518 | |
| Human recombinant epidermal growth factor | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Keratinocyte-SFM | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 17005042 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 15140122 | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein | R&D Systems (Bio-Techne) | 251-KG-010/CF | |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Single Channel EVOLVE 100-1000 µL | Integra | 3018 | |
| Single Channel EVOLVE 20-200 µL | Integra | 3016 | |
| Syringe 1 mL | 1134950 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich (Merck) | T9128 | |
| Trypsin-EDTA | SAFC Biosciences (Merck) | 59418C | |
| Y27632 dihydrochloride | Tocris (Bio-Techne) | 1254 |
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