Summary

Modelos de cultivo celular tridimensional para investigar la barrera epitelial en la esofagitis eosinofílica

Published: May 10, 2024
doi:

Summary

Aquí, se proporciona un protocolo para el cultivo de organoides esofágicos humanos y el cultivo de interfaz aire-líquido. El cultivo de la interfaz aire-líquido de los organoides esofágicos se puede utilizar para estudiar el impacto de las citocinas en la barrera epitelial esofágica.

Abstract

El epitelio escamoso del esófago está expuesto directamente al medio ambiente, enfrentándose continuamente a antígenos extraños, incluidos antígenos alimentarios y microbios. Mantener la integridad de la barrera epitelial es fundamental para prevenir infecciones y evitar la inflamación causada por antígenos inofensivos derivados de los alimentos. Este artículo proporciona protocolos simplificados para generar organoides esofágicos humanos y cultivos de interfaz aire-líquido a partir de biopsias de pacientes para estudiar el compartimento epitelial del esófago en el contexto de la homeostasis tisular y la enfermedad. Estos protocolos han sido hitos científicos importantes en la última década, ya que describen estructuras tridimensionales similares a órganos a partir de células primarias derivadas de pacientes, organoides y cultivos de interfaz aire-líquido. Ofrecen la posibilidad de investigar la función de citocinas específicas, factores de crecimiento y vías de señalización en el epitelio esofágico dentro de un marco tridimensional, manteniendo las propiedades fenotípicas y genéticas del donante. Los organoides proporcionan información sobre la microarquitectura de los tejidos mediante la evaluación del transcriptoma y el proteoma después de la estimulación de citocinas. Por el contrario, los cultivos de interfaz aire-líquido permiten evaluar la integridad de la barrera epitelial a través de la resistencia transepitelial (TEER) o mediciones de flujo de macromoléculas. La combinación de estos organoides y los cultivos de interfaz aire-líquido es una herramienta poderosa para avanzar en la investigación en condiciones de barrera epitelial esofágica deteriorada.

Introduction

La inflamación esofágica compromete la integridad de la barrera epitelial 1,2,3,4,5, como se observa en la esofagitis eosinofílica (EoE), una enfermedad inflamatoria crónica del esófago dominada por Th26. La EoE se describió por primera vez en la década de 1990 7,8 y es inducida predominantemente por antígenos alimentarios 9,10,11,12,13. Los síntomas más frecuentes de la EoE en la población adulta son la disfagia y la impactación alimentaria14. En los niños, la EoE se manifiesta típicamente con retraso del crecimiento, rechazo de alimentos, vómitos y dolor abdominal15. Los estudios de asociación del genoma completo (GWAS, por sus siglas en inglés) han identificado genes de riesgo de EoE involucrados en la integridad de la barrera epitelial, lo que ha llevado al epitelio al foco de la investigación de EoE 16,17,18. La transcriptómica de EoE reveló además que un proceso de diferenciación alterado y una hiperplasia reactiva de la zona basal causan el compromiso de la función barrera del epitelio esofágico 3,5,19,20,21,22. La comprensión temprana de que la EoE esuna enfermedad mediada por Th2 6 condujo al descubrimiento de la IL-13 como mediador impulsor al perturbar la integridad epitelial 3,4,21,23. Los sistemas experimentales que permiten la disección de los efectos mediados por citocinas sobre la integridad epitelial a partir del deterioro de la barrera intrínseca a través de la predisposición genética brindan la posibilidad de estudiar la compleja interacción entre las células inmunitarias y el epitelio en EoE. Los organoides esofágicos humanos y los cultivos de interfaz aire-líquido (ALI) han sido propuestos como herramientas valiosas para analizar las consecuencias de la estimulación de citocinas sobre la integridad epitelial5.

El primer protocolo para generar organoides esofágicos derivados de células madre específicas de tejido adulto (ASC) se estableció cinco años después de los primeros informes publicados de organoides intestinales en 2009 utilizando ASC intestinales Lgr5+ que recapitulan el compartimento epitelial del intestino delgado24. DeWard et al. fueron pioneros en la generación de organoides a partir de células epiteliales esofágicas murinas25. En 2018, Kasagi et al. generaron organoides esofágicos humanos a partir de la línea celular inmortalizada de epitelio escamoso esofágico humano EPC2-hTERT y células primarias derivadas de pacientes26. En el mismo año, Zhang et al. generaron con éxito organoides esofágicos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Delinearon la importancia de la inhibición de TGFβ y de la proteína morfogenética ósea (BMP) para el desarrollo de células progenitoras esofágicas (EPC) y el papel crucial de la señalización de Notch en la diferenciación del epitelio escamoso estratificado26,27. Trisno y sus colegas complementaron estos hallazgos identificando a Sox2 como un inhibidor de Wnt que dirige el destino del desarrollo hacia la diferenciación esofágica28. Los posteriores refinamientos de los protocolos, la composición del medio y las condiciones de cultivo aumentaron la tasa de formación de organoides e hicieron posible el subcultivo y la recuperación de organoides después de la criopreservación 26,29,30,31,32. Aunque estos organoides son herramientas poderosas para estudiar la arquitectura de los tejidos y la expresión de posibles genes diana después de la estimulación con citocinas, los organoides esofágicos no ofrecerán la posibilidad de medir la resistencia transepitelial (TEER) o el flujo de macromoléculas como medidas directas para la integridad de la barrera. Como se describió previamente por Sherrill y colaboradores22, los cultivos ALI que modelan la diferenciación epitelial4 permiten evaluaciones directas de la integridad epitelial. La combinación de organoides derivados de pacientes y cultivos de ALI es una herramienta poderosa para investigar la arquitectura de los tejidos y la integridad de la barrera epitelial en la EoE.

A continuación, se presentan procedimientos con instrucciones para aislar células viables de biopsias esofágicas y establecer cultivos de organoides esofágicos y ALI que se pueden utilizar para estudiar los efectos de las citocinas en la integridad de la barrera.

Protocol

Los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de Suiza Noroeste y Central (EKNZ; ID del proyecto: 2019-00273). Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para el uso experimental de biopsias antes del examen endoscópico. Los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales. 1. Aislamiento celular de organoides esofágicos derivados de pacientes NOTA: En la Tabla 1 se proporciona una lista de los constituyentes del medio para el cultivo de organoides esofágicos humanos. Obtener las biopsias.NOTA: En el presente estudio, se obtienen dos biopsias de un segmento de esófago durante la esofagogastroduodenoscopia con pinzas de biopsia utilizando un gastroscopio con un canal de trabajo de 2,8 mm. Transfiera las biopsias a un medio libre de suero de queratinocitos disponible comercialmente (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL de FEAG, 50 μg/mL de BPE).NOTA: Las biopsias se pueden almacenar en hielo durante varias horas hasta su uso. Sustituya el medio KSFM por 1 mL de dispasa I (10 U/mL) e incube las biopsias durante 10 min a temperatura ambiente. Centrifugar las biopsias a temperatura ambiente a 300 x g durante 2 min. Aspire la dispasa con una pipeta de 1000 μL sin tocar las biopsias ni la pastilla de restos celulares. Enjuague las biopsias con 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco. Centrifugar las biopsias a temperatura ambiente a 300 x g durante 2 min. Aspire el sobrenadante con una pipeta de 1000 μL. Incubar las biopsias con 500 μL de tripsina-EDTA (0,05%) a 37 °C durante 10 min mientras se agita a 800 rpm. Realice la interrupción mecánica mediante el pipeteo repetido hacia arriba y hacia abajo hasta obtener una suspensión de una sola celda. Filtre las células a través de un filtro de células de 70 μm utilizando el cabezal de émbolo de goma de una jeringa de tuberculina. Lavar el colador con 2-4 mL de inhibidor de tripsina de soja (250 μg/mL). Filtre las células a través de un colador de células de 35 μm con un tapón a presión en un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml. Transfiera la solución unicelular a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire el sobrenadante con una pipeta de 1000 μL. Vuelva a suspender las células en 100 μL de medio KSFM. Mezclar 10 μL de azul de tripano con 10 μL de suspensión celular. Cuente las celdas usando un contador de celdas automatizado. 2. Cultivo de organoides derivado del paciente Agregue 1-2 mL de KSFM a la suspensión celular después de contar. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire el sobrenadante con una pipeta de 1000 μL sin alterar el gránulo de celdas. Resuspender el pellet celular en la matriz de hidrogel de extracto de membrana basal (BME) (40 μL de BME por cada 20.000 células).NOTA: Después de agregar el BME, mantenga las células en hielo para evitar la solidificación prematura del BME. Corte una punta de pipeta de 200 μL para aspirar la mezcla viscosa de suspensión BME-cell. Forma gotas de 40 μL en una placa de cultivo celular en suspensión precalentada (37 °C). Incubar la placa sin medio durante 20-30 min a 37 °C para asegurar la solidificación de las gotas de BME. Añadir medio KSFM-C precalentado suplementado con 10 μM de Y27632 (inhibidor de ROCK) durante los dos primeros días de cultivo. Reemplace el medio con un nuevo medio KSFM-C (sin Y27632 y +/- citocina de interés) cada dos días. Aspire el medio y rasque las gotas con la punta de la pipeta mientras agrega continuamente 1 mL de Dispasa II (1.5 U/mL) al pocillo. Transfiera la mezcla de BME y dispasa a un tubo de centrífuga de 15 mL e incube durante 20 min a 37 °C en un baño de agua agitable para digerir el BME. Centrifugar a 250 x g durante 3 min a 4 °C y aspirar la Dispasa II. Proceda de acuerdo con el protocolo de la lectura de interés (p. ej., aislamiento de ARN, aislamiento de proteínas o fijación con PFA al 4% para histología). 3. Aislamiento celular para cultivos de interfaz aire-líquido (ALI) derivados del paciente Obtener las biopsias. Durante la esofagogastroduodenoscopia con un gastroscopio con un canal de trabajo de 2,8 mm, se toman dos biopsias de un segmento de esófago con pinzas de biopsia. Colocar las biopsias en un medio libre de suero de queratinocitos disponible comercialmente (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) y almacenar en hielo durante varias horas hasta su uso. Intercambie KSFM con 1 mL de dispasa (10 U/mL). Después, incubar las biopsias durante 10 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar las biopsias a temperatura ambiente a 300 x g durante 2 min. Retire la dispasa con una pipeta de 1000 μL sin tocar las biopsias ni la pastilla de restos celulares. Lave las biopsias con 1 mL de DPBS. A temperatura ambiente, centrifugar las biopsias a 300 x g durante 2 minutos. Aspire el sobrenadante con una pipeta de 1000 μL. Incubar las biopsias en 500 μL de tripsina-EDTA (0,05%) a 37 °C durante 10 min y mezclar continuamente a 800 rpm durante la incubación. Interrumpa las biopsias mecánicamente con pipeteo repetido hacia arriba y hacia abajo hasta obtener una suspensión de una sola célula. Pase las células disociadas a través de un filtro de células de 70 μm con una cabeza de émbolo de goma de una jeringa de tuberculina y recoja las células en un tubo cónico de 50 mL. Lave el colador con 2-4 mL de inhibidor de tripsina de soja (250 μg/mL) para eliminar las células restantes del colador. Filtre las células con un tapón de filtro de células de 35 μm en un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Retire el sobrenadante con una pipeta de 1.000 μL. Vuelva a suspender el pellet celular en 4 mL de medio KSFM (Ca2+ 0,09 mM), incluyendo 10 μM Y27632. Transfiera las células a un matraz de cultivo celular T25. Para expandir los queratinocitos primarios, cultive las células hasta una confluencia del 60%-80% durante aproximadamente 1 semana.NOTA: El pasaje (P)0 forma conglomerados celulares en forma de islotes y no es una monocapa. Los queratinocitos primarios forman monocapas a partir de P1. Paso a 60%-80% de confluencia y resiembra de P1 en 2-3 matraces de cultivo celular T25 o 1-2 T75. Vuelve a pasar P1 cuando los queratinocitos forman una monocapa con una confluencia del 60%-80%. 4. Cultivo de interfaz aire-líquido (ALI) derivado del paciente Siembre queratinocitos primarios P2 en insertos transwell para el cultivo de ALI.NOTA: Siembra 400.000 células en 12 pocillos (200.000 queratinocitos por 0,6cm2) en 500 μL de KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL de EGF, 50 μg/mL de BPE).Siembra 150.000 células en 24 pocillos (155.000 queratinocitos por 0,5cm2) en 100 μL de KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE). Alternativamente, congele en el medio KSFM (Ca2 + 0,09 mM + 10% DMSO) a -80 °C durante 24 h y luego transfiera las células congeladas a nitrógeno líquido para su uso posterior.NOTA: Cuando utilice viales congelados, vuelva a pasar después de descongelar antes de utilizar las células para el cultivo de ALI. Agregue medio al pocillo inferior debajo del inserto de la placa de cultivo transwell.NOTA: Para placas de 12 pocillos: 1,5 mL de KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL de EGF, 50 μg/mL de BPE). Para 24 placas de pocillos: 600 μL de KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL de EGF, 50 μg/mL de BPE). Reemplace el KSFM de calcio medio a alto (Ca2+ 1.8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) después de 2 días. Cambie el medio KSFM con alto contenido de calcio cada dos días hasta el día 7. Realice el transporte aéreo el día 7 aspirando el medio desde la cámara superior y reemplazando el medio en la cámara inferior con KSFM con alto contenido de calcio (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) que contiene 10 ng/mL KGF (=FGF7), 75 μg/mL de ácido ascórbico (AA).Opcional: Añada al medio la citocina de interés a la concentración deseada. Cambie el medio cada dos días hasta el día 14. 5. Medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) Esterilice el electrodo del medidor TEER sumergiéndolo en un pocillo de una placa de 24 pocillos con hipoclorito de sodio al 5% durante 10-15 min. Lave el hipoclorito de sodio al 5% sumergiendo el electrodo en 4 pocillos secuenciales con ddH2O estéril y dejando que el electrodo se seque al aire. Fije el blanco colocando un electrodo en el pocillo y el segundo electrodo en el inserto transpocillo, llenándolo con PBS y midiendo el TEER.NOTA: Volúmenes recomendados para las mediciones de TEER: Para placa de 12 pocillos (1900 μL en el pocillo y 900 μL en el inserto). Para placa de 24 pocillos (750-1000 μL en el pocillo y 250 μL en el inserto). Reemplace el medio de los cultivos ALI con PBS estéril a temperatura ambiente.NOTA: Retire el medio del pocillo inferior y, en un segundo paso, del inserto transpocillo. Del mismo modo, agregue PBS primero al inserto y luego al pocillo inferior para evitar el desprendimiento del cultivo de ALI de la membrana transpocillo. Coloque los electrodos del medidor de TEER en los pozos experimentales con cultivos de ALI y realice la medición de TEER1.NOTA: Realice mediciones de TEER cada dos días antes de cambiar el medio. 6. Flujo macromolecular Diluir la solución madre de FITC-Dextrano (3-5 kDa) hasta una concentración de trabajo de 1 mg/mL.NOTA: Proteja siempre el FITC-Dextrano de la exposición a la luz. Prepare una fila de dilución con una concentración decreciente de FITC (1000 μg/mL a 0,25 μg/mL) como estándar para la lectura. Añada 500 μL de solución de FITC-dextrano (1 mg/mL) a la cámara superior del transpocillo y 1,5 mL de medio (+/- citocina de interés) en el compartimento inferior y coloque la placa en la incubadora. Recoja 120 μL de medio del compartimento inferior en los puntos de tiempo respectivos (por ejemplo, 0 min, 15 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min y 180 min). Pipetea duplicados (50 μL/pocillo) de cada punto de tiempo en una placa negra de fondo plano transparente de 96 pocillos. Excite el FITC-dextrano a 490 nm y lea la emisión a una longitud de onda de 520 nm utilizando un lector de placas. Calcule la cantidad de flujo macromolecular de acuerdo con el estándar.

Representative Results

Los organoides esofágicos crecerán a partir de células primarias extraídas de biopsias de pacientes de acuerdo con las instrucciones del protocolo proporcionado, según lo documentado con un microscopio de campo claro invertido (Figura 1). Las ASC epiteliales comienzan a formar grupos de células de manera autoorganizada dentro de los primeros dos días de cultivo después de sembrar las células aisladas en el extracto de membrana basal, que sirve como andamio. El tamaño y el número d…

Discussion

Los procedimientos proporcionados permiten el cultivo de organoides derivados de pacientes y cultivos de ALI con altas perspectivas de éxito. El protocolo de organoides ha sido adaptado del primer protocolo publicado que informa de la generación de organoides esofágicos humanos26 y de un protocolo recientemente publicado32. Sherill y sus colegas han descrito el modelo ALI22. Los organoides y los modelos de cultivo de ALI se ayudan mutuamente en el…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La subvención 310030_219210 de la SNSF a J.H.N. apoyó la publicación de este manuscrito sin restricciones. La figura 1 se ha creado con la ayuda de BioRender.com.

Materials

1250 µL Griptip – Filter Integra 4445
300 µL Griptip – Filter Integra 4435
70 µM cell strainer Sarstedt 83.3945.070
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich (Merck) A4544
Bovine pituitary extract Gibco (Thermo Fischer Scientific) 3700015
Calcium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures Greiner Bio-One 7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear R&D Systems (Bio-Techne) 3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade Carl Roth A994
Dispase I Corning 354235
Dispase II Sigma-Aldrich (Merck) D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS) Sigma-Aldrich (Merck) D8537
EVE Automated Cell Counter NanoEntek EVE-MC
EVE Cell counting slide NanoEntek EVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Falcon 352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran Sigma-Aldrich (Merck) FD4 average mol wt 3000-5000
Heraeus – Megafuge  40R  Thermo Fisher Scientific 75004518
Human recombinant epidermal growth factor Gibco (Thermo Fischer Scientific) 3700015
Keratinocyte-SFM Gibco (Thermo Fischer Scientific) 17005042
Penicillin-Streptomycin Gibco (Thermo Fischer Scientific) 15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein R&D Systems (Bio-Techne) 251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL  Integra 3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL  Integra 3016
Syringe 1 mL 1134950
ThermoMixer C Eppendorf 5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) Sigma-Aldrich (Merck) T9128
Trypsin-EDTA SAFC Biosciences (Merck) 59418C
Y27632 dihydrochloride Tocris (Bio-Techne) 1254

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Kaymak, T., Niess, J. H. Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis . J. Vis. Exp. (207), e66503, doi:10.3791/66503 (2024).

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