Modelli tridimensionali di coltura cellulare per studiare la barriera epiteliale nell'esofagite eosinofila
Summary
Qui viene fornito un protocollo per la coltura di organoidi esofagei umani e la coltura dell’interfaccia aria-liquido. La coltura dell’interfaccia aria-liquido degli organoidi esofagei può essere utilizzata per studiare l’impatto delle citochine sulla barriera epiteliale esofagea.
Abstract
L’epitelio squamoso dell’esofago è esposto direttamente all’ambiente, affrontando continuamente antigeni estranei, inclusi antigeni alimentari e microbi. Mantenere l’integrità della barriera epiteliale è fondamentale per prevenire le infezioni ed evitare l’infiammazione causata da antigeni innocui di origine alimentare. Questo articolo fornisce protocolli semplificati per la generazione di organoidi esofagei umani e colture di interfaccia aria-liquido da biopsie di pazienti per studiare il compartimento epiteliale dell’esofago nel contesto dell’omeostasi e della malattia tissutale. Questi protocolli sono stati pietre miliari scientifiche significative nell’ultimo decennio, descrivendo strutture tridimensionali simili a organi da cellule primarie derivate da pazienti, organoidi e colture di interfaccia aria-liquido. Offrono la possibilità di studiare la funzione di specifiche citochine, fattori di crescita e vie di segnalazione nell’epitelio esofageo all’interno di un quadro tridimensionale, mantenendo le proprietà fenotipiche e genetiche del donatore. Gli organoidi forniscono informazioni sulla microarchitettura tissutale valutando il trascrittoma e il proteoma dopo la stimolazione delle citochine. Al contrario, le colture di interfaccia aria-liquido consentono di valutare l’integrità della barriera epiteliale attraverso misure di resistenza transepiteliale (TEER) o di flusso di macromolecole. La combinazione di questi organoidi e colture di interfaccia aria-liquido è uno strumento potente per far progredire la ricerca in condizioni di barriera epiteliale esofagea compromessa.
Introduction
L’infiammazione esofagea compromette l’integrità della barriera epiteliale 1,2,3,4,5, come osservato nell’esofagite eosinofila (EoE), una malattia infiammatoria cronica dell’esofago6-dominata da Th2. L’EoE è stata descritta per la prima volta negli anni ’90 7,8 ed è prevalentemente indotta dagli antigeni alimentari 9,10,11,12,13. I sintomi più frequenti dell’EoE nella popolazione adulta sono la disfagia e l’occlusione alimentare14. Nei bambini, l’EoE si manifesta tipicamente con ritardo della crescita, rifiuto del cibo, vomito e dolore addominale15. Gli studi di associazione genomica-wide (GWAS) hanno identificato i geni di rischio EoE coinvolti nell’integrità della barriera epiteliale, spostando l’epitelio al centro della ricerca EoE 16,17,18. La trascrittomica EoE ha inoltre rivelato che un processo di differenziazione alterato e un’iperplasia reattiva della zona basale causano la compromissione della funzione di barriera dell’epitelio esofageo 3,5,19,20,21,22. La comprensione precoce del fatto che l’EoE è una malattia mediata da Th26 ha portato alla scoperta dell’IL-13 come mediatore guida disturbando l’integrità epiteliale 3,4,21,23. I sistemi sperimentali che consentono di dissecare gli effetti mediati dalle citochine sull’integrità epiteliale da compromissione intrinseca della barriera attraverso la predisposizione genetica forniscono la possibilità di studiare la complessa interazione tra le cellule immunitarie e l’epitelio nell’EoE. Gli organoidi esofagei umani e le colture di interfaccia aria-liquido (ALI) sono stati proposti come strumenti validi per analizzare le conseguenze della stimolazione delle citochine sull’integrità epiteliale5.
Il primo protocollo per la generazione di organoidi esofagei derivati da cellule staminali tessuto-specifiche (ASC) adulte è stato stabilito cinque anni dopo i primi rapporti pubblicati di organoidi intestinali nel 2009 utilizzando ASC intestinali Lgr5+ che ricapitolano il compartimento epiteliale dell’intestino tenue24. DeWard et al. sono stati i pionieri della generazione di organoidi da cellule epiteliali esofagee murine25. Nel 2018, Kasagi et al. hanno generato organoidi esofagei umani dalla linea cellulare di epitelio squamoso esofageo umano immortalizzato EPC2-hTERT e da cellule primarie derivate da pazienti26. Nello stesso anno, Zhang et al. hanno generato con successo organoidi esofagei derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Hanno delineato il significato dell’inibizione del TGFβ e della proteina morfogenetica ossea (BMP) per lo sviluppo delle cellule progenitrici esofagee (EPC) e il ruolo cruciale della segnalazione di Notch nella differenziazione dell’epitelio squamoso stratificato26,27. Trisno e colleghi hanno integrato questi risultati identificando Sox2 come un inibitore di Wnt che dirige il destino dello sviluppo verso la differenziazione esofagea28. I successivi perfezionamenti dei protocolli, della composizione del terreno e delle condizioni di coltura hanno aumentato il tasso di formazione degli organoidi e hanno reso possibile la subcoltura e il recupero degli organoidi dopo la crioconservazione 26,29,30,31,32. Sebbene questi organoidi siano potenti strumenti per studiare l’architettura tissutale e l’espressione di potenziali geni bersaglio dopo la stimolazione con citochine, gli organoidi esofagei non offrono la possibilità di misurare la resistenza transepiteliale (TEER) o il flusso di macromolecole come misure dirette per l’integrità della barriera. Come precedentemente descritto da Sherrill e colleghi22, le colture ALI che modellano la differenziazione epiteliale4 consentono valutazioni dirette dell’integrità epiteliale. La combinazione di organoidi derivati da pazienti e colture di ALI è un potente strumento per studiare l’architettura dei tessuti e l’integrità della barriera epiteliale nell’EoE.
Di seguito sono riportate le procedure con le istruzioni per isolare le cellule vitali dalle biopsie esofagee e stabilire colture di organoidi esofagei e ALI che possono essere ulteriormente utilizzate per studiare gli effetti delle citochine sull’integrità della barriera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le procedure fornite consentono la coltivazione di organoidi derivati da pazienti e colture di ALI con elevate prospettive di successo. Il protocollo degli organoidi è stato adattato dal primo protocollo pubblicato che riporta la generazione di organoidi esofagei umani26 e da un protocollo32 pubblicato di recente. Sherill e colleghi hanno descritto il modello ALI22. Gli organoidi e i modelli di coltura ALI si assistono a vicenda nello studio dell’im…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La sovvenzione del FNS 310030_219210 a J.H.N. ha sostenuto la pubblicazione di questo manoscritto senza restrizioni. La Figura 1 è stata creata con l’aiuto di BioRender.com.
Materials
| 1250 µL Griptip – Filter | Integra | 4445 | |
| 300 µL Griptip – Filter | Integra | 4435 | |
| 70 µM cell strainer | Sarstedt | 83.3945.070 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich (Merck) | A4544 | |
| Bovine pituitary extract | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | |
| Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures | Greiner Bio-One | 7.657 185 | |
| Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear | R&D Systems (Bio-Techne) | 3532-010-02 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade | Carl Roth | A994 | |
| Dispase I | Corning | 354235 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich (Merck) | D4693 | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich (Merck) | D8537 | |
| EVE Automated Cell Counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| EVE Cell counting slide | NanoEntek | EVS-050 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran | Sigma-Aldrich (Merck) | FD4 | average mol wt 3000-5000 |
| Heraeus – Megafuge 40R | Thermo Fisher Scientific | 75004518 | |
| Human recombinant epidermal growth factor | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Keratinocyte-SFM | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 17005042 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 15140122 | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein | R&D Systems (Bio-Techne) | 251-KG-010/CF | |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Single Channel EVOLVE 100-1000 µL | Integra | 3018 | |
| Single Channel EVOLVE 20-200 µL | Integra | 3016 | |
| Syringe 1 mL | 1134950 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich (Merck) | T9128 | |
| Trypsin-EDTA | SAFC Biosciences (Merck) | 59418C | |
| Y27632 dihydrochloride | Tocris (Bio-Techne) | 1254 |
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